測定分析物電荷的設備和方法與流程

2023-08-08 19:37:36 2

交叉引用本申請要求2014年6月19日提交的美國臨時專利申請序號62/014,595以及附錄a-c的權益；該專利文件通過引用全部併入本文中。關於聯邦政府資助的研究的聲明本發明由美國政府支持在美國國立衛生研究院(nih)的合同號nihp01hg000205下完成。
背景技術：
：在生物
技術領域：
內對核酸傳感器存在極大興趣，核酸傳感器可以代替目前流行的基於光學的生物傳感器。雖然在核酸研究中已經有眾多理論進展，但是執行研發的方法(無論是診斷患者的疾病還是研究致病性狀)的成本經常妨礙它們進入臨床情況的選用。例如，雖然人基因組測序的成本已經從$30億大幅地降低至$2萬，但是這對用於常規臨床環境依然太過昂貴。基於光學的感測(其往往操作耗時，需要改性的螢光試劑，需要龐大的光源和需要昂貴的成像儀器)被視為降低基因組學成本的主要瓶頸。雖然集成的電傳感器似乎提供了許多優於光學傳感器的優勢，但是最近的方法或者在可製造性上具有限制或者已經顯示差的穩健性。技術實現要素：本文認識到，需要用於檢測分析物諸如核酸的改進的傳感器(如，其更加靈敏，更加穩健，和/或更加容易製造)。在各個方面中，本公開內容提供了這樣的傳感器和使用傳感器例如測序核酸分子的方法。本公開內容的各個方面涉及用於檢測帶電分析物的傳感器和使用傳感器的方法。傳感器包括具有其間有隔膜的電相反部分(如，頂部分和底部分)的流體室。隔膜提供孔，其適合於電解質在流體室的電相反部分之間通過(如，從頂部分至底部分)並且具有在孔附近束縛的至少一種帶電分析物；第一電路，其配置為施加能夠使電解質穿過孔並牽拉至少一種帶電分析物進入孔的電場。傳感器進一步包括第二電路，其配置為在至少一種帶電分析物被牽拉進入孔後測量指示至少一種帶電分析物的電荷的信號。第二電路任選地包括用於測量信號的感測電極，其中感測電極以遠離至少一種帶電分析物的距離定位。該距離可以是與至少一種帶電分析物相關的德拜長度的至少2倍。使用德拜休克爾方程式：計算德拜長度，其中ad＝德拜長度，ε＝電常數，k＝玻耳茲曼常數，t＝溫度，以及c0＝離子濃度。在各個實施方式中，各自的孔的大小或直徑(和/或形狀)可以按需改變，以使帶電分析物的某些類型(具有對應大小)穿過。作為一個實例，當使用具有50nm和3μm之間的厚度的隔膜時，某些帶電分析物可以適合於直徑大小在25nm和2000nm之間的孔。對於其他分析物，諸如較小大小的分析物，孔具有至少大約10納米(nm)的直徑。電場可以具有至少大約105伏每米(v/m)的強度。至少一種帶電分析物可以具有圍繞其的電雙層(edl)並且電場可以能夠去屏蔽(de-screening)edl。進一步，隔膜和孔的壁可以具有圍繞它們的edl並且電場可以能夠去屏蔽edl。電場可以能夠產生非平衡傳輸條件。隔膜可以是電絕緣的。進一步，隔膜可以由石墨烯、氧化鋁(al2o3)、二氧化矽(sio2)或氮化矽(si3n4)組成(如，其是和/或可以是電絕緣材料)。第一電路可以包括在流體室的第一電相反部分(如，頂部分)中的第一電極和在流體室的第二電相反部分(如，底部分)中的第二電極。第二電路可以包括在孔附近嵌入隔膜的電極。第二電路可以包括能夠放大信號的放大器。放大器可以在距離孔大約5000μm內。信號可以與至少一種帶電分析物的電荷成線性比例。至少一種帶電分析物可以是核酸分子。進一步，至少一種帶電分析物可以具有至少大約40e-的淨電荷。然而，至少一種帶電分析物可以具有低於或高於大約40e-的淨電荷。電解質可以具有大約100μm至大約1m的離子強度。進一步，至少一種帶電分析物可以通過分子結構被束縛在孔附近和/或被固定。進一步，傳感器可以具有多個孔，多個帶電分析物被牽拉進入其中。進一步，多個帶電分析物可以是純系的(clonal)。在另一方面，公開了一種裝置，其中裝置具有本文中詳細說明的多個傳感器。