一種整合缺陷型慢病毒載體、其製備方法及應用與流程

2023-08-07 04:02:26

本發明涉及醫學生物技術領域，尤其涉及一種整合缺陷型慢病毒載體、其製備方法及應用。

背景技術：

基因治療技術在當代越來越具有主要地位。但是基因治療的技術手段有很大的局限。而慢病毒載體的出現有望突破常規載體的瓶頸，慢病毒載體是目前基因治療與基因遞送中應用最廣泛有效的工具。

以1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)為基礎構建的慢病毒載體具有可感染非分裂細胞、免疫反應小、攜帶的基因片段容量大和可整合進宿主基因組而長期表達等優點，慢病毒載體能夠容納多達8kb的外源基因，在體內體外均能高效轉導包括DC細胞在內廣泛的細胞類型，能夠整合外源基因到宿主基因組中引起持續的基因表達，且沒有預存免疫，載體骨架的免疫原性弱，因而成為最理想的基因轉移載體之一。

慢病毒載體在體內應用，其主要挑戰是轉基因整合入宿主基因組所引起的安全問題。傳統的慢病毒三質粒(第1個質粒為含有HIV病毒gag基因和pol基因的包裝質粒；第2個為轉基因質粒，含有HIV包裝信號ψ，反轉錄及整合所需要的長末端重複序列(LTR)和報告基因；第3個質粒表達包膜蛋白)共轉染許可細胞(293FT)，許可細胞提供了病毒增殖裝配的基本環境條件，顆粒的形成主要靠三質粒系統完成。

然而，慢病毒的隨機性整合到靶細胞染色體中也會促使細胞基因組的一些功能基因被沉默或者引起原癌基因插入激活致細胞癌變等嚴重負面影響。作為體內應用，其主要挑戰是轉基因整合入宿主基因組所引起的安全問題。

整合型慢病毒載體的應用不但避免了隨機整合導致插入誘變致癌的危險，而且保持了慢病毒載體的其它優點。此外，在整合慢病毒載體的基礎上通過轉座子引導的定點整合機制可以進一步改造成定點整合慢病毒載體。

技術實現要素：

針對現有技術的不足及實際的需求，本發明提供一種整合慢病毒載體，，證實其整合缺陷特性，大大提高慢病毒載體應用的安全性，為臨床應用奠定基礎。

為達此目的，本發明採用以下技術方案：

一方面，本發明提供一種整合缺陷型慢病毒載體，所述慢病毒載體在pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4846-4848位鹼基編碼的苯丙氨酸突變為丙氨酸和/或在pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4328-4830位鹼基編碼的組氨酸突變為丙氨酸。

具體地，所述慢病毒載體只在pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4846-4848位鹼基編碼的苯丙氨酸突變為丙氨酸，或

所述慢病毒載體只在pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4328-4830位鹼基編碼的組氨酸突變為丙氨酸，或

所述慢病毒載體在pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4846-4848位鹼基編碼的苯丙氨酸和4328-4830位鹼基編碼的組氨酸同時突變為丙氨酸。

本發明中，慢病毒載體在pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4846-4848位鹼基編碼的苯丙氨酸突變為丙氨酸或pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4328-4830位鹼基編碼的組氨酸突變為丙氨酸將其中一位胺基酸進行突變，酶活會下降，而將這兩個位置的胺基酸同時進行突變，酶活大大降低。

優選地，所述苯丙氨酸突變為丙氨酸是通過pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4846-4848位的鹼基由CA突變為GC。

優選地，所述組氨酸突變為丙氨酸是通過pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4828-4830位的鹼基由TT突變為GC。

