一種人血管內皮細胞生長抑制因子嵌合多肽及其製備方法和在靶向性抗腫瘤活性中的應用的製作方法

2023-08-08 00:02:06

專利名稱：：一種人血管內皮細胞生長抑制因子嵌合多肽及其製備方法和在靶向性抗腫瘤活性中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，具體涉及一種人血管內皮細胞生長抑制因子嵌合多肽及其製備方法和在靶向性抗腫瘤活性中的應用。
背景技術：
：惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的頭號殺手，手術、放療和化療是治療腫瘤的常用方法。放療、化療因同時殺傷腫瘤細胞和正常細胞，副作用大，因此尋找特異、高效的腫瘤治療方法一直是腫瘤研究的熱點。腫瘤靶向治療是利用具有一定特異性的載體，將藥物或其他殺傷腫瘤細胞的活性物質選擇性地運送到腫瘤部位，把治療作用或藥物效應儘量限定在特定的靶細胞、組織或器官內，而不影響正常細胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減少毒副作用的一種方法。腫瘤的血管新生(tumorangiogenesis)是一個多步驟的複雜過程，且受控於多種血管生成因子，是血管生成刺激因子與血管生成抑制因子的不平衡調節的結果。"抑制腫瘤新生血管理論，，認為異常活躍的血管新生(Angiogenesis)是胂瘤生長的必要條件(1)腫瘤必須建立新的血管獲取營養以利於其生長和擴散；(2)如果沒有新生血管提供營養，實體瘤的生長不會超過2mm3,並且不會發生轉移和擴散;(3)已經形成的腫瘤在新生血管崩潰後亦發生腫塊崩潰。血管新生4吉才元劑(Antiangiogenicagents,orAngiogenesisinhibitors)通過阻斷腫瘤誘導血管新生的病理過程，在動物腫瘤才莫型試-瞼中，可以觀察到腫瘤體積由較大消退至微小，並可以在藥效範圍內使之保持休眠。腫瘤血管有四大特點，使其成為開發抗癌藥物的一個理想靶標。(l)同處於靜止狀態的正常血管相比，腫瘤血管內皮細胞處於高度活躍的生長狀態，兩4者具有明顯相異的表型，因而選擇性地抑制生長中的腫瘤血管內皮而不損傷靜息的正常血管，使得藥物的副作用小，從而可長期使用；(2)腫瘤血管細胞是從正常組織進入肺瘤的正常細胞，基因組穩定，與基因組極不穩定的癌細胞相比，不容易產生抗藥性；(3)儘管各種腫瘤細胞的基因組和表型差異極大，其血管細胞因為是正常細胞，差異較小，因此針對腫瘤血管的同一藥物理論上對不同肺瘤均有療效；(4)由於一條血管可供養成百上千個腫瘤細胞，因此其作用效率較高。此外，抗血管新生療法只是阻抑新生血管的發生和生長，從而阻止腫瘤的增殖和擴散。正常細胞不會受到影響。血管內皮生長抑制因子(VEGI)是一種新發現的血管新生拮抗劑，由Tan等人於1997年通過篩選人臍靜脈內皮細胞cDNA文庫首先發現的，定位於染色體9q32。VEGI由血管內皮細胞合成，屬於TNF(tumournecrosisfactor腫瘤壞死因子)超家族成員，與TNF超家族其他成員的胺基酸序列同源性為20%-30%，屬II型跨膜糖蛋白，其N端l-25位胺基酸為胞內區和跨膜區，C端29-174為胞外區。完整的成熟蛋白質(VEGI174)由174個胺基酸組成，分子量為22kD。人VEGI基因全長17kb,由四個外顯子和三個內含子組成，通過不同的剪接方式形成三種異構體，分別含有174個(VEGI-174)，192個(VEGI-192)和251(VEGI-251)個胺基酸。研究發現，全長的VEGI-174的可溶性很差，對於體外培養的血管內皮細胞無明顯的抑制作用。而人VEGI的第29-174胺基酸殘基的重組蛋白卻表現出對血管內皮細胞很強的抑制作用。在進一步的研究中，我們發現VEGI不只是特異性的作用於內皮細胞，它對於各種不同的胂瘤才莫型(其中包括乳腺癌、前列腺癌、結腸癌等)都具有顯著的抗腫瘤療效。體外實驗表明，VEGI-192A能顯著抑制牛主動脈內皮細胞與人臍靜脈內皮細胞的增殖，在三種拼接異構體中為最高，而對人冠狀動脈平滑肌細胞以及鼠路易士肺癌細胞LLC等其他類型的細胞無抑制增殖作用。此外，VEGI-192A還能抑制內皮細胞形成血管狀結構。體內實-瞼研究顯示，在鼠路易士肺癌同種移植C57BL/6小鼠腫瘤模型中，系統性腹腔注射VEGI-192A可有效抑制異體移植的肺瘤生長，肺瘤血管化程度顯著降低。且對腎臟、肝臟顯示無毒性。作為血管內皮細胞自分泌的抑制因子，VEGI-192A具有重要的病理生理意義。這說明VEGI有望成為一種廣譜性的腫瘤抑制藥物。整合素是一類膜受體家族，每個成員的分子都是由a、fi兩條鏈(亞單位)靠非共價鍵連接形成的異源雙體跨膜蛋白。現已經發現有18種a亞單位和8種J3亞單位。整合素通過與相應配體結合介導細胞與基底膜、細胞與細胞的粘附，還作為細胞內外信息傳遞的橋梁。目前已知的24種整合素中，大部分與配體結合是通過識別配體所含的RGD序列。