其他相關實施方式涉及用於檢測帶電分析物的工具盒。工具盒包括至少一種帶電分析物，和傳感器。傳感器包括具有其間有隔膜的電相反部分(如，頂部分和底部分)的流體室，隔膜提供(或限定)孔，其適合於電解質在流體室的電相反部分之間通過(如，從頂部分至底部分)並且具有在孔附近束縛的至少一種帶電分析物(如，充分靠近孔用於本文中描述的電場相互作用)。傳感器還包括第一電路，其配置為施加能夠使電解質穿過孔並牽拉至少一種帶電分析物進入孔的電場。傳感器還包括第二電路，其配置為在至少一種帶電分析物被牽拉進入孔後測量指示至少一種帶電分析物的電荷的信號。隔膜可以是電絕緣的。進一步，隔膜可以由石墨烯、氧化鋁(al2o3)、二氧化矽(sio2)或氮化矽(si3n4)組成。第一電路可以包括在流體室的第一電相反部分(如，頂部分)中的第一電極和在流體室的第二電相反部分(如，底部分)中的第二電極。第二電路可以包括在孔附近嵌入隔膜的電極。第二電路可以包括能夠放大信號的放大器。放大器可以在距離孔大約5000μm內。信號可以與至少一種帶電分析物的電荷成線性比例。至少一種帶電分析物可以是核酸分子。進一步，至少一種帶電分析物可以具有至少大約40e-的淨電荷。然而，至少一種帶電分析物可以具有低於或高於大約40e-的淨電荷。電解質可以具有大約100μm至大約1m的離子強度。進一步，傳感器可以具有多個孔，多個帶電分析物被牽拉進入其中。進一步，多個帶電分析物可以是純系的。根據其他相關實施方式，本公開內容的方面涉及用於檢測帶電分析物的方法。方法包括提供具有介於隔膜兩邊的電相反部分(如，頂部分和底部分)的流體室，電相反部分之一(如，頂部分)具有電解質，隔膜提供孔，其適合於電解質在流體室的電相反部分之間通過(如，從頂部分至底部分)並且具有在孔附近束縛的至少一種帶電分析物。方法進一步包括施加電場以使電解質穿過孔並牽拉至少一種帶電分析物進入孔；和在至少一種帶電分析物被牽拉進入孔後測量指示至少一種帶電分析物的電荷的信號。方法任選地包括牽拉至少一種帶電分析物至孔的周圍附近的位置。在該方法中，第一電路可以施加電場。第二電路可以測量信號。本公開內容的另一相關方面涉及一種方法，其包括提供具有介於隔膜兩邊(如，由隔膜分開)的電相反部分(如，頂部分和底部分)的流體室，其中電相反部分之一(如，頂部分)包括電解質，隔膜提供適合於電解質在流體室的電相反部分之間通過(如，從頂部分至底部分)的孔；在孔附近束縛至少一個核酸分子；鄰近至少一個核酸分子的第一位置使核酸引物雜交至至少一個核酸分子；施加電場以使電解質穿過孔並牽拉至少一個核酸分子進入孔；測量指示至少一個核酸分子和核酸引物的電荷的信號；和用與至少一個核酸分子的下個位置互補的核苷酸延伸核酸引物，由此增加核酸引物的電荷的大小。可以重複前面涉及施加、測量和延伸的步驟，來測序核酸分子。第一電路可以施加上面提到的電場。第二電路可以測量上面提到的信號。另一相關方面涉及用於檢測核酸分子的方法。方法包括提供具有由隔膜分開的頂部分和底部分的流體室，頂部分包括電解質，隔膜提供適合於電解質從流體室的頂部分通過至底部分的孔；在孔附近束縛至少一種帶電分析物；施加電場以使電解質穿過孔並牽拉至少一種帶電分析物進入孔；和在至少一種帶電分析物被牽拉進入孔後測量指示至少一種帶電分析物的電荷的信號。第一電路可以施加上面提到的電場。第二電路可以測量上面提到的信號。通過下面詳細的描述，本公開內容的額外的方面和優勢對本領域技術人員將容易變得清楚，其中僅顯示和描述本公開內容的說明性實施方式。應當認識到，本公開內容能夠有其他和不同的實施方式，並且其若干細節能夠有在各個明顯的方面的修改，全部都不背離本公開內容。因此，附圖和描述實質上被看作說明性的，而非限制性的。通過引用併入本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請通過引用併入本文，程度如同每個單獨的出版物、專利或專利申請具體地和單獨地指示通過引用併入一樣。