一種肝癌起始細胞及其分離方法與應用的製作方法

2023-08-07 04:48:16

專利名稱：一種肝癌起始細胞及其分離方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞生物學技術領域，具體涉及ー種從肝癌細胞系和原代肝癌標本中獲得肝癌起始 細胞的方法，及其該肝癌起始細胞的應用。
背景技術：
在幹細胞和腫瘤生物學的眾多進展中，腫瘤起始細胞(tumor-initiating cells)理論逐漸引起越來越多的重視。越來越多的研究證據表明，在許多實體腫瘤的發生和進展中存在具有自我更新能力的腫瘤起始細胞(參見文獻Jordan CT, Guzman ML, NobleM. Cancer stem cells. N Engl J Med. Sep 212006 ;355 (12) : 1253-1261.)。這些細胞具有自我更新能力，與腫瘤的維持和腫瘤對常規抗腫瘤療法耐受有著密切的聯繫。近年來的研究還發現，腫瘤起始細胞不僅與腫瘤的起始和進展相關，在腫瘤的侵襲和轉移中，腫瘤起始細胞同樣發揮著至關重要的作用(參見文獻Diehn M, Majeti R. Metastatic cancerstem ceils :an opportunity ior improving cancer treatment : Cell btem しell. Jun4 2010 ；6(6) :502-503.)。大多數肝細胞癌都是由慢性病毒性肝炎或其他肝臟疾病引起的肝硬化或硬化前疾病發展而來，長期以來，成熟肝細胞中基因異常突變的累計被認為是腫瘤發生中的關鍵事件。但隨著肝幹細胞生物學的進展，人們認為在肝細胞癌中也存在著腫瘤起始細胞，並且他們與肝癌的發生密切相關(參見文獻Yin S，Li J, Hu C，et al.⑶133 positivehepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity.Int J Cancer. Apr 12007 ；120(7) :1444-1450. ；Chiba T，Zheng YW，Kita K，etal. Enhanced self-renewal capability in hepatic stem/progenitor cells drivescancer initiation. Gastroenterology. Sep 2007 ； 133 (3) :937-950. ；Ma S，Tang KH,Chan YP, et al. miR-130b Promotes CD133(+)liver tumor-initiating cell growthand self-renewal via tumor protein 53—induced nuclear protein I.Cell StemCell.Dec 3 2010 ；7 (6) :694-707. ；Yamashita T，Ji J，Budhu A，et al. EpCAM-positivehepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitorcell features. Gastroenterology. Mar 2009 ；136 (3) :1012-1024)0由於肝癌起始細胞在肝癌的發生、發展中發揮著重要的作用，因此，對肝癌起始細胞標誌物和特性的研究具有重要的意義。肝癌起始細胞具有更高的自我更新能力、成瘤性、對化療藥物的耐受性，被認為是肝癌復發和轉移的重要來源。因此，通過研究肝癌起始細胞的標誌物、分離方法和特性，並將所得到的肝癌起始細胞用於肝癌預後分析和抗腫瘤藥物的篩選和製備，有助於進一歩理解肝癌發、發展的過程，進而開發出靶向肝癌起始細胞的有效治療方法。中國專利CN200510030081. O公開了ー種肝癌幹細胞及其分離方法。0V6抗體是肝臟幹細胞研究領域中廣泛用於檢測大鼠或人肝前體細胞的ー種in {φ ( # JAL AV Kofman, G Morgan, et ai. Dose_and time-dependent oval cel 丄reaction in acetaminophen-induced murine liver injury. Hepatology. 2005Jun ；41 (6) :1252-61. Carloni GiPonzetto A et al. Liver stem cells and possible clinicalapplications. Curr Stem Cell Res Ther. 2010Dec ；5 (4) :314-25.)，由 R&D 公司生產(MAB0202)，是ー種肝幹/前體細胞標誌物，但至今未有文獻報導將0V6抗體用於檢測、分選人肝細胞癌肝癌起始細胞 並研究其特性和用途。

