用於皮膚創傷癒合的紅細胞生成素的局部施用和配製劑的製作方法

2023-08-07 21:38:11 1

專利名稱：用於皮膚創傷癒合的紅細胞生成素的局部施用和配製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及紅細胞生成素(EPO)的用途，特別是EPO在使活性物質穩定化的藥物 配製劑中用於創傷皮膚的局部治療，特別是用於機械或病理損傷或者燒傷的創傷癒合。本 發明特別針對以本發明的穩定形式基於親水性聚合物的EPO用於刺激特定細胞類型分化 和生長的用途，例如分別出現在這類皮膚損傷的直接創傷部位的非血管前體細胞的組織特 異性的前體細胞，或者非內皮細胞的成熟組織特異性細胞。特別是，本發明還涉及特定的基於多糖的粘性的或凝膠狀的配製劑，特別是纖維 素衍生物，其包含EPO並能夠使其穩定且緩慢和均勻地在創傷處釋放。
背景技術：
紅細胞生成素(EPO)是一種糖蛋白激素，其控制由骨髓中的前體細胞生成紅細胞 (紅細胞生成)。EPO在此與在所有造血細胞中表達的受體(EPO-R)結合。在成人中，紅細胞生成素主要在腎臟形成，更確切地說在腎小管周圍毛細血管的 內皮細胞。少量的也在肝細胞Ofepatozyten)中合成。EPO的主要作用是，提高血液中紅細胞的數量，以導致氧攝入的提高。近些年，不同的作者報導，EPO也發揮非造血的作用，而所述EPO-R相應地也在特 定的非造血細胞中表達。例如，通過EPO刺激神經細胞、腦的神經元細胞和內皮細胞被報 道，其中在一些情況下與造血EPO受體的直接表達相聯繫。在其它情況下，預計存在另一種 非造血的受體，但這還沒有被證實。特別是在不久前得知的EPO的非造血作用與例如內皮細胞和組織細胞，如結締組 織、肌肉組織、上皮組織和神經組織的刺激生成和再生相關聯，被賦予越來越重要的意義。例如，WO 2004/001023尤其是描述EPO和TPO用於刺激血管新生和組織再生和改 善創傷癒合，例如在手術和受傷後。在WO 2005/063965中教導了 EPO用於創傷組織有目的的結構控制性再生，其中不 僅刺激內皮細胞的生長，而且還促進實質再生和壁結構(Wandstrukturen)生成，使得出現 協調三維生長以構建功能性組織、器官或其部分。Haroon 等人(American J. Pathol. 2003，163,993)討論了 EPO 在通過纖維蛋白促 使創傷癒合的過程範圍內的新作用。在一篇綜述文章中，Brines和 Cerami (Kidney International, 2006)討論 EPO 在 組織保護中的作用。紅細胞生成素和EPO衍生物或還有EPO模擬物看似在全身應用中也出色地適用， 從而能夠在皮膚、黏膜受傷，在開放性皮膚和皮肉傷或者也在由燒傷或燙傷引起的皮膚刺 激中，有目的地啟動和控制所涉及組織的新生和再生，並且能夠最終促進和加快癒合。WO 2005/070450和有關發明人的其它論文描述了 EPO在血管和組織再生中以周 劑量小於90IE/kg體重(=KGW)，尤其是也用於包括在創傷護理領域。即使在此理論上述 及可能的局部應用，然而已經發現，全身施用是優選的。
因此假設，在全身施用時EPO以繼發性紅細胞增多症的 (subpolzythamisch )小於90iu(國際單位=Units)/kg體重(kgw)的周劑量給藥， 代替如到目前為止熟知的EPO-應用中常規的150-300IU/kg體重。由此應該達到，較小地 刺激在骨髓區中的造血，但根據如所描述的新教導，活化血液區中的內皮祖細胞是可能的。 內皮細胞前體細胞在血液還有在組織中的活化和內皮細胞的發育，其形成血管的最內層的 細胞層，與血管形成的改善相關聯並假設，由此使組織再生也成為可能。這在臨床試驗期間 在燒傷的情況下得以證明。即便在一些所述論文中提到了 EPO的局部應用以使組織再生，但活性物質的全身 施用明顯很重要，因為基於結果，根據新的論文的觀點所發現的非造血EPO效果首先歸因 於相應的內皮的、血管的或CD31-陽性前體細胞新發現的刺激，其與血流一起循環，其次才 歸因於由此刺激的實質的組織結構的生長。然而，EPO在全身施用中應用於組織保護或組織再生，由於有關造血效果的副作 用，實施是有顯著風險的。在EPO的局部應用中，根據到目前為止教導的觀點，從所提及的全身通過EPO產生 的細胞或前體細胞不足的分布和可達性，對於組織再生觀察不到效果或僅僅觀察到不令人 滿意的效果。