附圖說明在所附權利要求中具體地敘述了本發明的新特徵。通過參考下面的敘述了其中利用本發明的原理的說明性實施方式的詳細描述以及附隨的附圖或圖(本文中也為「圖(fig.和figs)」)將獲得對本發明的特徵和優勢的更好的理解，其中：圖1a顯示了本公開內容的傳感器的橫截面剖視圖的實例；圖1b顯示了本公開內容的傳感器的額外的實例；圖2顯示了使用本公開內容的傳感器執行夾心免疫測定的實例；圖3顯示了使用本公開內容的傳感器執行分析物-抗體或肽-抗體結合測量的實例；圖4顯示了本公開內容的封裝的傳感器的橫截面剖視圖的實例；圖5a顯示了本公開內容的無源傳感器的實例；圖5b顯示了具有多個孔的本公開內容的傳感器的額外的實例；圖6顯示了具有暴露的感測電極的本公開內容的傳感器的實例；圖7a顯示了本公開內容的有源傳感器的實例；圖7b-e顯示了本公開內容的有源傳感器的多個實例；圖8顯示了使用本公開內容的傳感器執行雜交測量的實例；圖9a顯示了在使用本公開內容的傳感器執行合成測序(sequencing-by-synthesis)(sbs)法中的初始步驟的實例；圖9b顯示在使用本公開內容的傳感器執行sbs法中的隨後的步驟的實例；圖9c顯示使用本公開內容的傳感器執行sbs反應的方法的額外的實例；圖10顯示了將核酸分子附接至本公開內容的傳感器的表面的實例；圖11顯示了本公開內容的傳感器以及其操作的實例；圖12a顯示了本公開內容的裝置的電子顯微鏡圖像的實例；圖12b顯示了本公開內容的孔的電子顯微鏡圖像的實例；圖13顯示了本公開內容的傳感器及其操作的實例；圖14a顯示了用於模擬其操作的本公開內容的裝置的實例；圖14b-d顯示了操作圖14a的裝置的模擬；圖15顯示了本公開內容的傳感器的等效電路模型的實例；圖16顯示了從操作本公開內容的傳感器獲得並用於確定圖15的等效電路模型的電路元件的數據的實例；圖17顯示了具有設計的感測區域的本公開內容的傳感器的實例；圖18顯示了與印刷電路板配接(interface)的本公開內容的傳感器的實例；圖19顯示了集成有本公開內容的傳感器的流體池的實例；圖20顯示了用於操作本公開內容的傳感器的裝置的實例；圖21a顯示了本公開內容的集成的傳感器陣列的電路的實例；圖21b-c顯示了用於本公開內容的集成的傳感器陣列的額外的電路的實例；圖22顯示了在本公開內容的傳感器中去屏蔽的物理學實例；和圖23顯示了用於操作本公開內容的傳感器的計算機系統的實例。具體實施方式雖熱在本文中已經顯示並描述了本發明的各種實施方式，但是本領域技術人員將清楚這樣的實施方式僅以示例的方式提供。本領域技術人員可以想到眾多變體、變化和替代，而不背離本發明。應當理解的是，可以採用本文中描述的對本發明的實施方式的各種替換方式。本公開內容的實例感測方法基於經由施加的電場將帶電分析物遞送至電荷傳感器，施加的電場還抑制通過薄隔膜(大約100nm)的孔的約束的幾何結構中的電荷屏蔽(electricalcharge-shielding)。因為跨越裝置的靜電勢降受孔支配，所以在它內部可以容易產生高電場(大約106～107v/m)。得到的通過孔的離子電流可以破壞感測區域中分子的靜電屏蔽，使得遠離數百納米檢測它們的電荷是可能的。由於在平衡條件下德拜休克爾屏蔽模型預測電荷感測僅可能在距離目標分析物幾個德拜長度的距離內(在生理條件下，德拜長度λd為～1nm)，所以這是令人驚訝的效果。在離子電流流動存在於納米約束的幾何結構中的情況下，有效離子屏蔽長度可以大幅增加。通過跨越水性孔施加電偏壓，由於帶電分析物的存在，存在電擴散電流流動，具體地沿徑向方向。該電流顯著地抑制電荷屏蔽效應。該發現作為我們提出的裝置的工作原理，其可以感測在大約10至大約100倍德拜長度λd的距離處的分析物(如，生物分子)的電荷。