發明內容
本發明的目的在於提供ー種肝癌起始細胞，本發明的另ー目的是提供該肝癌起始細胞的分離方法，本發明的另ー目的是提供該肝癌起始細胞的應用。本發明的ー個方面，提供了一種從肝癌細胞系和人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，它包括步驟(a)將0V6單克隆抗體與含有肝癌起始細胞的肝癌細胞系混合，形成「0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞」複合物；(b)離心去除未結合的0V6單克隆抗體，形成「 0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞」複合物沉澱，並與磁珠標記的抗小鼠IgGl第二抗體孵育，形成「0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞-肝癌起始細胞」複合物；(C)通過磁場分離步驟(b)形成的複合物，從而獲得肝癌起始細胞。本發明所稱的肝癌細胞系是人肝癌細胞系，包括但不限於SMMC7721、Huh7、!fepG2、HCC-LM3。本發明所稱的0V6單克隆抗體，購自R&D公司。本發明所稱的磁珠分選系統是本領域技術人員所熟知的(參見工具書《幹細胞實驗指南》，科學出版社，2006年I月)。在另ー優選例中，還提供了一種從人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，它包括步驟(a)將0V6單克隆抗體與從原代肝癌標本中分離的肝癌細胞混合，形成「0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞」複合物；(b)離心去除未結合的0V6單克隆抗體，形成「 0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞」複合物沉澱，並與磁珠標記的抗小鼠IgGl第二抗體孵育，形成「0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞-肝癌起始細胞」複合物；(c)通過磁場分離步驟(b)形成的複合物，從而獲得肝癌起始細胞。在本發明的另一方面，提供了ー種從上述的分離方法獲得的肝癌起始細胞，在體外具有更強的自我更新能力，在體內具有更強的成瘤能力，具有更強的遷移和侵襲、轉移能力。在本發明的另一方面，提供了本發明的肝癌起始細胞在製備肝癌預後診斷試劑或試劑盒中的應用。 還提供了本發明的肝癌起始細胞在篩選抗肝癌藥物中的應用。所述的抗肝癌藥物具體為肝癌起始細胞抑制劑，篩選方法包括以下步驟(a)將候選的肝癌起始細胞抑制劑加入肝癌起始細胞培養體系中，並檢測肝癌起始細胞功能特性；
(b)將步驟(a)中測試組中肝癌起始細胞功能特性與對照組比較，如果測試組功能特性指標在統計學上低於對照組，則表明該候選物為抑制肝癌起始細胞的化合物。本發明分離得到的0V6+肝癌起始細胞既有幹細胞特性和自我更新能力，又具有更強的成瘤性。另ー方面，本發明分離得到的0V6+肝癌起始細具有很強的遷移、轉移能力。根據以上所述顯示，本發明分離得到的0V6+肝癌起始細胞既可以用於抗腫瘤藥物的篩選和製備，也可以用於肝癌預後分析。


圖I是利用免疫磁珠分選技術,結合0V6抗體從肝癌細胞系中分選出0V6+肝癌幹細胞後，用流式細胞儀檢測的0V6+細胞的純度；其中A為分選前SMMC7721細胞，0V6陽性細胞比例為I. 63%，B為分選後獲得的SMMC77210V6+細胞，陽性率為97. 65%。圖2是在體外培養的肝癌細胞系中，0V6抗體所識別的0V6+肝癌幹細胞具有更強的自我更新能力(在低粘附培養板中形成微球是幹細胞自我更新能力的體現)；其中A為代表性的腫瘤球照片，B為每1000個0V6+或0V6-細胞形成的腫瘤球數量。圖3是在體外培養的肝癌細胞系中，0V6抗體所識別的0V6+肝癌幹細胞具有更強的體外侵襲能力；其中A為Transwell遷移實驗(左側為顯微鏡下代表圖片，右側為計數結果)，B為Matrigel侵襲實驗(左側為顯微鏡下代表圖片，右側為計數結果)。圖4是從在體外培養的肝癌細胞系中分選的0V6+肝癌幹細胞具有更強的體內轉移能力，經過免疫磁珠分選出的0V6+和0V6-細胞經尾靜脈注射於NOD-SCID鼠體內，八周後觀察小鼠肺內轉移情況，發現無論是肉眼可見癌結節，還是鏡下觀察到的微轉移灶，0V6+細胞注射組均高於0V6-細胞組。圖5是0V6抗體可通過免疫組織化學的方法檢測人肝細胞癌標本中0V6+肝癌幹細胞表達情況，根據陽性細胞比例，肝癌標本可分為陰性，弱陽性，中等強度陽性，強陽性四組。