雖然，不同的整合素都能以一定的親合力與含RGD的配體結合，但是不同的整合素還是能夠區分出各自不同的配體。在一些腫瘤細胞或者腫瘤新生血管內皮細胞常特異性地高表達某些整合素，如avfi3或ayfi5受體，而正常細胞不表達或表達量很低。整合素avB3在腫瘤新生血管形成、腫瘤生長和轉移過程中發揮重要作用，利用RGD肽竟爭結合整合素，可以抑制腫瘤遷移和肺瘤新血管生成，因此這類受體可以作為一類新的腫瘤治療靶點。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，細胞外基質(ECM)和血液中的粘附蛋白是人體中最常見的含RGD序列的蛋白，主要包括纖維蛋白(fibrinogen,Fg)、層粘連蛋白原(vitronectin,Vn)、膠原(collagen)等。研究發現，大部分整合素與其配體的結合過程，是通過識別配體中所含的RGD序列來完成的(PierschbacherMD,etal.Nature,1984，309:30—33;RuoslahtiE.MatrixBiol,2003，22(6):459-465.)。作為整合素和其配體相互作用的識別位點，介導細胞與細胞外基質及細胞之間的相互作用。腫瘤細胞或者新生血管可以特異表達某些整合素如avB3，能以一定的親和力結合RGD肽，成為胂瘤治療的新靶點。因此，RGD肽在腫瘤治療中的應用已成為研究熱點。RGD肽可以誘導腫瘤細胞凋亡且作為載體在腫瘤靶向治療中發揮重要作用。目前，通過噬菌體表面展示技術，篩選出了一類與整合素aA特異性結合的RGD肽，即ACDCRGDCFCG(RGD-4C),這類RGD肽可以作為腫瘤靶向載體，特異性地引導抗腫瘤藥物到達腫瘤部位。RGD肽在腫瘤顯像、6抑制腫瘤血管形成、腫瘤基因靶向治療等方面有著廣泛應用將TNF-a和含RGD的多肽ACDCRGDCFCG融合後，RGD多肽結合avB3的能力沒有減低，同時TNF-a的抗腫瘤特性也得到增強，更重要的是發揮了RGD多肽的靶向性，減少了TNF-a單獨使用的副反應。有研究顯示將通過噬菌體庫篩選的與avI33高親和力的RGD多肽與抗腫瘤抗體的Fc融合，抑制腫瘤血管生成並且具有乾向治療效果。目前對於VEGI蛋白的三維立體結構、作用機理和藥理學性質沒有完整清晰的了解，需要構建靶向性更強的嵌合重組蛋白，並檢測其生物學活性，研究融合蛋白體外誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長的能力，並檢測其與腫瘤細胞的結合特性，鑑定其胂瘤靶向性，深入探討利用VEGI蛋白構建的重組蛋白的體內輩巴向抑瘤活性及腫瘤治療的應用前景。
發明內容為了克服上述技術缺陷，本發明提供了一種人血管內皮細胞生長抑制因子嵌合多肽，具體指RGD-VEGI-192A嵌合多肽，同時提供了該嵌合多肽的製備方法和在革巴向性抗腫瘤活性中的應用，為RGD-VEGI-192A嵌合多肽作為一種更為有效的臨床藥物開發打下基礎。本發明的具體技術方案如下本發明的一種人血管內皮細胞生長抑制因子的嵌合多肽是人血管內皮細胞生長抑制因子VEGI-192A與RGD-4C多肽相連接而成的RGD-VEGI-192A嵌合重組蛋白。該嵌合多肽具有如SEQIDNO:1所示的編碼核苷酸序列。該嵌合多肽具有如SEQIDNO:2所示的胺基酸序列。上述RGD-4C多肽的胺基酸序列為ACDCRGDCFCG:Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly。本發明還提供了一種上述嵌合多肽的製備方法，包括用上述SEQIDNO:1所示的核苷酸序列構建表達載體，並將該表達載體在宿主細胞中誘導表達的步驟。進一步，本發明還提供了一種上述嵌合多肽的製備方法，通過RT-PCR從人臍l爭脈血管內皮細胞總RNA擴增得到RGD-VEGI-192A目的基因片段，將ACDCRGDCFCG多肽和VEGI-192A的N端融合，使用限制性內切酶雙酶切取目的基因，連接至表達載體pET-30a中構建重組蛋白RGD-VEGI-192A表達載體，插入位點5，端含有編碼ACDCRGDCFCG多肽的核苷酸序列，3'端含有編碼6個組氨酸的核苷酸序列。再轉化至大腸桿菌宿主菌中誘導表達，最後純化蛋白。ACAAAGGGCCGTCT-3，，5，-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3，,所述上遊引物和下遊引物均含有5'端的Ndel限制性酶切位點以及3，端的BamHI限制性酶切位點。優選的，所述的大腸桿菌宿主菌為OrigamiB(DE3)。優選的，所述的誘導方法採用pETT7RNA聚合酶複合自動誘導。優選的，所述的純化方法採用鎳離子金屬螯合親和層析。上述人血管內皮細胞生長抑制因子RGD-VEGI-192A的嵌合多肽可以應用在^^向性抗腫瘤中。本發明具有如下有益效果本發明的一種人血管內皮細胞生長抑制因子RGD-VEGI-192A的嵌合多肽是一種新型血管新生拮抗劑。