本發明中，pCMV-dR8.91慢病毒質粒的4846-4848位的鹼基和4828-4830位的鹼基突變後的序列如SEQ ID NO.7所示。

第二方面，本發明提供一種重組慢病毒，如第一方面所述的慢病毒載體與pFUGW表達載體及包膜載體pVSV-G載體進行共轉染哺乳細胞得到的重組慢病毒。

第三方面，本發明提供一種宿主細胞，包括如第一方面所述的慢病毒載體或如第二方面的重組慢病毒；

優選地，所述宿主細胞為293T細胞。

第四方面，本發明提供一種如第一方面所述的慢病毒載體的製備方法，包括如下步驟：

(1)根據序列設計引物，以pCMV-dR8.91慢病毒質粒為模板進行擴增，得到一個突變的基因片段；

任選地，(2)將步驟(1)擴增得到的基因片段作為模板進行擴增，得到具有兩個突變的基因片段；

(3)將步驟(1)或步驟(2)擴增得到的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質粒中，構建重組質粒；

(4)將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆；

其中，所述步驟(2)可選擇性的進行，即只突變一個位點時直接將步驟(1)突變的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質粒中，若同時突變兩個位點時，再進行步驟(2)，將步驟(2)突變的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質粒中。

優選地，步驟(1)所述引物為SEQ ID NO.1-6所示的序列。

所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的上遊引物如下：cagaacgtctcagtaccagttagagaaagaacccata；

所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的下遊引物如下：tactgtgatatttctcagcttcttcttgggcct；

所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的上遊引物如下：aggcccaagaagaagctgagaaatatcacagta；

所述SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的下遊引物如下：ccttttcttttaagcttgtggatgaatactg；

所述SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的上遊引物如下：cagtattcatccacaagcttaaaagaaaagg；

所述SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的下遊引物如下：ttgcagaattccatgtgttaatcctcatc.

優選地，步驟(2)擴增的引物為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6所示的序列。

所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的上遊引物如下：cagaacgtctcagtaccagttagagaaagaacccata；

所述SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的上遊引物如下：ttgcagaattccatgtgttaatcctcatc.

優選地，步驟(3)所述將擴增得到的基因片段連接到pCMV-dR8.91慢病毒質粒的Acc65I和EcoRI克隆位點。

第五方面，本發明提供一種如第一方面所述的慢病毒載體或如第二方面所述的重組慢病毒在製備基因治療藥物中的應用。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

(1)本發明製備的突變後的pCMV-dR8.91慢病毒載體酶活性大大喪失，但不影響轉導效率，更安全更高效；

(2)本發明製備的突變後的pCMV-dR8.91慢病毒載體具有整合性，同整合型慢病毒對比，整合型慢病毒顆粒在第6天還有85％的活性，而本發明的整合缺陷型慢病毒顆粒只有30％；到第21天時，整合型慢病毒顆粒有80％的活性，而本發明的整合缺陷型慢病毒顆粒已經沒有活性了。

附圖說明

圖1是本發明pCMV-dR8.91慢病毒載體圖譜；

圖2是本發明pCMV-dR8.91慢病毒載體4328-4329位的鹼基突變的序列圖；

圖3是本發明pCMV-dR8.91慢病毒載體4846-4848位的鹼基突變的序列圖；

圖4是本發明pCMV-dR8.91慢病毒載體的4328-4329位的鹼基突變陽性克隆測序比對結果；

圖5是本發明pCMV-dR8.91慢病毒載體的4846-4848位的鹼基突變陽性克隆測序比對結果；

圖6是本發明pCMV-dR8.91慢病毒載體PCR二次點突變後的擴增條帶；

圖7是本發明pCMV-dR8.91慢病毒載體在Acc65I/EcoRI限制性內切酶的作用下切成的328+950+10.8K 3個片段；

圖8是本發明慢病毒感染細胞的GFP表達百分比和平均螢光強度，其中，為野生型，為突變型。

具體實施方式

為更進一步闡述本發明所採取的技術手段及其效果，以下結合附圖並通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案，但本發明並非局限在實施例範圍內。