在例如燒傷或燙傷後的組織再生的情況下，或者在局部缺血性創傷的情況下，達 到迅速的缺損封閉是必需的。這只能在儘可能快地刺激皮膚實質部分形成時發生。為了使 之後另一種成分(實質)的生成成為可能，對成分(CD31)進行時間-轉換刺激，相應於WO 2005/070450的作者以及其它的出版物的教導。雖然血管網的生成可以間接地起支持作用，但是就此而言並不是最終結果，因為 實質缺乏且在某些條件下只能繼發地並因此延遲地生成。血管細胞的生成也必須與局部組織的生成同時相協調。在此，根據傳統教導出現 困境，因為經皮下或經靜脈施用的劑量基於全身分布原則以內皮祖細胞為目標，且為了限 制副作用必須附加給予繼發性紅細胞增多症的劑量。因此，在這種情況下，EPO的給予只能 困難地與局限於皮膚創傷部位的局限性藥物動力學相結合。相應於傳統教導，因此必須選擇抽象的刺激途徑，其中要麼必須以繼發性紅細胞 增多症的劑量給藥，要麼必須重複地注射或改變源物質半衰期。但是，在每種情況下，EPO將在身體中全身分布，並且通過血流進一步稀釋地到達 本來的需要部位。此外，在創傷的情況下產生了使EPO的局部應用困難的過程通常，創傷癒合例如 受傷皮膚或黏膜的創傷癒合經過三期發炎期、增生期和修復/變異期。在應受護理的新傷 口或皮膚受傷的情況下，在最初24小時發生發炎過程，其主要包括不同發炎因子(例如纖 維連接蛋白)和不同類型的細胞，例如單核細胞、吞噬細胞、多形細胞和巨噬細胞的移入， 並最終導致形成纖維蛋白基質和血管內皮細胞。在此產生的創傷分泌物尤其含有一系列的 蛋白質水解酶以及侵入創傷中的含有起相關作用的物質的細菌。一部分高活性的蛋白質水解酶是，在創傷上施塗的促進創傷癒合的含有蛋白質或 肽的藥物，如ΕΡ0，經常有少許或完全沒有效果的原因，因為所涉及的蛋白質或多肽由於其 化學和生物性質，在其能夠發揮足夠的藥理學的功效之前，被所述的酶滅活、裂解和降解。通過傷口被細菌感染和細胞碎片的入侵使所述問題額外地強化。尤其出於這個原因，藥物蛋白通常全身施用，由此可以顯著延長其半衰期，並使其 更快地向其應該發揮它的治療功效的身體部位運輸。但是在這種施用方法中，含有蛋白質 的活性物質的劑量必需足夠高，以便達到所期望的治療效果，這經常不可避免地導致不期 望的副作用。此外，在治療性處理皮膚傷害的情況下顯示，活性物質的全身施用原則上是較不 適用的，因為藥物的治癒效果實際上僅在局部是必需的。因此，當使用含有蛋白質的活性物 質以治療皮膚傷害和開放性皮肉和皮膚創傷時，存在普遍的問題。以局部形式應用蛋白質和多肽，例如ΕΡ0，其本身在血漿中具有僅48小時的半衰 期，對於治療這類皮膚傷害，如在過度機械作用和刺激的情況下以及在燒傷和燙傷情況下 可能出現的這類皮膚傷害，EPO是十分理想的，儘管有熟知的難度。因此，存在以下任務，即，提供EPO或其生物等效的衍生物、片段、模擬物等以局部 應用的形式用於皮膚的創傷癒合，而一方面不發生，如上所述的，通過EPO基於在創傷處的 酶促或其它過程的蛋白水解的顯著效果損失；另一方面，同樣如上文詳細闡明的，通過局部 施用ΕΡ0，使得可能對在直接創傷區並儘可能地也對在創傷周邊區域較深組織層中的能夠 使創傷癒合的細胞或前體細胞進行刺激，其最終應該導致較快的創傷閉合，並且使EPO的 局部應用首次顯得有意義，並展示相對於全身施用的顯著優點。此外，本發明的目的是實現一種給藥形式，其不必遵循EPO的全身特別是繼發性 紅細胞增多症的劑量的風險和限制，且同時可以特異性地作用於實際的組織相關細胞，而 與此同時不把局部化的成熟內皮細胞排除在外。發明_既述現在，令人驚訝地發現，EPO優選以適合的使活性物質穩定化並均勻給予配製劑局 部應用於皮膚的創傷或者由病理上引起的損傷是有效的，其中該效果，如尤其是也在組織 學試驗中顯示的，沒有或幾乎沒有歸因於已知的預計的可以在血液循環和向創傷運輸的內 皮前體細胞和其它前體細胞的活化(這對爭取達到的效果是不夠的)，而是明顯通過EPO引 起的刺激局部化的，即直接創傷區或在創傷擴展的周圍環境中的細胞，其中令人驚訝的是 這些皮膚組織中的細胞主要功能性地促使創傷癒合，所述細胞為實質，即不是血管細胞或 其前體細胞，而且也主要不是位於創傷組織中的內皮細胞或其前體細胞。通常發現，特別是這些在創傷區的細胞(其不帶有或只不明顯帶有，不表達或者 只不明顯表達內皮細胞表面標記物CD31)被通過局部施用EPO直接和區域性刺激分化和生 長。⑶31通常發現於內皮細胞或血管細胞、血小板、巨噬細胞、粒細胞、T細胞、NK細 胞、淋巴細胞和纖維原細胞。