以整合素avB3為腫瘤靶點，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，VEGI-192A蛋白為抗腫瘤效應分子，RGD-VEGI-192A嵌合蛋白體內靶向性抑瘤活性更強，在腫瘤等血管新生性疾病中具有巨大的潛在治療價值。同時，本發明豐富了VEGI-192A在肺瘤治療中的應用形式，為腫瘤靶向治療提供了新思路，為RGD-VEGI-192A嵌合多肽作為一種更為有效的臨床藥物開發打下基礎。8下面將結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。圖1是本發明PCR擴增RGD-VEGI-192A目的基因的一個優選實施例的電泳圖2是本發明酶切鑑定重組質粒所得酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳的一個優選實施例的電泳分析圖3是本發明自動誘導表達系統中高表達克隆的篩選獲得的8個克隆菌落裂解液的SDS-PAGE的一個優選實施例的結果圖4是本發明自動誘導表達系統的不同誘導時間表達的蛋白的SDS-PAGE的一個優選實施例的結果圖5是本發明採用7種不同特性的變性劑溶解包含體檢測最佳溶解方案的一個優選實施例的結果圖6是本發明在變性條件下採用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術純化提取重組蛋白的SDS-PAGE的一個優選實施例的結果圖7是本發明純化的目的蛋白的WesternBlotting的一個優選實施例的結果圖8是本發明MTT比色法檢測RGD-VEGI-192A嵌合蛋白體外劑量依賴性抑制牛主動脈內皮細胞增殖的生物學活性的一個優選實施例的結果圖9是本發明MTT比色法;險測RGD-VEGI-192A嵌合蛋白體外劑量依賴性抑制人臍靜脈內皮細胞增殖的生物學活性的一個優選實施例的結果圖10是本發明AnnexinV-FITC/PI染色流式細胞儀檢測RGD-VEGI-192A重組蛋白誘導內皮細胞凋亡的生物學活性的一個優選實施例的結果圖11是本發明採用雞胚絨毛尿嚢血管新生抑制試驗測定RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白體內抑制血管新生活性的一個優選實施例的結果圖12是本發明對BALB/cA-皿de棵鼠皮下接種人乳腺癌細胞MDA-MB9435體內抗胂瘤活性檢測中腹腔注射RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白對體內腫瘤生長抑制的一個優選實施例的曲線圖13是本發明對BALB/cA-nude棵鼠皮下接種人乳腺癌細胞MDA-MB435體內抗腫瘤活性檢測中小鼠體重隨給藥時間變化的一個優選實施例的曲線圖。具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例l:嵌合蛋白RGD-VEGI-192A表達載體的構建通過RT-PCR方法技術從人臍靜脈血管內皮細胞總RNA中擴增，根據SEQIDNO:l所示的VEGI-192A核苷酸序列，將ACDCRGDCFCG多肽和VEGI-192A的N端融合，擴增獲得RGD-VEGI-192A目的基因。PCR上遊引物為5，-AAAGGGCCGTCT-3'，下遊引物為5，-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3'。上下遊引物都含有5'端的NdeI限制性酶切位點以及3'端的BamHI限制性酶切位點。圖1是PCR擴增RGD-VEGI-192A目的基因後，將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析的電泳圖，其中1，2，3，4為PCR產物，M為1Kb梯度DNA分子量標準。圖1的結果顯示擴增得到的產物片段大小在500bp-750bp之間，與RGD-VEGI-192A目的基因的預期片段大小630bp相符。再使用以上兩種限制性內切酶雙酶切取目的基因，最後連接至表達載體pET-30a中構建融合重組蛋白RGD-VEGI-192A表達載體。插入位點5，端含有編碼ACDCRGDCFCG多肽的核苷酸序列，3'端含有編碼6個組氨酸的核苷酸序列。圖2是酶切鑑定重組質粒實驗中，將酶切產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析的電泳圖，其中1,2，3，4,5為pET-30a-RGD-VEGI-192A經NdeI和BamHI雙酶切產物，M為1Kb梯度DNA分子量標準。圖2的結果顯示酶切後的產物除了pET-30a外，還有一段RGD-VEGI-192A的基因片段，在500bp-750bp之間，與RGD-VEGI-192A目的基因的預期片段大小630bp接近。實施例2:RGD-VEGI-192A嵌合蛋白在大腸桿菌中的自動誘導表達及高表達克隆的篩選1.