一種檢測肉牛pomc基因單核苷酸多態性的方法

2023-08-08 17:22:21

一種檢測肉牛pomc基因單核苷酸多態性的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態性的方法，以包含POMC基因的待測肉牛全基因組DNA為模版，以引物對P為引物，PCR擴增肉牛POMC基因；用限制性內切酶ScaI消化PCR產物後，再進行瓊脂糖凝膠電泳；根據電泳結果鑑定肉牛POMC基因第5141位的基因型；由於POMC基因功能涉及宰前活重，肌肉嫩度性狀，基因型數據與這些性狀關聯分析後發現：CC型個體在肌肉嫩度和宰前活重方面顯著優於其他個體。以上說明CC基因型可以作為一個提高肉牛宰前活重和肌肉嫩度的候選分子遺傳標記。本發明提供的檢測方法可以用於肉牛生長肉質性狀的標記輔助選擇（MAS），加快良種群的選育。
【專利說明】—種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態性的方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測肉牛POMC基因第5141位單核苷酸多態性的方法。

【背景技術】
[0002]隨著經濟的發展，人們對於牛肉的數量和品質要求日益提高。雖然我國已成為第三大養牛與牛肉生產國，但是高檔大部分依賴於進口。因此提高肉用性能勢在必行，途徑主要有改善飼料營養，加強飼養管理水平和培育優良品種等，而良種是肉牛業發展的先決條件和物質基礎。人們在了解肉用性狀的遺傳規律和相應的生長發育、脂肪沉積等生命活動調控規律的基礎上，結合分子生物學方面的研究，發現了與肉用性狀有密切聯繫的功能基因和主效基因以及和這些基因連鎖的分子遺傳標記，根據目標性狀與候選基因基因型間的關聯性進行選擇，提高了育種方向的準確性，縮短了育種年限。
[0003]單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP),主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP所表現的多態性只涉及到單個鹼基的變異，這種變異可由單個鹼基的轉換(transit1n)或顛換(transvers1n)所引起，也可由鹼基的插入或缺失所致。從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可分為2種:一種是同義cSNP (synonymous cSNP),即SNP所致的編碼序列的改變並不影響其所翻譯的蛋白質的胺基酸序列，突變鹼基與未突變鹼基的含義相同；另一種是非同義cSNP (non-synonymous cSNP),指鹼基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列發生改變，從而影響了蛋白質的功能。這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為非同義cSNP。這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的研究中也具有重要意義。
[0004]分子生物學的發展為分子標記輔助選擇提供了理論基礎和技術支持，通過檢測功能基因某位點的多態性，對不同基因型個體與其生產性能進行關聯分析，找出優勢基因型和優勢等位基因，為選種提供依據，這一過程中檢測多態性和基因分型的準確是很關鍵的。目前主要的方法有PCR-RFLP技術或PCR-SSCP技術結合DNA測序。
[0005] 阿片黑素細胞皮質素原(pro-op1melanocortin, P0MC),也叫「促皮質素前體」，是一種合成於下丘腦神經元中的激素原前體，該基因轉錄翻譯後，經歷了廣泛的和組織特異的翻譯後加工，產生一系列具有生物活性的多肽，由於不同組織中加工酶類型的不同而表達產生不同的多肽。腦垂體促皮質激素細胞產生了促腎上腺皮質激素(ACTH)和β-促脂解素，下丘腦產生α -促黑激素(a -MSH)、β -促黑激素(β -MSH)、Y -促黑激素(Y -MSH)、類促腎上腺皮質激素樣的中間多肽(CLIP)和β_促脂解素，這些物質進一步分解產生Y-促脂解素和內啡呔。其中MSH (促黑激素)與其相應受體MCRs (黑素皮質素受體)相互作用，共同組成了大腦黑皮質素系統，在調節食慾、介導能量代謝途徑中發揮關鍵作用，控制著動物的食物攝取和能量消耗。這些生命活動都將影響生長速度、體組成和脂肪沉積，因此編碼POMC的基因成為影響人類肥胖和家畜肉質性狀的重要基因。本發明提供的檢測方法為POMC基因SNP與肉質性狀關係的建立奠定了基礎，以便用於肉牛肉質性狀的標記輔助選擇(MAS )，快速建立遺傳資源優良的肉牛種群。