表達⑶31的細胞被看作是新生血管生成因子。在組織中所述 血管為如河流一樣穿過組織那樣的結構，但決不代表組織本身。該血管細胞和其前體細胞 具有如CD31的表面標記，以此與其它細胞是可精確區別和界定的。皮膚的實質部分為CD31 陰性細胞類型如角化細胞、髮根細胞以及真皮細胞如結締組織細胞。優選通過局部施用EPO 直接和原位(vor Ort)刺激CD31陰性細胞，特別是角化細胞、髮根細胞和結締組織細胞，或 者僅少量表達⑶31的細胞。所述進一步的作用效果是新的且既區別於已知的EPO造血效 果又區別於近期發現的非造血的並全身證明的機理(參見上文)。
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關於這一點應該著重強調，特別是全身施用紅細胞生成素及其衍生物和類似物在 皮下或靜脈內給藥的情況下，僅導致在皮膚創傷部位不足或短期的效果，尤其該全身的概 念忽略了完全獨立於血管細胞的組織特異性幹細胞的重要性。根據本發明，首次通過局部的EPO給藥直接刺激局部的皮膚附件中的區域化前體 細胞和皮膚隱窩幹細胞(Stammzellkrypten)。此外發現，通過由EPO引起的上述⑶31陰性 細胞的刺激還刺激在皮膚創傷區的CD90陽性細胞和巢蛋白陽性細胞。CD90是幹細胞和神 經元前體細胞的標記蛋白，而巢蛋白是對於神經細胞的標記物。創傷區的CD73陽性細胞也 直接通過EPO被同時刺激。所以局部施用EPO能夠刺激直接創傷區幾乎所有重要的、對治 愈皮膚創傷必需的細胞生長。根據本發明，在局部施用EPO和其等效或類似效果的衍生物和類似物的應用中完 全獨立於現有技術的繼發性紅細胞增多症的劑量需求的規定和限制，導致直接刺激皮膚中 必需的創傷癒合特異性細胞和前體細胞，所述EPO優選以基於聚合物，特別是親水性聚合 物的適合的配製劑。這一點的實現不依賴於，在常規的全身施用形式的情況下不可避免發 生的對整體器官中的內皮祖細胞的作用。這種全身作用通常由於出現的造血效果(紅細胞 數量的增多，骨髓中造血升高，血栓風險的提高等等)是不期望的。此外，根據本發明局部應用的EPO不引起或不廣泛引起對在全身血液循環中的血 管的或內皮的前體細胞的刺激。該直接的對鄰近創傷的細胞的刺激具有優點在於，局部皮 膚的和創傷的環境一方面通過例如蛋白酶限制全身吸收，所述蛋白酶降低EPO在進入全身 循環範圍之前的降解，而使區域化的高活性物質濃度成為可能。EPO的量，其在常規的全身 施用形式下意味著濃度為250IU EPO/kg體重且更高，可以毫無問題的施用而不出現相應上 述不期望的EPO作用。為此對於組織再生領域的治療廣度被顯著地擴大了。此外，共刺激 效果可以由局部EPO給藥通過僅區域化以高濃度存在的創傷因子啟動。因此本發明的主題為 紅細胞生成素或者其生物等效衍生物或類似物(EPO)之一以使活性物質被穩 定並被均勻釋放的藥物配製劑形式用於製備局部應用藥物的用途，所述藥物配製劑優選基 於具有至少部分親水性的聚合物，所述局部應用的藥物通過有目的地刺激非血管前體細胞 的組織特異性前體細胞和非內皮細胞的成熟組織特異性細胞，並在每種情況下區域特異性 地積聚於創傷皮膚的直接創傷區，用於創傷皮膚的缺損封閉和/或創傷皮膚的上皮再生。 相應的用途，其中所述局部應用的EPO不引起或不廣泛引起對在全身血液循環 中的血管的或內皮的前體細胞的刺激。 相應的用途，其中上述通過局部應用EPO刺激的細胞不表達或僅少量表達⑶31 抗原。 相應的用途，其中皮膚的上皮再生實現20-70%，優選20-50%，特別是30_40% 地快於在相同條件下通過以未穩定化形式的EPO的上皮再生。 相應的用途，其中皮膚的上皮再生實現20-50%，優選30-40%地快於在相同條 件下通過無EPO的藥物配製劑的上皮再生。 相應的用途，其中所述局部應用的EPO刺激角化細胞和/或髮根細胞和/或結 締組織細胞的分化和生長。 相應的用途，其中所述局部應用的EPO附加地刺激直接創傷區的⑶90陽性和/或巢蛋白陽性細胞的分化和生長。 相應的用途，其中所述局部應用的EPO刺激神經元前體細胞和/或神經細胞的 分化和生長。 相應的用途，其中所述局部應用的EPO刺激在創傷局部環境中位於較深的組織 層的相應前體細胞。在EPO全身給藥時的主要問題之一是，在一方面考慮全身的副作用，另一方面是 高活性物質濃度使用的必需性的情況下達到在局部範圍足夠高的組織保護效果。