一種1,3-1,4-β-葡聚糖酶突變體的製作方法

2023-08-08 17:36:21

一種1,3-1,4-β-葡聚糖酶突變體的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種1,3-1,4-β-葡聚糖酶突變體，屬於基因工程和酶工程領域。本發明將來源於特基拉芽孢桿菌(Bacillus?terquilensis)的1,3-1,4-β-葡聚糖酶的第20位，117位和165位的賴氨酸通過重疊延伸PCR的方法突變為絲氨酸，分別獲得單突變體K20S，K117S和K165S。將三個突變位點進行整合突變，獲得K20S/K117S/K165S三突變酶。四株突變酶表現出了更高的催化活力及更好的熱穩定性。這些突變酶和野生酶相比更有利於其在工業上的應用。
【專利說明】—種1, 3-1, 4- β -葡聚糖酶突變體

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體，尤其是一種具有更高催化活性和熱穩定性的1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體，屬於基因工程和酶工程領域。

【背景技術】
[0002]β -葡聚糖是存在於禾本科植物細胞壁的一種非澱粉性多糖，在大麥、小麥、大米等經濟類穀物中含量很高。其是由高達上千個β-D-葡萄糖殘基通過β-1，3或β-1，4糖苷鍵線狀排列而成，具有很高的分子量。其可以溶解於水中，形成的溶液黏度很高，這給啤酒行業及飼料行業帶來了諸多不利。在啤酒工業的主要原料麥芽中含有大量β_葡聚糖，未降解的β -葡聚糖存在於麥汁中會導致麥汁黏度過大，造成過濾困難，延長麥醪過濾時間，降低浸出物含量，對於成品啤酒會影響其非生物穩定性。而在生產純生啤酒時，過多β-葡聚糖酶會造成濾膜的膜孔堵塞，過濾能力下降。在飼料行業中，麥類飼料中的葡聚糖無論在人的腸道還是動物的腸道內都不能被直接消化吸收，必須經過酶促降解後才能被利用，且其阻止了有效成分在動物腸道中內的吸收，降低了飼料中有效成分轉化率，是一種抗營養因子，並為微生物特別是致病菌的寄居繁殖提供了豐富的營養造成大量有害微生物在動物腸道內繁殖，引起畜禽腹瀉，同時會競爭性消耗大量物質而降低飼料利用率。
[0003]來源於特基拉芽孢桿菌(Bacillusterquilensis)CGX5-1 的 1，3-1，4_β -葡聚糖酶，簡稱葡聚糖酶。1，3-1，4-β-葡聚糖酶是一類可以在3-0-吡喃葡萄糖位點專一性切割β_葡聚糖為三糖和四糖，這是其工業應用的基礎。在啤酒行業麥汁糖化過程中溫度是從48°C提高至78°C，而飼料行業中烘焙的溫度也在65°C以上。而目前篩選得到的大部分野生1，3-1，4- β -葡聚糖酶的最適溫度主要集中在45°C和55°C，並不能滿足工業上的需求。而催化活性不高也是其不能推廣使用的重要原因。而目前市場上幾家酶製劑公司如諾維信、DMS研發生產的β -葡聚糖酶製劑價格昂貴，而目前國內也有部分酶製劑公司生產β -葡聚糖酶製劑，但其水平遠不及國外酶製劑公司，且β -葡聚糖酶製劑的生產菌種及工藝都是商業機密，國內研發速率緩慢，因此國內市場在很大程度上依然依賴進口。因此，如果能夠提高野生型1，3-1，4- β -葡聚糖酶的催化活性及熱穩定性，獲得高活性高熱穩定的β_葡聚糖酶，那麼就可以降低成本，推廣其在工業上的應用。
[0004]為了提高1，3-1，4-β-葡聚糖酶的熱穩定性，國內外已經進行了一些研究。目前研究發現，I, 3-1，4-β -葡聚糖酶中唯一存在的一對二硫鍵對於蛋白質熱穩定性影響不大。而Glnl、Thr2、Ser5和Phe7的突變大幅度地提高了 β -葡聚糖酶的熱穩定性。對β _葡聚糖酶的雜交結果顯示，將來源於浸麻芽孢桿菌(B.macerans)的前16個胺基酸替換為澱粉液化芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的前16個胺基酸得到的雜交酶H(A16-M)和兩者之間前12個胺基酸進行替換，或刪除Tyrl3形成的雜交酶H(A12-M)-Λ 13在高溫下有很好的穩定性。
[0005]本發明所使用的來源於特基拉芽孢桿菌(B.terquilensis) CGX5-1的野生1，3-1，4-β-葡聚糖酶的最適溫度為45°C，比活力為2490.lU/mg，並不能適應工業應用的要求。因此，進一步提高該酶的催化活力及熱穩定性對其在工業上的應用推廣有重要意義。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體，尤其是一種具有更高催化活性和熱穩定性的1，3-1，4-β -葡聚糖酶突變體。
[0007]所述突變體的胺基酸序列如以下⑴或⑵或(3)或⑷或(5)所示:
[0008](I)SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列，
[0009](2) SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列，
[0010](3) SEQ ID N0.3所示的胺基酸序列，