在水性環境中經由電子電荷傳感器的電荷感測的兩個主要挑戰包括由於分析物電荷的電雙層(edl)的屏蔽的過多的約束需求和捕獲分析物用於感測的困難。本公開內容的方面涉及非平衡傳輸現象連同分析物的策略性固定以規避對水性環境中基於電荷的傳感器的挑戰。新的物理學能夠將裝置用於各種應用。因為電荷是核酸的固有特性，本公開內容的各個方面能夠快速、無標記檢測核酸，用於成本有效的分析。與放射性同位素標記的分析物感測相比，涉及基於光學的感測方法的本公開內容的方面可以大幅降低執行核酸和蛋白質研究的進入壁壘。從不使用放射源的調節簡化已經提供了大量的商業分析工具(如，下一代測序、dna微陣列、實時pcr等)。以與從放射性同位素感測至基於光學的感測的過渡的作用類似的方式，涉及電子感測方法的本公開內容的方面可以降低執行核酸和蛋白質研究的進入壁壘。本公開內容的各個方面涉及集成的電荷傳感器晶片，其可以包括源極跟隨器(sf)放大器和緊靠靜止在薄sixny隔膜上的感測電極。這樣的集成的電荷傳感器可以是無源的(非有源傳感器)。在一些情況中，傳感器是有源傳感器(如，具有集成的信號放大器)。一個方面涉及用於檢測帶電分析物的傳感器。術語「分析物」包括但不限於核酸，如本領域技術人員所理解的。傳感器包括具有由隔膜分開的電相反部分(如，頂部分和底部分)的流體室。隔膜包括適合於電解質通過的孔，諸如從流體室的頂部分至底部分。傳感器進一步包括第一電路，其配置為施加能夠使電解質穿過孔並牽拉至少一種帶電分析物進入孔的電場。傳感器進一步包括第二電路，其配置為當至少一種帶電分析物被牽拉進入孔時測量指示至少一種帶電分析物的電荷的信號。在眾多實施方式中，至少一種帶電分析物被束縛在孔附近，同時牽拉至少一種帶電分析物進入孔。第二電路可以包括用於測量信號的感測電極，其中感測電極以遠離至少一種帶電分析物的距離定位。距離可以是與至少一種帶電分析物相關的德拜長度的至少2倍。使用德拜休克爾方程式：計算德拜長度，其中ad＝德拜長度，ε＝電常數，k＝玻耳茲曼常數，t＝溫度，以及c0＝離子濃度。在一些實施方式中，孔具有至少大約10納米(nm)的直徑。電場可以具有至少大約105伏每米(v/m)的強度。至少一種帶電分析物可以具有圍繞其的電雙層(edl)並且電場可以能夠去屏蔽(de-screening)edl。進一步，隔膜和孔的壁可以具有圍繞它們的edl並且電場可以能夠去屏蔽edl。電場可以能夠產生非平衡傳輸條件。隔膜可以是電絕緣的。進一步，隔膜可以包括石墨烯、氧化鋁(al2o3)、二氧化矽(sio2)或氮化矽(si3n4)。第一電路可以包括在流體室的頂部分中的第一電極和在流體室的底部分中的第二電極。第二電路可以包括在孔附近嵌入隔膜的電極。第二電路可以包括能夠放大信號的放大器。放大器可以在距離孔大約5000μm內。信號可以與至少一種帶電分析物的電荷成線性比例。至少一種帶電分析物可以是核酸分子。進一步，至少一種帶電分析物可以具有至少大約40e-的淨電荷。然而，至少一種帶電分析物可以具有低於或高於大約40e-的淨電荷。電解質可以具有大約100μm至大約1m的離子強度。進一步，傳感器可以包括多個帶電分析物，其被束縛在孔附近。進一步，傳感器可以具有多個孔，多個帶電分析物被牽拉進入其中。進一步，多個帶電分析物可以是純系的。在另一方面，公開了一種裝置，其中裝置具有本文中詳細說明的多個傳感器。另一相關方面涉及用於檢測帶電分析物的工具盒。工具盒包括至少一種帶電分析物，和傳感器。傳感器包括具有由隔膜分開的頂部分和底部分的流體室，隔膜包括適合於電解質從流體室的頂部分通過至底部分的孔。傳感器還包括第一電路，其配置為施加能夠使電解質穿過孔並牽拉至少一種帶電分析物進入孔的電場(如，當至少一種帶電分析物被束縛在孔附近時)。傳感器還包括第二電路，其配置為在至少一種帶電分析物被牽拉進入孔後測量指示至少一種帶電分析物的電荷的信號。隔膜可以是電絕緣的。