因此，本發明的目的也是創造一種施用方法和一種可以使EPO和其類似物尤其有 效地局部應用的載體材料。令人驚訝地發現，當所述活性物質在使其穩定的藥物製劑或配製劑中提供於局部 施用時，所述局部施用的EPO和其生物等效衍生物和類似物的作用效果尤其顯著，其中所 述配製劑或製劑應該具有進一步的特徵，使所述活性物質可以儘可能均勻且相對緩慢地在 創傷處釋放(緩釋)。令人驚訝地發現，形成凝膠的親水性高粘性的聚合物如纖維素衍生物、卡波姆、脂 肪醇或大粒凝膠(聚乙二醇)或它們的混合物，優選形成凝膠的多糖，特別是選自纖維素醚 類和纖維素酯類的組，作為在相應的局部應用的含有EPO的製劑如軟膏、霜劑、糊劑或凝膠 中對EPO和其衍生物起穩定化作用的載體材料或配製劑基體，優選地，在相應的局部應用 的EPO製劑中顯示使EPO穩定的效果。在此，所述活性物質均勻地分布在保護它的粘性的、 已膨脹的、聚合的或凝膠狀的基質，優選多糖基質中，而且活性物質從該基質中在創傷處均 勻和緩慢地釋放，在其中它能夠直接地和即刻發揮它的效果，而不發生被蛋白質水解酶顯 著降解。有趣的是，具有大於20，OOOmPa s，優選大於30，OOOmPa s，尤其是在20，000和 100，OOOmPa s之間，優選在40，000和60，OOOmPas之間的相對高粘度的含有EPO的凝膠，其 顯示比具有粘度值小於20，OOOmPa s，特別是小於10，OOOmPa s的較低粘性的凝膠更有利
的結果。該粘度值可以在凝膠中獲得，其中形成凝膠的聚合物具有份額為2-4重量％，優選 2-3 %，但不顯著更少的多糖-凝膠形成劑。凝膠配製劑表明特別有利的是，其包含至少一種可膨脹的多糖作為凝膠形成劑， 所述多糖選自羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素和羧乙基纖維素組成的組。該配 製劑優選含有羧甲基纖維素和/或羥乙基纖維素，或由它們組成。除了基於多糖的凝膠狀組分如纖維素或還有藻酸鹽以外，原則上具有親水性總體 效果和必需的粘性的其它可膨脹的聚合物也是適合的，如在很多商購可得的配製劑(例如 凝膠、糊劑、軟膏)中使用的那些。疏水性聚合物也可以是高粘性的基質，例如基於聚丙烯酸酯或聚氨酯，其中構入 包含活性物質的多糖構成的水凝膠態顆粒，所述多糖如羧甲基/乙基纖維素、明膠或果膠。在根據本發明的有利的凝膠-配製劑中的EPO顯示超過30天的長時間段內是穩 定的(附

圖1)，而在濃度可比較的EPO水溶液(0. 9%的NaCl)中EPO的含量在20天後降 低約80%。相比之下，與不含EPO的根據本發明的配製劑相比，用含有EPO的根據本發明的配 製劑治療的創傷的癒合快約10-50%，優選20-40%。例如在用含有EPO的本發明的配製劑4-8天後通過上皮再生達到介於92和99%的創傷癒合，而在相同條件下，用不含EPO的根 據本發明的配製劑僅達到最多85-87%的創傷癒合。因此，本發明的主題為 基於至少一種形成凝膠的具有至少20，OOOmPa χ s的粘度的親水性聚合物的粘 性配製劑，其包含紅細胞生成素或其生物等效的衍生物或類似物(EPO)之一，且能夠將它 們均勻釋放到親水性的周圍環境中。 相應的粘性配製劑，其具有至少30，OOOmPa χ s的粘度，優選40，000至 60，OOOmPa χ s 的粘度， 相應的粘性配製劑，其優選包含作為親水性聚合物的纖維素衍生物，特別是選 自下組的多糖羥烷基纖維素和/或羧烷基纖維素，和基於聚丙烯酸酯或聚氨酯的疏水性 聚合物基質， 基於至少一種膨脹性多糖的凝膠狀或粘性配製劑，所述多糖選自羥烷基纖維 素和/或羧烷基纖維素，所述配製劑包含紅細胞生成素或其生物等效的衍生物或類似物 (EPO)， 相應的配製劑，其通過將EPO以凍幹、溶解或懸浮的形式與預先膨脹的多糖混 合而獲得， 相應的配製劑，其中完成膨脹的多糖具有5000-100，OOOmPax s,特別是 20，000-50，OOOmPa χ s 的粘度， 相應的配製劑，其中以0. 4至4重量％，特別是2-3%的濃度使用多糖， 相應的配製劑，其中所述多糖是纖維素醚和/或纖維素酯類並選自下組的一個 或多個成員一羥乙基纖維素一羥甲基纖維素一羧乙基纖維素一羧甲基纖維素 優選的配製劑，其包含作為凝膠形成劑的可聚合的羥乙基纖維素和/或羧甲基 纖維素， 相應的配製劑，其以100至500IU/g凝膠配製劑的濃度包含ΕΡ0，特別是150至 300 IU/g凝膠配製劑，優選150 IU/g凝膠配製劑， 相應的配製劑，其包含0. 