自動誘導採用表達載體pET-30a-RGD-VEGI-192A轉化感受態細胞BL21(DE3)pLysS，隨機挑取8個克隆菌落到3mLLB培養基中，添加卡那黴素至終濃度50嗎/mL,37。C復甦培養過夜。次日離心收集菌體沉澱，通過SDS-PAGE分析重組表達的情況。2.1000x微量金屬溶液:0.05MFeCl3;-0.12MHC1;0.02MCaCl2;0.01MMnCl2-4H20;0.01MZnS04-7H20;0.002MCoCl2-6H20;0.002MCuCl2-2H20;0.002MNiCl2-6H20;0.002MNa2Mo04-5H20;0.002MNa2SeOr5H20;0.002MH3B03.加雙蒸水定量到100mL。3.自誘導表達培養基1%胰蛋白腖(tryptone),0.5%酵母提取物(yeastextract),25mMNa2HP04，25mMKH2P04,50mMNH4Cl,5mMNa2S04，2mMMgS04,0.2xmetals(10|uMFe+9)，0.5%甘油(glycerol)(54mM)，0.05%glucose(葡萄糖)(2.8mM),0.2。/。a-乳糖(a-lactose)(5.6mM)。4.應用高通量SDS-PAGE的方法，從136個克隆菌落中篩選出表達效率最高的8個單菌落。圖3是自動誘導表達系統中高表達克隆的篩選獲得的8個克隆菌落裂解液進行的SDS-PAGE結果圖，其中1至8為高表達克隆菌落組，C為轉化了空質粒栽體的克隆菌落組，M為蛋白質分子量標準(kD)，宿主菌為OrigamiB(DE3)。在進行後續表達、純化工作的同時低溫-80。C保種已篩選出的克隆菌落。SDS-PAGE後應用凝膠掃描軟體分析目的蛋白表達量佔到總菌體蛋白的50%。實施例3:自動誘導表達系統的條件優化1.宿主菌優化為改善RGD-VEGI-192A嵌合蛋白的可溶性，我們採用BL21(DE3)pLysS和OrigamiB(DE3)兩種宿主菌，其中OrigamiB(DE3)宿主菌tncB和gor基因有突變，從而為重組蛋白在宿主菌中提供均衡氧化還原勢，以利於蛋白的正確空間摺疊。根據上述圖3的結果，在兩種宿主菌中自動誘導RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重組蛋白的產量相差不大，但是在宿主菌OrigamiB(DE3)中自動誘導體系中背景雜蛋白較稍小，所以我們最終選擇宿主菌為OrigamiB(DE3)的#l號高表達克隆菌落，培養時間為16h,培養溫度為25。C，採用自誘導培養系統高密度培養來製備目的蛋白。2.誘導溫度優化在10。C、25°C、37。C三種溫度下，自動誘導下大量表達RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重組蛋白，並以包含體形式回收RGD-VEGI-192A嵌合蛋白。由結果可知誘導溫度越低，高活性的RGD-VEGI-192A嵌合蛋白(以二聚體或多聚體形式存在)越多。綜合產量和活性考量，我們選擇25。C誘導條件。3.誘導時間優化在以下六個時間點2h,4h，8h,12h，16h，24h,分別收集菌液用裂解緩衝液裂解細菌進行SDS-PAGE電泳-險測目的蛋白誘導產量。結果見圖4,圖4中BSA加樣量為2pg,M為蛋白質分子量標準，宿主菌為OrigamiB(DE3)。由此圖可知，誘導時間為16h就可以得到較高產量。實施例4:重組蛋白的純化與復性1.首先用7種不同特性的變性劑溶解包含體。圖5是採用7種不同特性的變性劑溶解包含體檢測最佳溶解方案。l至7分別表示為1:1%TritonX-100;2:0.1%TritonX-100;3:CHAPS(3-[(3-膽醯氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽)；4:PBS;5:Non-detergentsulfobetaines-195(1-(3-磺丙基)吡啶內嗡鹽-195);6:8M尿素(Urea);7:4M尿素(Urea)，M為蛋白質分子量標準(kD)，宿主菌為OrigamiB(DE3)。由圖5得出最佳溶解方案為利用8mM尿素溶解細菌和包涵體。由圖5可知，選用8M尿素作為變性劑較好。2.採用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術純化提取重組蛋白1)取誘導培養的菌液，15000r/min，lmin離心收集菌體沉澱；加入1/100倍細菌培養液體積的細菌裂解液重懸細菌，15000r/min,lmin離心，收集上清液；2)在第1)步中收集到的上清液中加入1Z4倍細菌培養液體積的50%Ni-NTAHis.Bind層析劑，然後將混合液放到搖床上，室溫下混合60min。(為了達到更好的結合效果，可以混合更長時間，不過如果時間很長的話，應在冰上操作，避免蛋白的降解)。將混合物裝柱，待柱料沉降完全後，收集剩餘lmL上清，用於SDS-PAGE分析。3)用4mL洗滌液洗滌層析柱，流速約28-30滴/min，共洗滌8次，收集每次洗滌液從層析柱流出的液體，用於SDS-PAGE分析。