一種降低血清中胰酶抑制物的方法及其應用的製作方法
2023-08-07 18:56:46
專利名稱：一種降低血清中胰酶抑制物的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物製品領域，具體涉及一種降低血清中胰酶抑制物的方法及其應用。
背景技術：
生物製品生產過程中廣泛用到血清。血清是細胞培養過程中必不少的營養物質。其含有胺基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質，並且提供胰島素、腎上腺皮質激素(氫化可的松、地塞米松)、類固醇激素(雌二醇、睪酮、孕酮)等激素和各種生長因子。血清中的結合蛋白能給攜帶重要地低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵，結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用，對培養中的細胞起到某些保護作用，例如有一些細胞，如內皮細胞、骨髓樣細胞可以釋放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。這種作用是偶然發現的，現在則有目的的使用血清來終止胰蛋白酶的消化作用。因為胰蛋白酶已經被廣泛用於貼壁細胞的消化傳代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保護細胞免受機械損傷，特別是在懸浮培養攪拌時，粘度起到重要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3，硒等。哺乳動物細胞培養已經發展到能夠自由擴大培養並且用於工業化生產的地步了。目前許多生物活性物質和疫苗，例如單克隆抗體、藥用蛋白質、禽流感疫苗等，都可以通過動物細胞大規模培養獲得。在生產過程中，不論是在細胞繁殖階段還是生物活性物質生產階段，血清均是必不可少的營養物質。但是在禽流感病毒繁殖過程中，出現了例外的情況。由於禽流感病毒入侵細胞時需要胰酶協助禽流感病毒入侵細胞，整個繁殖的過程中仍然需要加入胰酶促進禽流感病毒再次入侵細胞和繁殖。因此，禽流感病毒繁殖過程中，不能添加血清，否則病毒產量很低。但是血清中含有大量的胺基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物、胰島素、腎上腺皮質激素、類固醇激素等激素和各種生長因子，這些因子絕大多數均為小分子物質，其不但對細胞生長維持細胞的活力還對病毒的合成繁殖起著重要作用。如果能夠有效的去除或減少血清中胰酶抑制物的濃度，那麼對禽流感病毒的繁殖和禽流感細胞苗的產業化將起著重要的作用。
發明內容
為了克服上述缺陷，本發明的目的在於提供一種降低血清中胰酶抑制物的方法，降低血清中胰酶抑制物，用於禽流感病毒的繁殖。本發明的另一目的在於應用降低胰酶抑制物的血清進行禽流感病毒的接種繁殖。本發明的有一目的在於提供一種用降低胰酶抑制物的血清進行禽流感病毒的接 種繁殖方法。為實現上述目的，本發明所採用的技術方案如下一種降低血清中胰酶抑制物的方法，其包括以下步驟I)血清解凍將保存的血清解凍；
2)離心處理血清解凍後，離心處理，去除血清中的大塊沉澱物；3) 一次初步過濾使用孔徑為50-100K橫向切流濃縮儀，對上述血清進行一次初步過濾,去處血清中的大分子物質,收集一次濾液；4) 二次初步過濾使用孔徑為20-40K橫向切流濃縮儀，對上述濾液進行二次初步過濾，去處濾液中的大分子物質，收集二次濾液；5)深度過濾使用孔徑為5-10K超濾系統，對上述二次濾液進行超濾，收集血清濾液，得到減少了胰酶抑制物的血清。所述血清解凍步驟是將_20°C保存的血清放在2_8°C冰箱中過夜解凍。
所述離心處理步驟中是使用5000-8000轉/分的離心機，將解凍後的血清離心20-30分鐘。本發明所得到的減少了胰酶抑制物的血清用於禽流感病毒的接種繁殖。一種禽流感病毒的接種繁殖方法，其步驟如下首先用含有胎牛血清的MHM培養基培養細胞，待細胞緻密後倒掉培養液；然後使用PBS洗滌細胞，直到把細胞瓶培養瓶中的血清洗淨，再加入少量禽流感病毒-胰酶溶液細胞進行接種，接種後倒掉禽流感病毒-胰酶溶液，加入減少胰酶抑制物的血清和胰酶進行禽流感病毒的繁殖。上述接種繁殖方法中，所述MEM培養基中，胎牛血清的含量佔培養基重量的1-2%。上述接種繁殖方法中，所述的細胞培養瓶為T25細胞瓶。上述接種繁殖方法中，所述細胞為MDCK或VeiO細胞。本發明的有益效果在於本發明所述的減少血清中胰酶抑制物的方法通過離心、橫向切流、超濾等系列方法減少血清中胰酶抑制物的濃度。經過本發明的方法處理之後的血清用於禽流感病毒的繁殖，在同等條件對於沒有處理過的血清用於禽流感病毒繁殖，禽流感病毒的HA價提高8-16倍；相對於完全沒有加血清用於禽流感病毒繁殖，禽流感病毒的HA價提高2-4倍。下面結合具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明。