5g至5g凝膠配製劑/cm2創傷面積，優選Ig至3g凝 膠配製劑/cm2創傷面積，特別是1. Og/cm2創傷面積， 相應的配製劑，其取決於所使用的凝膠量，具有以下的EPO量，其相當於在約 IOOcm2的創傷面積的情況下，全身給藥約50-2200IU/kg體重(KGW，標準體重70kg)，或對於 創傷面積 200cm2，約 100-4500IU/KGW，和對於創傷面積約 300cm2，約 150-6000IU/KGW。 相應的配製劑，其視創傷的大小或創傷面積(Icm2至300cm2)而定，包含約50至 約 450，OOOIU 量的 EPO,平均約 500 至 300，000IU,優選 1500 至 60，000IU,特別是 3000 至 10，000IU, 相應的配製劑，其額外地包含至少一種其它活性化合物，其優選起抗菌的、抗病 毒的、抗真菌的或消炎的作用，用作蛋白酶抑制劑或對創傷癒合是重要的。
相應的配製劑，其額外地包含至少一種合成聚合物， 相應的配製劑，其額外地包含一種或多種助劑， 相應的配製劑，其引入固體載體基質之中或之上，其調節活性物質的釋放，且特 別是EPO均勻釋放到創傷皮膚的創傷區。 相應的配製劑，其中固體載體基質是貼劑、箔、薄膜、繃帶、紗布，但是特別是三 維結構的貼劑，其能夠穩定化並保護配製劑本身。 藥物試劑盒，其包含至少兩個分開的包裝單元，其中第一個單元包含至少一種 膨脹性聚合物和第二個單元包含至少凍幹EPO及其相應的衍生物。根據本發明的配製劑可以用於局部和區域性治療人和動物的受傷皮膚以及不同 原因的皮膚疾病。根據本發明的配製劑也可以特別是在牙科中使用和/或用於基礎醫學 或者獸醫學中改善創傷癒合。根據本發明的配製劑也可以用於局部治療術後或創傷後的 傷口感染和燒傷、術後敗血症、發炎和/或感染的潰瘍、慢性局部缺血性創傷、急性或慢性 的皮膚感染或皮膚病、痤瘡、酒渣鼻、牛皮癬或者黏膜潰瘍，或黏膜創傷，如黏膜-骨創傷 (Schleimhaut-Knochenwund)中，特別是在頌區或齒區。本發明的主題因此也是上下文特定的配製劑用於製備藥物製劑的用途，其用於通 過皮膚上皮再生局部地並區域性地治療創傷和使創傷癒合，特別是用於燒傷或皮膚、黏膜、 骨的創傷和牙科領域的創傷的治療和癒合。附圖簡述附圖1 含有EPO的製劑的穩定性研究如由附圖1可以得知的那樣，在研究期間EPO含量在90-100%淨含量(150U/ml) 的範圍內變動，從而認為所述製劑和相應的水凝膠在製備後4周時間內的穩定性。與此相反，含有食鹽的溶液(在水中0. 9重量％的NaCl與40U/ml的ΕΡ0)顯示在 實驗期間內顯著的EPO降解，以至於在第三和第四周後能夠確定僅有在20%和30%之間的
淨含量。附圖2 該圖以％描述受傷大鼠皮膚的上皮再生，其用根據本發明的配製劑(羧甲基纖維 素3% )不含EPO(對照/安慰劑，凝膠F-左柱圖)和含有EPO(大約0. 3g凝膠150IU/g 凝膠=大約200IU/體重，凝膠E-右柱圖)處理4天。結果以表格形式(上圖)和圖形(下圖)描述。附圖3 該圖以％描述受傷大鼠皮膚的上皮再生，其用根據本發明的配製劑(羧甲基纖維 素3%)不含(對照/安慰劑，凝膠F-左柱圖)和含有EPO (大約0. 3g凝膠150IU/g凝膠 =大約200IU/體重，凝膠E-右柱圖)處理8天。將繃帶/貼劑(Pilaster)4天後更換一 次且創傷用新鮮的凝膠處理。在用根據本發明的配製劑處理8天後皮膚將近100%恢復。結果以表格形式(上圖)和圖形(下圖)描述。附圖4 附圖4描述經用如實施例8中描述的凝膠處理8天後的創傷癒合的組織學研究。 在此通過相應染色的表達CD31蛋白和巢蛋白的細胞來描述。結果顯示，相比用對照配製劑，在用EPO處理的情況下，上皮層厚顯著提高。就此可以看出，上皮的新生基本上與cd31陽性(被染色的)細胞增多無關，但一定程度上與巢 蛋白陽性細胞有關。附圖5 附圖5是一位糖尿病患者的慢性局部缺血性三級外踝潰瘍，在用含有3，000IU EPO的根據本發明的配製劑局部施用三次(總計9，000IU)後，癒合的照片證據。下圖描繪 了 15天後的進展(實施例16)。附圖 6 附圖6以照片顯示一位患者在分層植皮後通過用一次性施用引入根據本發明的 水凝膠中的3，000IU EPO(實施例17)治療熱傷的癒合進程。發明詳述可以確定，過局部施用ΕΡ0，特別是以以上或以下詳細描述的凝膠狀配製劑形式， 特別是以纖維素為基礎的水凝膠，例如燒傷、燙傷或疾病引起的創傷後的皮膚再生可以達 到迅速的缺損封閉。