實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可通過正規渠道商購獲得的常規產品。

實施例1：構建突變後的pCMV-dR8.91慢病毒載體

1)pCMV-dR8.91慢病毒載體及要突變的位點，如圖1和圖2所示：

(1)根據已知pCMV-dR8.91慢病毒載體序列設計引物如下：

上遊引物：cagaacggtctcagtaccagttagagaaagaacccata(SEQ ID NO.1)；

下遊引物：tactgtgatatttctcagcttcttcttgggcct(SEQ ID NO.2)；

上遊引物：aggcccaagaagaagctgagaaatatcacagta(SEQ ID NO.3)；

下遊引物：ccttttcttttaagcttgtggatgaatactg(SEQ ID NO.4)；

上遊引物：cagtattcatccacaagcttaaaagaaaagg(SEQ ID NO.5)；

下遊引物：ttgcagaattccatgtgttaatcctcatc(SEQ ID NO.6)

以pCMV-dR8.91慢病毒載體為模板，直接用於第一個突變位點的PCR擴增。

PCR擴增反應體系如下：

其中，引物的濃度為1OD的引物溶於400μL ddH2O，引物為SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6同時進行PCR，總共設置三組反應組，一組以水為樣本的陰性對照。

反應條件如下：

所獲得PCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑑定並用膠回收試劑盒回收純化。將得到的PCR產物再進行第二輪擴增。以第一輪PCR產物為模板，直接用於第二個突變位點的PCR擴增。

PCR擴增反應體系如下：

其中，引物的濃度為1OD的引物溶於400μL ddH2O，設置一組以水為樣本的陰性對照。

反應條件如下：

獲得PCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳鑑定並用膠回收試劑盒回收純化，結果如圖6所示，擴增條帶的大小為1278kb。

2)酶切連接pCMV-dR8.91慢病毒質粒中，構建重組質粒，反應體系如下：

37℃恆溫水浴鍋中反應3h，酶切產物經膠純化回收，pCMV-dR8.91慢病毒載體在Acc65I/EcoRI限制性內切酶的作用下切成的328+950+10.8K 3個片段如圖7所示。

將酶切後的載體與基因進行連接，反應體系如下：

輕輕混勻組分，置於16℃水浴鍋反應2h，得到重組載體。

(2)將重組載體轉化DH5α感受態細胞，挑選陽性克隆進行測序驗證，結果如圖4-5所示，克隆序列與原始序列完全一致。

實施例2：慢病毒的包裝與滴定

(1)將測序獲得的目的突變載體即為pCMV-dR8.91m，然後將pCMV-dR8.91，pCMV-dR8.91m分別與pFUGW表達載體及包膜載體pVSV-G載體進行共轉染293T細胞，轉染後48-72h收上清，上清中分別含有整合型慢病毒顆粒FGR和整合缺陷型慢病毒顆粒FGRm；

(2)將上清3000rpn，離心10min，取上清，用0.45μm的濾器進行過濾；

(3)取100uL檢測感染滴度，取200uL進行拷貝數檢測，取16mL進行無菌檢測，取1mL進行內毒檢測，將剩餘的液體，進行100000G超速離心2h，沉澱用相應的培養基重懸。

得到的重懸液可直接進行後續實驗或-70℃保存，用BIOMERIEUX的Vironostika HIV-1抗原微量ELISA檢測試劑盒進行測定，取慢病毒收穫上清，按產品說明書進行p24抗原定量，同時進行病毒滴度的測定，經過調整為1×109TU/mL。

實施例3：整合缺陷型慢病毒顆粒的整合特性分析

按1×107接種293T細胞於25cm2小方瓶中，次日將同等p24含量的FGR(整合型慢病毒顆粒)和FGRm(整合缺陷型慢病毒顆粒)分別感染293T細胞，感染後會出現GFP的表達，同時設正常細胞對照，感染後的第3、6、9、12和15天等用流式細胞術比較整合和整合慢病毒顆粒感染細胞的GFP表達百分比和平均螢光強度，如圖8所示，可以看出，整合型慢病毒顆粒在第6天還有85％的活性，而本發明的整合缺陷型慢病毒顆粒只有30％；到第21天時，整合型慢病毒顆粒有80％的活性，而本發明的整合缺陷型慢病毒顆粒已經沒有活性。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細方法，但本發明並不局限於上述詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。