圖6是0V6抗體所識別的0V6+肝癌幹細胞的數量越多，肝癌患者的無病生存時間(左圖)和總生存時間(右圖)越短。圖7是AMD3100對0V6+肝癌起始細胞具有抑制作用。圖8是從人原代肝癌標本中分選出的0V6+肝癌起始細胞具有更高的幹細胞相關基因表達水平。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作詳細描述，但本發明的實施不僅限於此。實施例I.肝癌細胞系SMMC7721中0V6+肝癌起始細胞的分離、鑑定I、製備單細胞懸液；2、按I : 100的稀釋比例加入小鼠抗人0V6IgGl抗體(購自R&D公司)，使總體積為 500 μ 1,4°C 孵育 IOmin ；3、用2ml MACS緩衝液洗滌細胞兩次離心，去除多餘的抗體；4、用80 μ I MACS緩衝液重懸細胞，加入包被大鼠抗小鼠IgGl抗體的免疫磁珠20 μ I (每 IO7 細胞)，4°C放置 15min ；
5、加入MACS緩衝液洗滌離心，棄上清，重新用500 μ I緩衝液重懸細胞；
6,500 μ I緩衝液預洗MS柱後，將500 μ I細胞懸液過柱；7,500 μ I緩衝液洗柱三次，去除非標記陰性細胞；8、移柱出磁場，用緩衝液洗柱，收集洗液即為陽性細胞。9、通過流式細胞儀檢測證實(如圖I所示)，分選後0V6+細胞比例大大提高。實施例2.肝癌細胞系中0V6+肝癌起始細胞的體內成瘤能力從SMMC7721和Huh7(均購自中科院上海細胞庫)中分離獲得0V6+肝癌起始細胞，分離方法如實施例1，按不同數量級接種於N0D/SCID鼠皮下,如表I所示，0V6+肝癌起始細胞具有更強的體內成瘤能力。由表I可知，是從在體外培養的肝癌細胞系中分選的0V6+肝癌幹細胞具有更強的成瘤能力；一定數量的經過免疫磁珠分選的細胞皮下注射於NOD-SCID鼠皮下，觀察成瘤情況，發現0V6+肝癌幹細胞具有更強的成瘤能力。實施例3.肝癌細胞系中0V6+肝癌起始細胞的幹細胞特性和自我更新能力將分選獲得的0V6+肝癌起始細胞接種於6孔低粘附培養板中，在細胞培養箱中靜置培養10天後可以獲得腫瘤球。如圖2所示，0V6+肝癌起始細胞所形成的第一代和第二代腫瘤球數量均明顯高於非肝癌起始細胞組。實施例4. 0V6+肝癌起始細胞具有更強的遷移和侵襲能力將分選獲得的0V6+肝癌起始細胞或0V6-肝癌細胞分別通過Transwell遷移實驗和Matrigel侵襲實驗(具體方法參見《細胞生物學實驗手冊》，科學出版社，2008年I月)的方法比較其遷移和侵襲能力。將0V6+肝癌起始細胞或0V6-肝癌細胞接種於Transwell (孔徑8um)小室或包被Matrigel的Transwell (孔徑8um)小室上室,下室中加入10%胎牛血清。24小時後觀察穿過小孔的細胞數量。如圖3所示，0V6+肝癌起始細胞具有更強的遷移和侵襲能力。實施例5. 0V6+肝癌起始細胞在小鼠體內具有更強的轉移能力將分選獲得的0V6+肝癌起始細胞通過尾靜脈注射入N0D/SCID鼠體內。8周後處死小鼠，解剖肺部後觀察。結果如圖4所示，八周後觀察小鼠肺內轉移情況，發現無論是肉眼可見癌結節，還是鏡下觀察到的微轉移灶，0V6+細胞注射組均高於0V6-細胞組。可見，本發明分離得到的0V6+肝癌起始細胞具有更強體內轉移能力。實施例6.人肝癌標本中0V6+肝癌起始細胞檢測對石蠟包埋的人肝癌標本行0V6抗體(抗體稀釋比例為I : 50)的免疫組織化學檢測(具體方法參見《組織化學與免疫組織化學》，人民衛生出版社，2008年9月)，發現人肝癌組織中有不同數量的0V6+肝癌起始細胞(圖5)。實施例7. 0V6+肝癌起始細胞數量可以判斷肝癌患者預後根據肝癌患者癌組織中0V6+肝癌起始細胞的數量將患者分為0V6+肝癌起始細胞數量較高組和較低組。如表2和圖6所示,0V6+肝癌起始細胞數量較高組患者臨床病理資料侵襲性特徵(高甲胎蛋白水平，多發腫瘤，腫瘤無包膜，較晚TNM分期，伴有門靜脈癌栓，發生遠處轉移)更強，無病存活率和總生存率均較低。接下來，通過對影響肝癌患者預後的因素進行分析，發現甲胎蛋白水平、腫瘤數目、 M分期、門靜脈癌栓、遠處轉移、0V6+肝癌起始細胞數量等因素與肝癌患者預後相關，進一歩分析發現0V6+肝癌起始細胞數量可作為判斷肝癌患者總生存率的獨立預後因子，詳見表3。由表2可知，0V6抗體所識別的0V6+肝癌幹細胞的數量越多，肝癌患者的腫瘤病理指標越差(根據0V6+肝癌幹細胞的數量分組，低表達組(陰性，較少，中等)，高表達組(較多));由表3可知，0V6+肝癌幹細胞的數量可以作為肝癌患者總生存率的獨立預後因子。實施例8. AMD3100對肝癌起始細胞的抑制作用