具體實施例方式以下是本發明優選的實施例。實施例I :一種降低血清中胰酶抑制物的方法，其包括以下步驟將保存的血清放在5°C冰箱中過夜解凍；血清解凍後，用5000轉/分的離心機，將解凍後的血清離心20分鐘，去除血清中的大塊沉澱物；使用孔徑為50-100K橫向切流濃縮儀,對上述血清進行一次初步過濾,去處血清中的大分子物質,收集一次濾液,再使用孔徑為20-40K橫向切流濃縮儀，對上述濾液進行二次初步過濾，去處濾液中的大分子物質，收集二次濾液，接著使用孔徑為5-10K超濾系統，對上述二次濾液進行超濾，收集濾液，得到減少胰酶抑制物的血清。MDCK細胞按照I :4的比例進行傳代，MDCK細胞使用含有10%的胎牛血清的MEM培養基進行培養，等細胞緻密後，接種H5亞型禽流感病毒，接種方法為首先用倒掉T25細胞瓶中培養液；然後使用PBS洗滌MDCK細胞，直到把細胞瓶中的血清洗淨；再加入少量禽流感病毒-胰酶溶液對MDCK細胞進行接種，接種後倒掉禽流感病毒-胰酶溶液，加入血清和胰酶進行禽流感病毒的繁殖。其中用減少胰酶抑制物的血清置兩組對比即將分別用質量濃度為1%和2%的減少胰酶抑制物的血清繁殖禽流感病毒；沒有處理的血清設置兩組對比分別用質量濃度為1%和2%沒有處理的血清繁殖禽流感病毒；同時設置不添加血清的對照組。按照上述處理的H5亞型禽流感病毒接種後24小時和48小時檢測繁殖禽流感的滴度(HA價)，其結見表I :表I: H5亞型禽流感病毒接種對比
權利要求
1.一種降低血清中胰酶抑制物的方法，其特徵在於其包括以下步驟 1)血清解凍將保存的血清解凍； 2)離心處理血清解凍後，離心處理，去除血清中的大塊沉澱物； 3)一次初步過濾使用孔徑為50-100K橫向切流濃縮儀，對上述血清進行一次初步過濾，去處血清中的大分子物質，收集一次濾液； 4)二次初步過濾使用孔徑為20-40K橫向切流濃縮儀，對上述濾液進行二次初步過濾，去處濾液中的大分子物質，收集二次濾液； 5)深度過濾使用孔徑為5-10K超濾系統，對上述二次濾液進行超濾，收集血清濾液，得到減少了胰酶抑制物的血清。
2.根據權利要求I所述的降低血清中胰酶抑制物的方法，其特徵在於所述血清解凍步驟是將_20°C保存的血清放在2-8°C冰箱中過夜解凍。
3.根據權利要求I所述的降低血清中胰酶抑制物的方法，其特徵在於所述離心處理步驟中是使用5000-8000轉/分的離心機，將解凍後的血清離心20-30分鐘。
4.權利要求I中減少胰酶抑制物的血清用於禽流感病毒的接種繁殖。
5.如權利要求4所述的禽流感病毒的接種繁殖方法，其特徵在於其步驟如下首先用含有胎牛血清的MEM培養基培養細胞，待細胞緻密後倒掉培養液；然後使用PBS洗滌細胞，直到把細胞瓶培養瓶中的血清洗淨，再加入少量禽流感病毒-胰酶溶液細胞進行接種，接種後倒掉禽流感病毒-胰酶溶液，加入1-2%減少胰酶抑制物的血清和胰酶進行禽流感病毒的繁殖。
6.根據權利要5所述的禽流感病毒的接種繁殖方法，其特徵在於所述禽流感病毒繁殖過程中，MEM培養基中胎牛血清或者減少胰酶抑制物的血清的含量佔培養基重量的1-2%。
7.根據權利要6所述的禽流感病毒的接種繁殖方法，其特徵在於所述細胞為MDCK或Vero細胞。
全文摘要
本發明涉及生物製品領域，具體涉及一種降低血清中胰酶抑制物的方法。其包括以下步驟血清解凍、離心處理、一次初步過濾、二次初步過濾、深度過濾等步驟得到減少了胰酶抑制物的血清。本發明所得到的減少了胰酶抑制物的血清用於禽流感病毒的接種繁殖。本發明所述的減少血清中胰酶抑制物的方法通過離心、橫向切流、超濾等系列方法減少血清中胰酶抑制物的濃度。經過本發明的方法處理之後的血清用於禽流感病毒的繁殖，在同等條件對於沒有處理過的血清用於禽流感病毒繁殖，禽流感病毒的HA價提高8-16倍；相對於完全沒有加血清用於禽流感病毒繁殖，禽流感病毒的HA價提高2-4倍。
文檔編號C12R1/93GK102660511SQ20121015508
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者張冬霞, 徐家華, 施維松, 湯欽, 陳瑞愛 申請人:廣東大華農動物保健品股份有限公司, 肇慶大華農生物藥品有限公司