[0011](4) SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列，
[0012](5)在(I)或(2)或(3)或(4)的胺基酸序列基礎上經過一個或者幾個胺基酸取代、缺失或者添加，且具有1，3-1，4-β -葡聚糖酶活性的胺基酸序列。
[0013]編碼上述突變體的核苷酸序列優選如SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列。
[0014]胺基酸序列如SEQ ID N0.1的突變體是將核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的野生1，3-1，4- β -葡聚糖酶的第20位的賴氨酸Lys突變成絲氨酸Ser。所得突變體命名為K20S。
[0015]胺基酸序列如SEQ ID N0.2的突變體是將核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的野生1，3-1，4-β -葡聚糖酶的第117位的賴氨酸Lys突變成絲氨酸Ser。所得突變體命名為K117S。
[0016]胺基酸序列如SEQ ID N0.3的突變體是將核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的野生1，3-1，4-β -葡聚糖酶的第165位的賴氨酸Lys突變成絲氨酸Ser。所得突變體命名為K165S。
[0017]胺基酸序列如SEQ ID N0.4的突變體是將核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示的野生1，3-1，4- β -葡聚糖酶的第20、117、165位的賴氨酸Lys均突變成絲氨酸Ser。所得突變體命名為 K20S/K117S/K165S。
[0018]本發明的另一個目的是提供一種構建所述1，3-1,4-β-葡聚糖酶突變體的方法，是將來源於B.terquilensis CGX5-1的野生酶基因(SEQ ID N0.9)為模板，採用重疊延伸PCR的方法進行定點突變獲得；得到編碼β -葡聚糖酶突變體的基因的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7或SEQ ID N0.8所示。經過測序鑑定所有突變位點均已成功按照預設目標得到突變，隨後將編碼突變酶的基因片段進行重組表達獲得突變體。
[0019]所述重組表達優選以pET28a(+)為表達載體，以大腸桿菌為表達宿主。
[0020]對於三株葡聚糖酶單突變酶K20S、K117S和K165S的構建方法，優選以野生酶基因為模板，分別將20位、117位和165位的賴氨酸Lys通過重疊延伸PCR的方法突變為絲氨酸Ser。
[0021]對於三突變酶K20S/K117S/K165S的構建方法，優選以K20S單突變酶為模板，通過重疊延伸PCR的方法經過兩步分別將117位和165位賴氨酸Lys突變為絲氨酸Ser。
[0022]本發明要解決的第三個技術問題是提供發酵生產所述1，3-1，4-β -葡聚糖酶突變體的方法，優選以pET28a(+)為表達載體，以大腸桿菌為表達宿主。以TB液體培養基為發酵培養基，重組菌在37°C 200rpm培養至OD6tltl約為1.0，加入0.06mM終濃度IPTG和和8mM終濃度α-乳糖誘導表達，並在24°C 150rpm下培養6h。將所得菌液離心後棄菌體收集上清。上清經過N1-NTA親和層析柱純化以及GEro-1O柱脫去咪唑，得到1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體。
[0023]所述重組菌的活化方法優選在平板上挑取單菌落於含100 μ g/mL硫酸卡納黴素的LB液體培養基，370C 200rpm培養10_12h。
[0024]本發明的有益效果:本發明提供的四株β_葡聚糖酶突變體和野生酶相比，比活力提高了 98.2%;最適溫度由45°C提高到55-60°C;T5Q值由62°C升高至76°C左右；在50°C下的半衰期由95min最高延長至214min，遠遠高於野生酶，提高了 125.3% ;在60°C下的半衰期，由32.5min最多延長至59min，提高了 81.5%。可見突變酶的催化活性和熱穩定性均有所大幅度的提聞，更有利於在工業上的應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1野生酶與四株葡聚糖酶突變體的最適溫度比較；□:野生酶，〇:K20S，Δ:K117S,V:K165S,O:K20S/K117S/K165S。
[0026]圖2野生酶與四株葡聚糖酶突變體的T5tl值比較；□:野生酶，〇:K20S,A:K117S, V:K165S,O:K20S/K117S/K165S。
[0027]圖3野生酶與四株β -葡聚糖酶突變體的在50°C的半衰期比較；□:野生酶，O:K20S,A:K117S, V:K165S, O:K20S/K117S/K165S。
[0028]圖4野生魚四株葡聚糖酶突變體的在60°C的半衰期比較；□:野生酶，〇:K20S,A:K117S, V:K165S, O:K20S/K117S/K165S。