此外，通過局部給予epo決定性地促進了創傷區的上皮再生。這可從 達到更高的上皮層厚看出(附圖4)。這僅在刺激皮膚實質部分儘可能快速地形成時出現。此外可以觀察到，血管網的形成也通過局部施用EPO啟動，但是其中這也伴隨出 現局部實質的形成，與已知的教導相反，通過EPO引起的創傷癒合過程首先通過刺激形成 血管的細胞而啟動，即EPO刺激內皮細胞和其前體細胞的結果是，EPO僅導致血管形成而實 質組織的形成不直接出現且最佳情況下延遲出現。然而，本發明的結果明確地顯示，血管細胞的形成與局部化的組織形成至少被同 時協調。此外，根據本發明可以確定，通過局部施用epo在新上皮組織的邊界區發現組織 特異性的前體細胞增多，其是巢蛋白陽性細胞。因此在該區域內的神經元幹細胞也被刺激， 這解釋了在創傷癒合中改善的皮膚敏感性。對於根據本發明的配製劑，優選使用重組紅細胞生成素，如商購可得的那些。但 根據本發明也可以使用開發的epo衍生物，以便相比天然epo延長活性物質在血液或血 清中的半衰期。這些epo衍生物可以針對局部應用使用，但是這不是強制必需的，因為根 據本發明的凝膠狀配製劑相對於一般epo發揮特有的保護作用。屬於此類的有例如聚乙 二醇化epo，以糖基化形式的經修飾的epo(例如Aranesp )，甲矽烷基化的epo，或者 與其它多肽或免疫球蛋白片段(例如與抗體的fc部分)相融合的epo(例如已知於wo 02/49673或wo 01/02017)。此外，也可以使用生物有效的合成epo肽-模擬物(如已 知於例如 w096/40749，wo 96/40772, wo 01/38342, wo 01/091780, wo 2004/101611, wo 2004/100997，wo 2004/101600, wo 2004/101606 和 w02006/050959 中的那些)。由於這些 模擬物通常其胺基酸鏈明顯較短，並且因此一般來說顯示更快地降解，它們通過根據本發 明的配製獲得必需的和足夠的穩定化。在已知的EPO全身應用中，所述活性物質通常以每劑介於150和300IU( = IE)/kg 體重(KGW)施用。在顯著更高的劑量的情況下不期望的副作用佔優勢。在成人(70kg)的情 況下這相當於介於10，500和31，500IU EPO/劑。反過來，這相當於大約80至250 μ gEPO/ 劑(13，000U-100 μ gEPO)。在根據本發明局部應用於皮膚受傷的情況下，藉助於根據本發明的配製劑或凝
12膠，每劑可以應用明顯較高的EPO量，而不出現明顯的副作用。例如在相應的大創傷(例如 300cm2)的情況下可以使用相當於在全身給藥的情況下約6500IU/kg體重(KGW)的EPO量。 這樣的EPO量全身施用是不再容許的。視傷口的大小和用於創傷面積的凝膠的量和每g凝 膠中EPO的含量而定，所需EPO的總量明顯變化。通常可以根據本發明設定對於(不同大小)的創傷的一次性處理所需的EPO量作 為劑量。因為創傷不僅通過其面積，而且任選地通過其深度來界定，因此必要活性物質的劑 量可以顯著變化，因為創傷優選用本發明的配製劑填充。如果設定成人的體重為70kg，則對於創傷癒合提供例如以下的值50-500IU/KGW — 3500-35，000IU EPO 每劑或創傷和創傷大小；50-150IU/KGW — 3500-10，500IU EPO 每劑或創傷和創傷大小；100-500IU/KGW — 7500-35，000IU EPO 每劑或創傷和創傷大小；150-300IU/KGW — 10, 500-21，000IU EPO 每劑或創傷和創傷大小.從表1可以看出，與這些值相應的創傷大小和凝膠濃度。低EPO單位優選用於具有約5-20cm2的創傷面積的小傷口，而對於具有約IOOcm2 或更大的面積的創傷面積可使用較高的值。在具有例如IOcm2的面積的創傷面積的情況下， 根據本發明可以使用介於約500和15，000IU的EPO量。在具有例如約IOOcm2的面積的創 傷的情況下約5000-150，000IU的EPO是必需的。這表明，根據本發明應在創傷上施塗平均 約50-1500IU的EPO/cm2的創傷面積，優選75-450IU的EPO/cm2，用於創傷的上皮再生和缺 損封閉。當然在特定的條件下上下明顯地超過或低於所提及的值。