進一步，隔膜可以由石墨烯、氧化鋁(al2o3)、二氧化矽(sio2)或氮化矽(si3n4)組成。第一電路可以包括在流體室的頂部分中的第一電極和在流體室的底部分中的第二電極。第二電路可以包括在孔附近嵌入隔膜的電極。第二電路可以包括能夠放大信號的放大器。放大器可以在距離孔大約5000μm內。信號可以與至少一種帶電分析物的電荷成線性比例。至少一種帶電分析物可以是核酸分子。進一步，至少一種帶電分析物可以具有至少大約40e-的淨電荷。然而，至少一種帶電分析物可以具有低於或高於大約40e-的淨電荷。電解質可以具有大約100μm至大約1m的離子強度。進一步，傳感器可以包括多個帶電分析物，其被束縛在孔附近。進一步，傳感器可以具有多個孔，多個帶電分析物被牽拉進入其中。進一步，多個帶電分析物可以是純系的。另一相關方面涉及用於檢測帶電分析物的方法。方法包括提供具有由隔膜分開的頂部分和底部分的流體室，頂部分包括電解質，隔膜包括適合於電解質從流體室的頂部分通過至底部分的孔。方法進一步包括在孔附近束縛至少一種帶電分析物；施加電場以使電解質穿過孔並牽拉至少一種帶電分析物進入孔；和在至少一種帶電分析物被牽拉進入孔後測量指示至少一種帶電分析物的電荷的信號。方法可以包括牽拉至少一種帶電分析物至孔的周圍附近的位置。在該方法中，第一電路可以施加電場。第二電路可以測量信號。孔可以具有任意適合的厚度，包括以下厚度(如，隔膜和感測電極的厚度)：大約10納米(nm)、大約20nm、大約40nm、大約60nm、大約80nm、大約100nm、大約125nm、大約150nm、大約200nm、大約250nm、大約300nm、大約350nm、大約400nm、大約500nm、大約600nm、大約800nm、大約1微米(μm)、大約2μm、大約4μm、大約6μm、大約8μm、大約10μm、大約20μm、大約40μm、大約60μm、大約80μm、大約100μm、大約200μm、大約400μm、大約600μm、大約800μm、大約1000μm或更大。在一些實施方式中，孔具有以下厚度(其也可以被稱為深度)：至少大約10納米(nm)、至少大約20nm、至少大約40nm、至少大約60nm、至少大約80nm、至少大約100nm、至少大約125nm、至少大約150nm、至少大約200nm、至少大約250nm、至少大約300nm、至少大約350nm、至少大約400nm、至少大約500nm、至少大約600nm、至少大約800nm、至少大約1微米(μm)、至少大約2μm、至少大約4μm、至少大約6μm、至少大約8μm、至少大約10μm、至少大約20μm、至少大約40μm、至少大約60μm、至少大約80μm、至少大約100μm、至少大約200μm、至少大約400μm、至少大約600μm、至少大約800μm或至少大約1000μm。在一些實施方式中，孔具有以下厚度：至多大約10納米(nm)、至多大約20nm、至多大約40nm、至多大約60nm、至多大約80nm、至多大約100nm、至多大約125nm、至多大約150nm、至多大約200nm、至多大約250nm、至多大約300nm、至多大約350nm、至多大約400nm、至多大約500nm、至多大約600nm、至多大約800nm、至多大約1微米(μm)、至多大約2μm、至多大約4μm、至多大約6μm、至多大約8μm、至多大約10μm、至多大約20μm、至多大約40μm、至多大約60μm、至多大約80μm、至多大約100μm、至多大約200μm、至多大約400μm、至多大約600μm、至多大約800μm或至多大約1000μm。如上面所討論，孔可以具有任意適合於使帶電分析物穿過並作用於帶電分析物的直徑，例如，較大/較小的孔適合於較大/較小的帶電分析物(類似地，10nm孔直徑可以適合用於帶電的dna/rna分析物，25nm孔直徑用於帶電的肽分析物，50nm用於帶電的蛋白質/病毒分析物，1μm用於帶電的細菌分析物，10μm用於帶電的血液細胞分析物，等等)。