【具體實施方式】
[0029]實施例1突變位點的選擇
[0030]將β-葡聚糖酶的推定胺基酸序列提交至1-TASSER在線伺服器進行同源建模，並將建模得到的PDB文件輸入Voronoia軟體中計算賴氨酸在結構中的位置。從表1可以看出，在β -葡聚糖酶三維結構中，所有12個賴氨酸的平均包裝值處於0.47至0.62之間，均處於蛋白質表面，且具有最高的溶液可及性。這意味著位於蛋白表面的賴氨酸可能對於β-葡聚糖酶熱穩定性有影響。
[0031]表1 β -葡聚糖酶中12個賴氨酸的平均包裝密度值
[0032]

【權利要求】
1.一種1，3-1，4-β-葡聚糖酶突變體，其特徵在於，所述突變體的胺基酸序列如以下(I)或⑵或(3)或⑷或(5)所示: (1)SEQID N0.1所示的胺基酸序列， (2)SEQ ID N0.2所示的胺基酸序列， (3)SEQ ID N0.3所示的胺基酸序列， (4)SEQ ID N0.4所示的胺基酸序列， (5)在(I)或(2)或(3)或(4)的胺基酸序列基礎上經過一個或者幾個胺基酸取代、缺失或者添加，且具有1，3-1，4-β -葡聚糖酶活性的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1所述突變體的基因。
3.攜帶權利要求2所述基因的載體或重組細胞。
4.一種獲得權利要求1所述1，3-1，4- β -葡聚糖酶突變體的方法，其特徵在於，是以野生1，3-1，4-β-葡聚糖酶的基因為模板，採用重疊延伸PCR的方法進行定點突變獲得編碼突變體的基因，隨後將編碼突變體的基因片段進行重組表達獲得突變體。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，對於胺基酸序列分別如SEQID N0.USEQID N0.2,SEQ ID N0.3所示的β -葡聚糖酶單突變體K20S、K117S和K165S的構建，以野生酶基因為模板，分別將第20位、117位和165位的賴氨酸通過重疊延伸PCR突變為絲氨酸。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，對於胺基酸序列如SEQID N0.4所示的三突變體K20S/K117S/K165S的構建，先後將第20位、117位和165位的賴氨酸通過重疊延伸PCR突變為絲氨酸。
7.根據權利要求4-6任一所述的方法,其特徵在於，以pET28a(+)為表達載體，以大腸桿菌為表達宿主。
8.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，以TB液體培養基為發酵培養基，重組菌在37°C培養至OD_ = 0.8-1.0，加入IPTG和α -乳糖誘導表達，將所得菌液離心後棄菌體，收集含有1，3-1，4-β -葡聚糖酶突變體的上清。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，上清經過N1-NTA親和層析柱純化以及GEPD-10柱脫去咪唑， 得到1，3-1，4- β -葡聚糖酶突變體。
10.權利要求1所述突變體在啤酒生產中的應用。
【文檔編號】C12N15/70GK104130988SQ201410351568
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月22日 優先權日:2014年7月22日
【發明者】朱林江, 鈕成拓, 李崎, 李永仙, 王金晶, 劉春鳳, 鄭飛雲 申請人:江南大學