選獲得的0V6+肝癌起始細胞接種於6孔低粘附培養板中，分別設對照、AMD3100處理組(購自Tocris公司，使用濃度為10ng/ml)。在細胞培養箱中靜置培養10天後可以獲得腫瘤球。如圖7所示，AMD3100不僅能抑制0V6+肝癌起始細胞自身的腫瘤球形成，而且可以抑制SDF-I對0V6+肝癌起始細胞腫瘤球形成的促進作用。提示，AMD3100對肝癌起始細胞具有抑制作用。實施例9.人原代肝癌標本中獲得0V6+肝癌起始細胞的分離方法及特性鑑定分離人原代肝細胞癌標本(行肝癌根治性切除術的患者籤署知情同意後，於手術過程中獲取)獲得原代人肝癌細胞。具體分離方法為在嚴格無菌狀況下，將獲取的肝癌手術標本，用無血清DMEM液(購自Gibco公司)漂洗兩次；用眼科剪剪成約Imm3小塊，然後加入濃度為O. 1%的IV型膠原酶(購自Sigma公司)，於37攝氏度細胞培養箱中作用20-30分鐘後取出，輕柔吹打成單細胞懸液，細胞懸液經200目尼龍網過濾後獲得單細胞懸液，1000轉/分鐘離心3分鐘後，棄上清。然後按照實施例I中所述方式分選獲得0V6+肝癌細胞。如圖8所示，分選獲得的0V6+肝癌起始細胞乾性相關的基因(⑶133，Nanog，0ct4，Sox2)表達水平明顯高於0V6-肝癌細胞。表I是SMMC 7721和Huh7細胞行有限稀釋法和系列移植實驗結果(發生腫瘤的小鼠只數/總注射小鼠只數)
權利要求
1.一種從肝癌細胞系和人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，其特徵在於它包括以下步驟 (a)將0V6單克隆抗體與含有肝癌起始細胞的肝癌細胞系混合，形成「0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞」複合物； (b)離心去除未結合的0V6單克隆抗體，形成「0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞」複合物沉澱，並與磁珠標記的抗小鼠IgGl第二抗體孵育，形成「 0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞-肝癌起始細胞」複合物； (c)通過磁場分離步驟(b)形成的複合物，從而獲得肝癌起始細胞。
2.根據權利要求I所述的ー種從肝癌細胞系和人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，其特徵在於，其中的肝癌細胞系是SMMC7721、Huh7、HepG2或HCC-LM3。
3.根據權利要求I所述的ー種從肝癌細胞系和人原代肝癌標本中獲得肝癌起始細胞的分離方法，其特徵在於，它包括以下步驟 (a)將0V6單克隆抗體與從原代肝癌標本中分離的肝癌細胞混合，形成「0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞」複合物； (b)離心去除未結合的0V6單克隆抗體，形成「0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞」複合物沉澱，並與磁珠標記的抗小鼠IgGl第二抗體孵育，形成「 0V6單克隆抗體-肝癌起始細胞-肝癌起始細胞」複合物； (c)通過磁場分離步驟(b)形成的複合物，從而獲得肝癌起始細胞。
4.根據權利要求I至3任一分離方法獲得的肝癌起始細胞。
5.根據權利要求4所述的肝癌起始細胞，其特徵在幹，該肝癌起始細胞在體外具有更強的自我更新能力，在體內具有更強的成瘤能力，具有更強的遷移和侵襲、轉移能力。
6.一種如權利要求4所述的肝癌起始細胞在製備肝癌預後診斷試劑或試劑盒中的應用。
7.—種如權利要求4所述的肝癌起始細胞在篩選抗肝癌藥物中的應用。
8.根據權利要求7所述的肝癌起始細胞在篩選抗肝癌藥物中的應用，其特別徵在幹，其中的抗肝癌藥物是肝癌起始細胞抑制劑，篩選方法包括以下步驟 (a)將候選的肝癌起始細胞抑制劑加入肝癌起始細胞培養體系中，並檢測肝癌起始細胞功能特性； (b)將步驟(a)中測試組中肝癌起始細胞功能特性與對照組比較，如果測試組功能特性指標在統計學上低於對照組，則表明該候選物為抑制肝癌起始細胞的化合物。
全文摘要
本發明涉及細胞生物學技術領域。腫瘤起始細胞不僅與腫瘤的起始和進展相關，在腫瘤的侵襲和轉移中，腫瘤起始細胞同樣發揮著至關重要的作用。本發明的目的在於提供一種肝癌起始細胞，及其分離方法與應用。本發明是用特異性的OV6單克隆抗體和磁珠分選、富集肝癌起始細胞，所分離得到的OV6+肝癌起始細胞具有多種特性，用途廣泛。並將所分離得到的肝癌起始細胞用於肝癌預後分析和藥物篩選。
文檔編號C12N5/09GK102653730SQ20121011544
公開日2012年9月5日 申請日期2012年4月18日 優先權日2012年4月18日
發明者於樂興, 唐亮, 楊文 , 王紅陽 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學