本公開內容的各個方面涉及集成的、可製造的、固態電荷傳感器，例如，測序和dna微陣列應用。比如，本公開內容的方面涉及設備、方法和系統，其包括容納帶電分析物例如生物分子的具有頂部分和底部分的流體室。進一步，設備、方法和系統可以包括分開流體室的頂部分和底部分的隔膜。隔膜包括開孔，以提供流體室的頂部分和底部分之間的途徑。額外地，設備、方法和系統可以包括第一電路，其施加電場以束縛生物分子簇。進一步，設備、方法和系統可以包括傳感器和集成電路，其在束縛生物分子簇的同時確定生物分子的電荷。在某些實施方式中，帶電分析物為dna分子和rna分子中的一種或多種。額外地，在某些實施方式中，帶電分析物為無機毒素(如，鎘、氟化物、汞、鉛、砷、有毒元素鹽)、藥物、肽、蛋白質、其他毒素——包括有機毒素、真菌孢子、細菌、病毒、重金屬、和其他類似帶電分析物中的一種或多種。本公開內容的其他實施方式進一步特徵在於具有隔膜的外部分，其包括多個銜接頭(adapter)，該銜接頭提供將單獨或與其他方法結合使用的固定，其他方法諸如通過傳感器和集成電路感測的電荷分析物的固相擴增。額外地，在某些實施方式中，隔膜的外部分包括多個銜接頭，其提供固相擴增以製造純系dna簇。進一步，聚合酶鏈反應(pcr)引物可以被附接至dna的尾部。本公開內容的某些實施方式包括隔膜和開孔的壁，其形成電雙層(edl)。在這樣的實施方式中，第一電路產生非平衡傳輸條件，用於edl的去屏蔽。在其他實施方式中，響應電場，第一電路將錨定的帶電分析物例如dna分子樞軸轉動進入孔。額外地，傳感器和集成電路可以確定帶電分析物的電荷以感測帶電分析物的鹼基摻入。進一步，第一電路可以還包括流體室內的陰極和陽極，以施加電場。陽極和陰極中的一個在流體室的頂部分中，並且陽極和陰極中的另一個在流體室的底部分中。在其他實施方式中，第一電路固定帶電分析物的簇，使得帶電分析物與孔的壁分開，並且傳感器和集成電路被配置和布置以確定帶電分析物的電荷。額外地，某些實施方式可以包括生物感測裝置的陣列。本公開內容的方面可以代替目前利用光學、利用化學或利用放射性完成的任何感測。額外地，應用包括但不限於dna、rna或蛋白質測序、dna微陣列、肽微陣列和免疫測定。本公開內容的傳感器的實例應用包括核酸測序和核酸微陣列。測序技術中許多是基於合成測序(sbs)。方法中大部分是基於聚合酶克隆測序(polonysequencing)。sbs反應呈現如下：其中dna(n)為具有n個鹼基的dna分子，dntp為脫氧核苷酸三磷酸和ppi為焦磷酸。因此，對於sbs，存在三個可以由多種傳感器檢測的項目。鹼基自身的添加，在合成期間釋放的質子，和在合成期間釋放的焦磷酸。聚合酶克隆可以包括100或更多個待測序的dna分子的相同拷貝。由並行在聚合酶克隆中合成的相同的個體dna分子放出的倍增的信號可以增強呼叫(calling)(閱讀)鹼基的完整性。基於固相pcr擴增(橋式擴增)，測序平臺可以使用光學以檢測螢光修飾的鹼基的添加(dna(n)至dna(n+1)的增加)。雖然修飾對於非自然發螢光的dna是必須的，但是這樣的修飾可以破壞聚合酶的自然功能並導致增加的錯誤摻入，其在統計學上出現在聚合酶克隆的部分中。一旦這樣的錯誤摻入出現，分子不再產生正確的信號並造成該整個聚合酶克隆的閱讀錯誤。當聚合酶克隆中足夠數目的dna分子已經被毀壞(即，「中斷期(offphase)」)，聚合酶克隆損失準確呼叫鹼基的能力。這可以將閱讀長度限制在大約100至大約300個鹼基之間。進一步，光源是龐大的和獲取測序結果的圖像的照相機可以是慢的且生成大數據文件。最近光學檢測的發展已經受到性能上增量提高的限制，意味著其成熟的發展狀況。焦測序(pyrosequencing)檢測焦磷酸——合成反應的副產物(參見：本文中方程式1)——的釋放。