4)用0.5mL洗脫液洗脫目的蛋白，流速約28-30滴/min，共洗脫8次，收集每次洗滌液從層析柱流出的液體，用於SDS-PAGE分析。利用8mM尿素溶解細菌和包含體，採用Ni-NTA柱親和層析技術對收集的重組蛋白包含體溶解液進行純化。SDS-PAGE結果顯示，N產-NTA親和層析柱與目的蛋白的結合能力很強，所以過柱後的流出液中幾乎無目的蛋白。鑑於我們的蛋白產量非常高，所以洗滌4次。洗脫的結果4艮好，SDS-PAGE結果顯示為電泳單帶，沒有其它的雜蛋白條帶，結果見圖6。圖6是在變性條件下採用Ni-NTA柱金屬螯合親和層析技術純化提取重組蛋白的電泳圖。Wl至W4為四次洗滌液點樣，El至E12為十二次洗脫液點樣，FT為過柱後流出液，BSA加樣量為2ng，M為蛋白質分子量標準(kD)，宿主菌為OrigamiB(DE3)。3.重組蛋白的透析復性透析復性緩沖液(50xDialysisbuffer):購自Novagen公司，使用時稀釋成lxDialysisbuffer;lmol/LDTT:購自Novagen公司；30%十二烷基月幾氨酸鈉溶液(N-lauroylsarcosine):購自Novagen公司；透析液A:1xDialysisbuffer,加入DTT至終濃度0.1mmol/L;透析液B:1xDialysisbuffer;透析液C:lxDialysisbuffer,加入1mmol/L還原型穀胱甘肽和0.2mmol/L氧化型穀胱甘肽。利用8mol/L尿素強變性劑保持蛋白的溶解性，在透析過程中使變性蛋白逐漸自然復性。將含有目的蛋白的洗脫液按比例用去離子水稀釋，加入4mol/L尿素溶液，裝入上述經過預處理的透析袋中。取50倍於蛋白稀釋體積的透析液A,4'C透析3小時，更換透析液A繼續透析3小時。然後用透析液透B析3小時，更換透析液B繼續透析3小時。取25倍於蛋白稀釋體積的透析液C,4。C透析過夜。收集透析後蛋白，離心收集上清液。通過SDS-PAGE分析透析結果。對該純化蛋白應用NovagenRefolding試劑盒結合陰離子交換樹脂的方法進行復性，成功建立了針對RGD-VEGI-192A的穩定的復性方法，獲得可溶性的重組蛋白，復性得率約為60%。實施例5:WesternBlot鑑定目的蛋白SDS-PAGE只能從分子量上去推測得到的是目的蛋白，要進一步確定得到的是目的蛋白，需要進行WesternBlotting檢測，所以我們對製備的RGD-VEGI-192A嵌合蛋白進行WesternBlotting分析，結果證明我們純化提取的重組蛋白即為RGD-VEGI-192A嵌合蛋白，見圖7。圖7是鑑定目的蛋白的WesternBlotting結果，RGD-VEGI-192A為純化得到的重組蛋白。Westernblotting實驗方法將蛋白質樣品進行SDS-PAGE,待溴酚藍跑出膠後停止電泳；準備好兩張3M濾紙和一張PVDF膜，浸入曱醇去離子水5分鐘，然後與專用濾紙和纖維墊浸泡於lx轉膜緩衝液中；剝下凝膠，去掉濃縮膠部分，並把濾紙和PVDF膜裁成凝膠大小；按照三明治夾心法轉膜，安置次序如下負極-纖維墊-l張專用濾紙-凝膠-PVDF膜-l張專用濾紙-纖維墊正極板，將其放入轉膜槽中；水浴，300mA轉膜l小時；取出PVDF膜，封閉液封閉2小時；一抗孵育2小時；回收一抗，TBST洗膜，每次15min，重複3次；二抗孵育45-60min;回收二抗，TBST洗膜，每次15min,重複3次；在暗房用ECL顯色液顯色。實施例6:濃度和純度的檢測1.純度檢測SDS-PAGE法檢測，96%單體，4%為多聚體。多聚體中95%14為二聚體，3%為三聚體及多聚體。應用透析法復性，並採用液相層析法去除內毒素。以鱟試劑法檢測每批次蛋白內毒素濃度均小於5EU/mg。2.濃度檢測採用BCA蛋白定量法對提取純化的RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重組蛋白定量，得到定量標準曲線圖及濃度公式Y^.0521X+0.0357,相關係數W達到0.999,結果準確度非常高。由此計算出獲取RGD-VEGI-192A嵌合蛋白重組蛋白最大產量達80mg/L(最佳產量菌抹#1號克隆)。實施例7:RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白的體外劑量依賴性抑制內皮細胞增殖的生物學活性比較1.細胞培養牛主動脈內皮細胞(ABAE)培養於含5%胎牛血清、2mML-穀氨醯胺、O.lmM非必需胺基酸、10mMHepes(羥乙基哌秦乙硫磺酸溶液)、100IU/mL青黴素和100iag/mL鏈黴素的DMEM完全培養基中，置於37"、5%C02孵箱中孵育培養；傳代時用含0.02。/。EDTA的0.05%胰酶消化，以DMEM完全培養基終止消化。人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)培養於含20%胎牛血清HESFM培養基中，置於37。