【發明內容】

[0006]本發明的目的在於提供一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態性的方法，利用PCR-RELP方法檢測肉牛POMC基因的多態性，並將其與肉質性狀進行關聯分析，驗證是否可以作為肉牛分子育種中輔助選擇的分子標記，從而加快良種選育速度。
[0007]本發明是通過以下技術方案來實現:
一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，以包含POMC基因的待測肉牛全基因組DNA模版，以引物對P為引物，PCR擴增肉牛POMC基因；用限制性內切酶ScaI消化PCR產物後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定肉牛POMC基因第5141位的單核苷酸多態性。
[0008]所述的引物對P為:
上遊引物:5』 -GGTGCCAAATACCTCCTG-3』
下遊引物:5』 -ACAGCCCATTGACAGAACT-3，。
[0009]所述的PCR擴增反應程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s ;60°C退火40s ；72°C延伸30s ;72°C延伸7min ;4°C保存。
[0010]所述的瓊脂糖凝膠電泳為2%瓊脂糖凝膠電泳。
[0011]所述根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定肉牛POMC基因第5141位的單核苷酸多態性為:TT基因型表現為361bp/161bp條帶；TC基因型表現為522bp/361bp/161bp條帶；CC基因型表現為522bp條帶。
[0012]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
本發明根據POMC基因的序列設計引物，分別以8個肉牛品種的基因組DNA為模版，進行PCR擴增，並對PCR產物進行測序，測序後得到肉牛POMC基因的部分序列。與NCBI公布的序列進行比較後，發現在第5141位存在SNP多態性。
[0013]針對上述第5141位的SNP多態性，本發明還公布了其篩查和檢測方法，通過設計特定的引物，PCR擴增目的片段，然後用特定的限制性內切酶酶切鑑定，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態性。
[0014]本發明對8種肉牛品種的SNP基因型進行了檢測和基因型頻率分析，對上述SNP位點與肉牛部分生長性狀(宰前活重、酮體重、屠宰率、淨肉重、大理石花紋評分、眼肌面積、實測背膘厚、嫩度、大腿肉厚、腰部肉厚、酮體長)進行關聯分析，結果表明該位點能夠作為提高肉牛宰前活重和肌肉嫩度的分子標記。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是引物P擴增不同牛個體(牛POMC基因第5141位多態位點)PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖，其中M為600bp Marker, 1-7為PCR產物。
[0016]圖2是本發明中PCR產物混合測序篩查到的牛POMC基因序列第5141為T或C突變測序結果圖。
[0017]圖3是本發明牛POMC基因引物P擴增片段PCR產物的RFLP分析圖。其中1、4、7泳道為 TT 型，2、5、6、8、9、12 泳道為 TC 型，3、10、11 泳道為 CC 型，M 為 600bp Marker。
[0018]