其為基於光學的技術，其中在微流體約束的反應室中完成一系列反應以經由生物發光觀察焦磷酸的存在。挑戰可以來源於標度從反應井至傳感器的信號轉導的困難，其中光纖電纜束可以用於信號轉導。然而，焦測序合成反應不需要改性的試劑。結果是對相誤差有適應力，閱讀長度為1000個或更多個鹼基，其是大於已經超越普及的焦測序的技術的數量級。固態ph傳感器也已經被用於檢測鹼基摻入後由聚合物克隆釋放的質子，h+離子。因為傳感器是基於固態裝置測序技術，其大幅快於光學傳感器的測序技術。然而，由於其感測的是ph，每個試劑的ph必須仔細校準並且反應室不能是強緩衝的。這可導致脆弱的初始化過程，其耗時且易於失敗。當質子擴散開時，傳感器中和周圍的局部ph變化也可以是短暫的，並且合成結果通常不能多次獲取，導致其後必須採集數據的固定窗口。進一步，由於基於ph的傳感器檢測dna合成中特定分子生物事件的副產物，可以實現sbs。通過限定，ph傳感器對ph的對數性質操作。用於ph檢測的固態傳感器可以基於離子敏感場效應電晶體(isfet)技術。isfet具有響應ph變化的線性輸出(大約50mv/ph)。ph對數依賴於核苷酸的合成。裝置尺寸的微型化是頻繁使用的成本降低和半導體微製造性能增加的方法。基於ph的測序方法具有非常明顯的劣勢，在於其確定隨機出現在dna序列中的均聚物長度的差的準確度。為了確保各種長度的均聚物是可區別的，在傳感器中，ph測序方法可以需要大量的純系dna分子，其妨礙微型化它們的能力。因此，使用常規的微型化方法以獲得基於ph的測序上的性能增加和成本效益是困難的。可以採用長距離相互作用(如，大於大約100nm)用於感測和致動包括核酸的帶電生物分子。根據本公開內容，各種傳感器檢測磷酸主鏈中的電荷。在一些實施方式中，電固態傳感器能夠實現核酸測序和/或微陣列的快速閱讀操作。對於核酸測序，不同於感測ph，感測磷酸主鏈中的電荷可以導致對摻入的鹼基數目的線性響應，因此不受在確定均聚物序列中準確度減低的影響。信號也可以永久地固定並可以多次獲取以減少誤差(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次)。由於在它們的磷酸主鏈中核酸具有一電子(1e-)淨電荷，所以核酸分子上的淨電荷與其中的鹼基的數目成正比例。因此，監測核酸分子上電荷的量的能力可以能夠實現監測分子中鹼基的數目。關於dna或rna分子中鹼基數目的知曉又能夠實現測序的合成事件或微陣列的雜交事件的檢測。閱讀核酸分子自身中固有的磷酸主鏈中的電荷可以極大地簡化測序化學。因此，與本公開內容的各個方面一致，電荷傳感器可以不需要改性的試劑(如，核苷酸、聚合酶)或額外的用於檢測的試劑(如，atp硫酸化酶、螢光素酶)。因此，本文中描述的電荷傳感器可以提供目前感測方法的簡單代替，同時保持各種優勢。額外地，基於本文中描述的傳感器的測序平臺可以具有焦測序的長閱讀長度、固態測序的速度和通常與光學感測相關的穩健性。因此，通過使用能夠直接檢測dna分子的固有電荷的變化的可製造固態傳感器，可以規避困擾當前和新興的下一代測序平臺的許多問題。固態集成電荷傳感器可以不依賴ph起作用，可以快速閱讀鹼基摻入，具有高效的數據存儲，以及還具有不太昂貴的標度成本和較好的均聚物解析度。眾多實施方式涉及一種方法。該方法包括提供具有由隔膜分開的頂部分和底部分的流體室，頂部分包括電解質，隔膜包括適合於電解質從流體室的頂部分通過至底部分的孔；在孔附近束縛至少一個核酸分子；鄰近至少一個核酸分子的第一位置使核酸引物雜交至至少一個核酸分子；施加電場以使電解質穿過孔並牽拉至少一個核酸分子進入孔；測量指示至少一個核酸分子和核酸引物的電荷的信號；和用與至少一個核酸分子的下個位置互補的核苷酸延伸核酸引物，由此增加核酸引物的電荷大小。可以重複前面涉及施加、測量和延伸的步驟，來測序核酸分子。第一電路可以施加上面提到的電場。