C、5%<302孵箱中孵育培養；傳代時用上述胰酶消化，以胰酶抑制劑終止消化。2.MTT比色實驗將人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和牛主動脈內皮細胞(ABEC)細胞消化後計數，按每孔1.(^104個細胞分別接種至96孔細胞培養板中，置於37。C、5。/。C02孵箱中孵育培養。24h後更換為含不同濃度的rhVEGI-192A重組蛋白以及RGD-VEGI-192A嵌合蛋白的培養基，每個濃度均設3個平行復孔，繼續培養48h。隨後每孔加入5mg/mLMTT溶液20iiL,37。C作用4h,離心後棄上清液，加入DMSO15(VL,振蕩器振蕩10min充分溶解結晶，置酶標儀上測定波長為570nm下的吸光度A值，按以下公式計算抑制率。細胞生長抑制率(％)=(對照組平均A值-實驗組平均A值)/對照組平均A值x100%。對照組即rhVEGI-192A重組蛋白或RGD-VEGI-192A嵌合蛋白濃度為0的培養孔。使用半數抑制濃度(IC5o)計算軟體Bliss，ssoftware計算ICM)，應用SPSS軟體進行數據統計分析。3.結果應用MTT比色試驗法測定rhVEGI-192A重組蛋白和RGD-VEGI-192A嵌合蛋白對內皮細胞生長增殖的抑制活性，結果見圖8和圖9。圖8是MTT比色法檢測重組蛋白RGD-VEGI-192A體外劑量依賴性抑制牛主動脈內皮細胞增殖的生物學活性。圖9是MTT比色法4企測重組蛋白RGD-VEGI-192A體外劑量依賴性抑制人臍靜脈內皮細胞增殖的生物學活性。比較RGD-VEGI-192A嵌合蛋白與rhVEGI-192重組蛋白抑制內皮細胞生長的活性，發現，前者比後者強一倍左右。RGD-VEGI-192A嵌合蛋白對HUVEC細胞系ICso為0.396382嗎/mL,對ABAE細胞系1〔50為0.0791472嗎/mL。rhVEGI-192重組蛋白對HUVEC細胞系IC50為0.566185|ug/mL,對ABAE細胞系ICso為0.100979昭/mL。實施例8:AnnexinV-FITC/PI染色檢測RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白誘導內皮細胞凋亡效果的比較使用A皿exinV細胞染色分析檢測細胞早期凋亡指標。在正常細胞中，磷脂醯絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂醯絲氨酸由脂膜內側翻向外側。AnnexinV是一種的Ca"依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂醯絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂醯絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將A皿exinV進行螢光素FITC標記，以標記了的AnnexinV作為螢光探針，利用螢光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細月包膜而使細胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配j吏用，就可以將處於不同凋亡時期的細胞區分開來。AnnexinV-FITC/PI染色方法將HUVEC細胞分別用0.5Mg/mLRGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白蛋白處理後，用細胞刮從培養皿上刮取細胞，lxPBS洗滌細l包二次(2000xrpm離心5min)，收集5xl05個細胞。加入500pL的結合緩衝液懸浮細胞後，加入5pLAnnexinV-FITC混16勻，再加入5^U典化丙錠(PI),混勻，室溫避光反應515min。在lh內，用流式細胞4義;險測，激發波長Ex二488nm;發射波長En^530nm。A皿exinV-FITC的綠色螢光通過FITC通道(FL1)檢測；PI紅色焚光通過PI通道(FL2或FL3)檢測，建議使用FL3。焚光補償調節使用未經凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行螢光補償調節去除光譜重疊和設定十字門的位置。對HUVEC細胞分別用RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白以同等濃度0.5貼/mL處理8小時後，結果顯示，兩種蛋白能夠誘導人臍靜脈內皮細胞HUVEC的凋亡。且RGD-VEGI-192A嵌合蛋白誘導內皮細胞凋亡的能力比rhVEGI-192A重組蛋白的強，在同等濃度同樣時間作用下，前者誘導內皮細胞凋亡細月包所佔比例為後者的一倍左右。見圖10(AnnexinV-FITC/PI染色流式細胞儀檢測RGD-VEGI-192A重組蛋白誘導內皮細胞凋亡的生物學活性的結果圖)。