【具體實施方式】
本發明利用PCR-RFLP方法對肉牛POMC基因第5141位突變的單核苷酸多態性進行檢測，下面對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0019]A、肉牛POMC基因第二內含子區域PCR引物的設計
以NCBI所公布的牛(NC_007309.5)序列為參考，利用Primer premier 5.0軟體設計能夠擴增包含肉牛POMC基因第二內含子區域的PCR產物，其引物序列如下:
上遊引物:5』 -GGTGCCAAATACCTCCTG-3』
下遊引物:5』 -ACAGCCCATTGACAGAACT-3』
B、以引物P進行PCR擴增待測肉牛的POMC基因片段 1、牛樣品的採集和處理
本發明採用8個牛群體共計318個個體，具體為:(I)安格斯(Angus)牛血液樣品18份，晉南牛(Jinnan)血液樣品23份,利木贊(Limousin)牛血液樣品22份,魯西黃牛(Luxi)血液樣品29份,秦川牛(Qinchuan)血液樣品27份,西門塔爾(Simmental)牛血液樣品30份，夏洛萊(Charolais)牛血液樣品29份，採自河北大廠縣華安肉牛育肥場；(2)安格斯(Angus)牛血液樣品30份,海福特(Hereford)牛血液樣品30份,西門塔爾(Simmental)牛血液樣品28份，採自內蒙古通遼三元肉牛育肥場；(3)西門塔爾(Simmental)牛血液樣品，採自內蒙古通遼寶龍山肉牛育肥場。從每頭牛的頸靜脈採血8 mL於10 mL管中，加A⑶抗凝劑(血液與ACD體積比為6:1)搖勻，將血樣用加冰塊的泡沫箱帶回實驗室，於_80°C超低溫冰箱保存備用。
[0020]2、基因組DNA的提取
(I)冰凍血樣室溫下融化、搖勻，用移液槍吸取1.5mL全血加入5mL離心管中，加入1.5mL (或與血樣等體積)PBS緩衝液,顛倒混勻lOmin, 12000r/min離心1min,結束後可看到離心管底部白細胞沉澱。
[0021](2)棄上清液，重複(I)的步驟I~2次，至下層白細胞內無紅細胞。
[0022](3)棄上清液，加入ImL裂解液SET，40 μ L 10% SDS，20 μ L蛋白酶K溶液，振蕩器振蕩2~3min，使之充分混勻，至於恆溫水浴振蕩器中55°C水浴，消化過夜至不見粘稠團塊。
[0023](4)向管中加入與管內液體等體積的Tris飽和酚(約1.5mL)，蓋緊管蓋，緩慢連續顛倒混合不少於lOmin, 12000r/min離心10min。
[0024](5)小心吸取上清液至新的5 mL離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25: 24:1)混和液,緩慢顛倒離心管不少於1min,使溶液兩相充分混勻，12000r/min離心1min0
[0025](6)轉移上清液至另一離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，混勻，12000r/min 離心 lOmin。
[0026]( 7)轉移上清液至新的離心管，加入2倍體積預冷的無水乙醇，蓋緊管蓋，順一個方向水平搖晃數次即可看到白色絮狀DNA沉澱，離心4min，使DNA貼附在離心管管壁下部。
[0027](8)用預冷的75%乙醇洗滌兩次，小心倒出乙醇，室溫放置。
[0028](9)乙醇揮發後，加入10yL ddH20溶解，4°C放置，24h後，將DNA溶液轉移至滅菌的1.5mL離心管中，-20°c保存備用。
[0029]3、DNA濃度和純度檢測
(I)瓊脂糖凝膠電泳檢測
取5 μ L DNA溶液，與I μ L上樣緩衝液(6 X loading buffer)混勻，於1%的瓊脂糖凝膠中以100V電壓電泳30min左右，結束後利用凝膠成像系統拍照，初步觀察DNA的純度。
[0030](2)紫外分光光度計檢測
將5 μ I待測DNA溶液充分溶於ddH20，並定容至1ml。利用紫外分光光度計測得其260nm和280nm波長處的OD值。根據以下公式計算DNA純度和濃度:
DNA 濃度=OD260 X 50ng/ μ I X 200
DNA 純度=0D26Q/0D28。
若DNA純度在1.8-2.0之間，則DNA純度較高；若小於1.8，則樣品中可能存在RNA汙染；若大於2.0，則樣品中可能存在蛋白質汙染。經紫外分光光度計測定OD值為1.72，純度較聞。
[0031]4、PCR 擴增
分別以8個牛品種的DNA為模版，用上述引物進行PCR擴增，PCR總反應體系為32 μ L，見表1 ;PCR總反應程序，見表2 ；
表1本發明的PCR反應體系

【權利要求】
1.一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態性的引物，其特徵在於:所述引物為引物對P，序列為:上遊引物:5』-GGTGCCAAATACCTCCTG-3』 ；下遊引物:5』-ACAGCCCATTGACAGAACT-3』。
2.一種檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，以包含POMC基因的待測肉牛全基因組DNA模版，以引物對P為引物，PCR擴增肉牛POMC基因；用限制性內切酶ScaI消化PCR產物後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定肉牛POMC基因第5141位的單核苷酸多態性。
3.根據權利要求2所述的檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態性的辦法，其特徵在於，所述的PCR擴增反應程序為:94°C預變性5min ;94°C變性30s ;60°C退火40s ;72°C延伸30s ；72°C 延伸 7min ;4°C 保存。
4.根據權利要求2所述的檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態性的辦法，其特徵在於，所述的瓊脂糖凝膠電泳為2%瓊脂糖凝膠電泳。
5.根據權利要求2所述的檢測肉牛POMC基因單核苷酸多態性的辦法，其特徵在於，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定肉牛POMC基因第5141位的單核苷酸多態性為:TT基因型表現為361bp/161bp條帶；TC基因型表現為522bp/361bp/161bp條帶；CC基因型表現為522bp條帶 。
【文檔編號】C12N15/11GK104131098SQ201410362132
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】甘乾福, 喬慧, 梁學武, 陳佳欽 申請人:福建農林大學