以上提及的值基於100_500IU/g凝膠配製劑，特別是100_300IU/g凝 膠配製劑，優選150-200IU/g凝膠配製劑的EPO含量。具體地，每克配製劑基體 (Formulierungsgrundlage)，根據本發明使用以下範圍的EPO量100IU/g 凝膠 _300IU/g 凝膠，100IU/g 凝膠 _150IU/g 凝膠，100IU/g 凝膠 _200IU/g 凝膠，100IU/g 凝膠 _250IU/g 凝膠，150IU/g 凝膠-200IU/g 凝膠，150IU/g 凝膠 _250IU/g 凝膠，150IU/g 凝膠-300IU/g 凝膠，200IU/g 凝膠 _250IU/g 凝膠，250IU/g 凝膠 _300IU/g 凝膠。通常，在成人中視傷害而定，使用約0. 5至約5g，優選l_3g，特別是Ig根據本發 明的凝膠每平方釐米(cm2)創傷面積。然而可以在上下兩方面超過或低於該濃度。特別是 使用以下的凝膠濃度範圍0. 5g凝膠/cm2-2. Og凝膠/cm2，0. 5g凝膠/cm2-l. Og凝膠/cm2， l.Og 凝膠/cm2-2. Og 凝膠/cm2。因此，根據本發明的配製劑，每劑量，相應於創傷大小和每克配製劑基體的EPO 量，例如包含約以下量的EPO(IU)或在表1中說明的量的EPO 2000IU,3000IU,4000IU,5000IU,6000IU,7000IU,8000IU,9000IU,10, 000IU, 12，000IU,15，000IU，20, 000IU，25, 000IU，30, 000IU，35, 000IU，40, 000IU，45, 000IU, 55，000IU,60，000IU,70，000IU,80，000IU,90，000IU,100，000IU,120，000IU,135，000IU, 150，OOOIU 和 180，OOOIUo表1:(A)0. 5g凝膠/cm2創傷面積
1權利要求
紅細胞生成素或者其生物等效衍生物或類似物(EPO)之一以使活性物質穩定並被均勻釋放的製藥學聚合的粘性配製劑形式用於製備局部應用藥物的用途，所述局部應用藥物通過有目的地刺激非血管前體細胞的組織特異性前體細胞和非內皮細胞的成熟組織特異性細胞，並且所述細胞在每種情況下區域特異性地繁殖於創傷皮膚的直接創傷區，用以創傷皮膚的缺損封閉和/或創傷皮膚的上皮再生。
2.根據權利要求1的用途，其特徵在於，所述局部應用的EP0不導致或很大程度上不導 致刺激全身在血液循環中的血管的或內皮的前體細胞。
3.根據權利要求1-2之一的用途，其特徵在於，所述通過局部應用的EP0刺激的細胞不 表達或僅少量表達CD31抗原。
4.根據權利要求1-3之一的用途，其特徵在於，在相同條件下，相比通過相應的不含有 EP0的配製劑，上皮再生快20至50%。
5.根據權利要求1-4之一的用途，其特徵在於，所述局部應用EP0刺激角化細胞和/或 髮根細胞和/或結締組織細胞的分化和生長。
6.根據權利要求1-5之一的用途，其特徵在於，所述局部應用EP0額外地刺激直接創傷 區中的CD90陽性細胞和/或巢蛋白陽性細胞的分化和生長。
7.根據權利要求6的用途，其特徵在於，通過所述局部應用EP0刺激直接創傷區中的神 經細胞和/或神經元前體細胞的分化和生長。
8.根據權利要求1-7之一的用途，其特徵在於，通過局部應用EP0刺激創傷周邊區域中 較深組織層的相應前體細胞。
9.根據權利要求1-8之一的用途，其特徵在於，使活性物質穩定的並使其均勻釋放的 藥物配製劑包含凝膠狀且粘性的親水聚合物並且將所述配製劑直接施塗於創傷區。
10.根據權利要求9的用途，其特徵在於，所述含有粘性的/凝膠狀的EP0的溶液或配 製劑基於至少一種膨脹性多糖。
11.根據權利要求10的用途，其特徵在於，作為膨脹性多糖使用至少一種羥烷基纖維 素和/或一種羧烷基纖維素。
12.根據權利要求10或11的用途，其特徵在於，所述配製劑或溶液具有0.5-4. 0重 量％的成凝膠劑。
13.根據權利要求12的用途，其特徵在於，所述膨脹的或聚合的配製劑的粘度為 5，000-100，OOOmPa x s。
14.基於具有至少20，OOOmPAx s的總粘度的至少一種形成凝膠的親水聚合物的粘性 配製劑，其包含紅細胞生成素或其生物等效衍生物或類似物(EP0)，並且能夠將它們均勻地 釋放到親水的周圍環境中。
15.根據權利要求14的粘性配製劑，其特徵在於，其具有40，000至60，OOOmPAx s的 總粘度°