實施例9:RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白的抑制雞胚絨毛象囊膜血管新生生物學活性的比較種蛋孵化第6天，在超淨臺上將蛋胚用酒精消毒後用牙科鑽或砂、輪在蛋胚頂端戳一小口，然後小心地去掉周圍的蛋殼和殼膜，使開口約為1.5cmxl.5cm大小。此時可以看到氣室底部隔著一氣室膜即為尿囊膜(CAM),並且可以清楚地看到CAM膜上血管網的大小和分布位置以及跳動的雞胚心臟。確定加樣部位後小心地用注射針頭從氣室與卵黃分隔處挑破氣室膜，注人1-2滴無菌7jc,使氣室膜與CAM膜分開，然後用鑷子輕輕去除上層的氣室膜，暴露下層的CAM膜。先期準備好樣品，並分為三組PBS對照組，rhVEGI-192A重組蛋白組以及RGD-VEGI-192A嵌合蛋白組，將樣品以10pL體積(均為10mg)拌加到5mmx5mm大小的明膠海綿載體上風乾後，用鑷子輕輕將載樣濾紙置於CAM和卵黃嚢膜處血管較少的部位,然後用滅菌透明膠封口，繼續孵育48h或更長時間。由觀察窗加入曱醇丙酮=1:1的固定液預固定15min，去掉雞胚，取下CAM並與蛋皮分離，完成後固定，將CAM平鋪在平板或濾紙上，解剖鏡下相同放大倍數計數血管，根據直徑分為大、中、小三種血管。以實驗部位邊緣lmm範圍內為一級血管，以實驗部位邊緣5mm處為二級血管，一、二級管血管分別觀察分析。以被檢物為中心，周圍血管放射狀朝向被檢物的生長狀態，稱為血管輻輳。主幹血管向載體盤的彎曲和靠近稱之為血管的吸引。在解剖顯微鏡觀察下，根據血管直徑將血管分為3類dX).lmm為大血管;0.1mm〉dX).05mm為中血管;(K0.05mm為小血管(王蕾，張樹成，吳志套，等，中國藥理與臨床，2000，16(6):46-47)。陽性標準表現出明顯的血管輻輳，以實驗部位為中心，尿嚢膜血管大量向載體生長集中，排列成車輻狀,其中有l條以上中血管或小血管成車輻狀，但同時有中等以上的血管吸引。陰性標準周圍血管形成正常，或血管反應較輕，向載體生長的血管少而細，分布零亂，甚至產生視覺可見的無血管區域。居於二者之間的也定為陰性。血管計數可結合自動圖像分析系統、攝像等技術完成。我們觀察明膠海綿載體周圍lcm範圍內與遠離(大於lcm)位置的血管密度，計算出現血管新生抑制的雞胚數目，數據進行方差分析。表l是重組蛋白rhVEGI-192A及RGD-VEGI-192A對雞胚尿嚢膜一級血管，二級血管的抑制作用的數據方差分析，表2是重組蛋白rhVEGI-192A及RGD-VEGI-192A對雞胚尿囊膜大、中、小血管的抑制作用。圖ll是採用雞胚絨毛尿嚢血管新生抑制試驗測定RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白體內抑制血管新生活性的結果圖。由結果我們發現rhVEGI-192A重組蛋白組以及RGD-VEGI-192A嵌合蛋白組相比較於對照組，大血管數目變化不顯著,血管分支明顯減少,中小血管數目明顯降低,說明兩組蛋白均顯著抑制新生血管生成，且主要抑制中、小血管的新生。同時，我們發現RGD-VEGI-192A嵌合蛋白組相比較於rhVEGI-192A重組蛋白組，大血管數目變化不顯著,血管分支明顯減少較多，中小血管數目明顯降低較多,說明RGD-VEGI-192A嵌合蛋白組抑制新生血管生成的作用更強。表l18tableseeoriginaldocumentpage19表2tableseeoriginaldocumentpage19*P<0.05實施例10:RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白的體內抗腫瘤活性檢測對BALB/cA-nude棵鼠皮下接種人乳腺癌細胞MDA-MB435，分別以20mg/kg劑量重組蛋白rhVEGI-192A以及RGD-VEGI-192A每3天腹腔注射給藥一次，持續28天，觀察並記錄rhVEGI-192A以及RGD-VEGI-192A的體內抑瘤作用。體內抗腫瘤實-驗證明，同劑量的兩種重組蛋白組，與對照組相比，具有明顯的抑制腫瘤生長的作用，同時嵌合了RGD肽的VEGI-192蛋白表現出更高的體內抗胂瘤活性，並且差別有統計學意義。表3是重組蛋白rhVEGI-192A及RGD-VEGI-192A體內抑制肺瘤生長抑制率的數據方差分析。圖12是本發明實施10例對BALB/cA-nude棵鼠皮下接種人乳腺癌細胞MDA-MB435體內抗腫瘤活性檢測中RGD-VEGI-192A嵌合蛋白及rhVEGI-192A重組蛋白對體內胂瘤生長抑制曲線。並且小鼠表徵指標之一的體重隨給藥時間的變化並不明顯，見圖13，圖13是對BALB/cA-皿de棵鼠皮下接種人乳腺癌細胞MDA-MB435體內抗腫瘤活性檢測中小鼠體重隨給藥時間變化曲線圖。初步提示在高劑量長期給藥情況下，表現出毒性較低、安全性較高的特點。19表3tableseeoriginaldocumentpage20最後所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和範圍。序列表中山大學人血管內皮細胞生長抑制因子RGD-VEGI-192嵌合重組多肽21612cDNA人工序列1atggcttgcgactgccgtggtgactgcttctgcggtcaactcacaaagggccgtcttcat60formulaseeoriginaldocumentpage21505560HisPheLysAsnGinPheProAlaLeuHisTipGluHisGluLeu657075GlyLeuAlaPheThrLysAsnArgMetAsnTyrThrAsnLysPhe8085卯LeuLeulieProGluSerGlyAspTyrPhelieTyrSerGinVal95100105ThrPheArgGlyMetThrSerGluCysSerGlulieArgGinAla110115120GlyArgProAsnLysProAspSerlieThrValVallieThrLys125130135ValThrAspSerTyrProGluProThrGinLeuLeuMetGlyThr140145150LysSerValCysGluValGlySerAsnTipPheGinProIITyr155160165LeuGlyAlaMetPheSerLeuGinGluGlyAspLysLeuMetVal170175180AsnValSerAsplieSerLeuValAspTyrThrLysGluAspLys185190195ThrPhePheGlyAlaPheLeuLeu20020權利要求1、一種人血管內皮細胞生長抑制因子的嵌合多肽，其特徵在於，該嵌合多肽是人血管內皮細胞生長抑制因子VEGI-192A與RGD-4C多肽相連接而成的RGD-VEGI-192A嵌合重組蛋白。2、根據權利要求1所述的嵌合多肽，其特徵在於，其具有如SEQIDNO:1所示的編碼核苷酸序列。3、根據權利要求1所述的嵌合多肽，其特徵在於，其具有如SEQIDNO:2所示的氨基酉^f列。4、一種權利要求1所述的嵌合多肽的製備方法，其特徵在於，包括用如SEQIDNO:1所示的編碼核苷酸序列構建表達載體，並將所述表達載體在宿主細胞中誘導表達的步驟。5、一種權利要求1所述的嵌合多肽的製備方法，其特徵在於，通過RT-PCR從人臍靜脈血管內皮細胞總RNA,將ACDCRGDCFCG多肽和VEGI-192A的N端融合，擴增得到RGD-VEGI-192A目的基因片^殳，^f吏用限制性內切酶雙酶切取目的基因，連接至表達載體pET-30a中構建重組蛋白RGD-VEGI-192A表達載體，再轉化至大腸桿菌宿主菌中誘導表達，最後純化蛋白。6、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述RT-PCR中使用的上遊引物和下遊引物分別為5，-TTCCATATGGCTTGCGACTGCCGTGGTGACTGCTTCTGCGGTCAACTCACAAAGGGCCGTCT誦3，，..5，-CGCGGATCCCTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGGTT-3'，所述上遊引物和下遊引物均含有5，端的NdeI限制性酶切位點以及3'端的Bamffl限制性酶切位點。7、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述的大腸桿菌宿主菌為OrigamiB(DE3)。8、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述的誘導方法採用pETT7RNA聚合酶複合自動誘導。9、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述的純化方法採用鎳離子金屬螯合親和層析。10、一種權利要求1所述的嵌合多肽在靶向性抗腫瘤中的應用。全文摘要本發明提供了一種人血管內皮細胞生長抑制因子的嵌合多肽，其嵌合多肽是人血管內皮細胞生長抑制因子VEGI-192A與RGD-4C多肽相連接而成的RGD-VEGI-192A嵌合重組蛋白。上述嵌合多肽的製備方法包括用SEQIDNO1所示的核苷酸序列構建表達載體，並在宿主細胞中誘導表達的步驟。本發明的該嵌合多肽是一種新型血管新生拮抗劑，可應用在靶向性抗腫瘤中，在腫瘤等血管新生性疾病中具有潛在治療價值。同時，本發明豐富了VEGI-192A在腫瘤治療中的應用形式，為腫瘤靶向治療提供了新思路，為RGD-VEGI-192A嵌合多肽作為一種更為有效的臨床藥物開發打下基礎。文檔編號C07K19/00GK101503474SQ20091003770公開日2009年8月12日申請日期2009年3月9日優先權日2009年3月9日發明者何振健,吳珏珩,勳朱,李魯遠,寧王,胡潔萍,潔袁,旭陳,黎孟楓申請人:中山大學