16.根據權利要求14或15的粘性配製劑，其特徵在於，具有選自下組的多糖羥烷基 纖維素和/或羧烷基纖維素以及基於聚丙烯酸酯或聚氨酯的疏水性聚合物基質。
17.基於至少一種形成凝膠的膨脹性多糖的凝膠狀的或粘性配製劑，所述多糖選自羥 烷基纖維素和/或羧烷基纖維素，其特徵在於，其包含含有紅細胞生成素或其生物等效衍 生物或類似物(EP0)。
18.根據權利要求17的配製劑，其通過將以凍幹、溶解或懸浮形式的EP0與預先膨脹的 具有低於5，000mPa x s的粘度的多糖混合併引發完全膨脹而獲得。
19.根據權利要求17或18的配製劑，完成膨脹的多糖具有從5，000至100，OOOmPax s的粘度。
20.根據權利要求19的配製劑，其特徵在於，粘度為20，000至60，OOOmPax s。
21.根據權利要求16-20之一的配製劑，其特徵在於，所述多糖以從0.4至4重量％的 濃度使用。
22.根據權利要求21的配製劑，其特徵在於，所述多糖的濃度為2-3重量％。
23.根據權利要求16-22之一的配製劑，其特徵在於，所述多糖選自下組的一個或多個 成員一羥乙基纖維素一羥甲基纖維素一羧乙基纖維素一羧甲基纖維素。
24.根據權利要求23的配製劑，其特徵在於，使用可聚合的羥乙基纖維素和/或羧甲基 纖維素。
25.根據權利要求14-24之一的配製劑，其特徵在於，其包含濃度為100-500IU/g凝膠 狀配製劑的EP0。
26.根據權利要求25的配製劑，其特徵在於，使用具有所定義的EP0濃度的0.5-5. 0g 凝膠狀配製劑/cm2。
27.根據權利要求26的配製劑，其特徵在於，成凝膠劑為羧甲基纖維素並存在150IU EP0/g凝膠狀配製劑，其中使用lg凝膠/cm2。
28.根據權利要求14-26之一的配製劑，其特徵在於，使用50-1，500IUEPO/cm2創傷面 積，優選75-450IU EP0/cm2創傷面積。
29.根據權利要求14-28之一的配製劑，其特徵在於，其額外地包含至少一種其它活性 物質。
30.根據權利要求29配製劑，其特徵在於，所述額外的活性物質具有抗菌、抗病毒、抗 真菌或抗炎的作用或為蛋白酶抑制劑。
31.根據權利要求14-30之一的配製劑，其額外地包含至少一種合成的共聚物。
32.根據權利要求14-31之一的配製劑，其特徵在於，其被引入固體載體基質之中或之 上，所述固體載體基質導致EP0均勻地釋放入創傷皮膚的創傷區。
33.根據權利要求32的配製劑，其特徵在於，所述固體載體基質為三維結構的貼劑。
34.根據權利要求14-33之一的配製劑用於製備用於局部或區域性治療患病的皮膚和 皮膚創傷癒合的藥物的用途。
35.根據權利要求34的用途，其用於燒傷、慢性局部缺血性創傷的治療和癒合並用在 牙科領域。
36.根據權利要求34或35的用途，其用於創傷皮膚或黏膜的缺損封閉和/或上皮再生。
37.試劑盒，其包含至少兩個包裝單元，其中第一個包裝單元具有至少一種在完全膨脹後總粘度至少為20，OOOmPA x s的能夠形成凝膠的親水性聚合物或單體，且第二個包裝單 元包含這樣的量的凍幹、溶解或懸浮形式的紅細胞生成素(EP0)，所述量在與第一個包裝單 元的聚合物混合後提供的EP0濃度為100-500IU/g完全膨脹的聚合物。
38.根據權利要求37的試劑盒，其特徵在於，聚合物是預先膨脹的並在預先膨脹的形 式下具有低於5，OOOmPa x s的粘度。
39.根據權利要求37或38的試劑盒，其特徵在於，其具有包含液體的第三個包裝單元， 用該液體納入第一個包裝單元的聚合物/單體和第二個包裝單元的EP0，以便產生適於皮 膚疾病情況下局部應用的含有EP0的粘性凝膠。
40.根據權利要求37-39之一的試劑盒，其特徵在於，作為聚合物，選擇下組的一個或 多個成員的多糖一羥乙基纖維素一羥甲基纖維素一羧乙基纖維素一羧甲基纖維素。
全文摘要
本發明涉及紅細胞生成素(EPO)的用途，特別是EPO在使活性物質穩定的基於聚合物的藥物製劑中用於創傷皮膚的治療，特別是用於機械或病理損傷或者燒傷的創傷癒合。本發明也特別涉及特定的特別是基於多糖(優選纖維素衍生物)的粘性的或凝膠狀的配製劑，其包含EPO並能夠使其穩定，且緩慢和均勻地在創傷處釋放。
文檔編號A61L15/38GK101951944SQ200880123283
公開日2011年1月19日 申請日期2008年12月20日 優先權日2007年12月28日
發明者A·巴德爾 申請人:黑羅伊斯庫爾策有限公司