第二電路可以測量上面提到的信號。在其他相關實施方式中，方法包括檢測核酸分子。方法包括提供具有由隔膜分開的頂部分和底部分的流體室，頂部分包括電解質，隔膜包括適合於電解質從流體室的頂部分通過至底部分的孔；在孔附近束縛至少一種帶電分析物；施加電場以使電解質穿過孔並牽拉至少一種帶電分析物進入孔；和在至少一種帶電分析物被牽拉進入孔時測量指示至少一種帶電分析物的電荷的信號。第一電路可以施加上面提到的電場。第二電路可以測量上面提到的信號。現在轉向附圖，圖1a顯示了與本公開內容的各個方面一致的剖視圖中傳感器的實例示意。傳感器可以被用於檢測核酸0105。傳感器包括嵌入設置在襯底0102上的孔0104中的電極0101，其可以由光刻法製作。在一些情況中，孔具有大約100和大約300nm之間的直徑。來自電極的信號可以通過緊靠傳感器集成的薄膜單位增益源極跟隨器(sf)放大器閱讀(未示出，例如參見圖7、圖11和圖13)。待檢測的核酸分子可以被固定在傳感器上，使得通過在偏壓電極0103上施加合適的偏壓，可以將帶負電的核酸拉入孔用於感測0106。偏壓電極可以是ag/agcl、pt或au電極。在一些情況中，隔膜0100(如，大約100至大約400nm厚)提供電約束以產生電雙層(edl)的去屏蔽所需的非平衡傳輸條件。圖1b顯示了本公開內容的傳感器的額外的附圖。孔0107具有連接至放大器0109的嵌入電極0108。待檢測的核酸分子0110可以被固定在傳感器上，使得通過在偏壓電極0111上施加合適的偏壓，可以將帶負電的核酸拉入孔用於感測0112。本公開內容的傳感器可以被用於檢測任意分析物，諸如核酸、蛋白質、糖類、代謝物、細胞、有機或無機分子、藥物和/或候選藥物(drugcandidate)。分析物自身不需要具有電荷。例如，圖2顯示了使用傳感器用於夾心免疫測定的實例。探針抗體(probeantibody)0200可以靠近孔0205入口被固定在隔膜0204的表面上。分析物(靶抗原)0201可以結合至探針抗體，其也被結合至第二抗體0202。第二抗體202可以包括與帶電標記綴合的抗體，當通過偏壓電極0206施加跨隔膜偏壓時該帶電標記可以被牽拉入孔0203用於感測。在一些情況中，帶電標記為核酸分子。在另一實施方式中，圖3顯示了用於分析物-抗體相互作用的分析的晶片結構。分析物分子0300(如，蛋白質)靠近孔0304被附接至隔膜0303。具有綴合的帶電標記0301的抗體可以結合至分析物並且當通過偏壓電極0305施加偏壓時被牽拉進入孔0302用於檢測。傳感器可以被封裝並與電子和/或流體連接(如，用於裝置內操作)集成。圖4顯示了封裝的晶片的橫截面示意圖的實例。封裝的晶片具有底部流體池0400、頂部流體池0401和中部流體池0402。頂部外電極0403和底部外電極0404可以被附接至外電極導線(分別地0405和0406)。傳感器晶片0407可以由傳感器晶片輸入/輸出0408電尋址。傳感器可以為有源傳感器(即，具有集成信號放大器)或無源傳感器(即，不具有集成信號放大器)。在一些情況中，無源傳感器集成有外部信號放大器(即，沒有在結構上嵌入孔傳感器自身的放大器)。在一些例子中，有源傳感器消耗電力並且需要電源。當作為無源或有源傳感器操作時，本公開內容的傳感器可以設計為具有任意適合高的信噪比(snr)。在一些實施方式中，snr可以在1-100的範圍內(如，為大約1.1、大約1.2、大約1.5、大約2、大約3、大約4、大約5、大約6、大約7、大約8、大約9、大約10、大約15、大約20、大約25、大約30、大約40、大約50、大約100；至少大約1.1、至少大約1.2、至少大約1.5、至少大約2、至少大約3、至少大約4、至少大約5、至少大約6、至少大約7、至少大約8、至少大約9、至少大約10、至少大約15、至少大約20、至少大約25、至少大約30、至少大約40、至少大約50、或至少大約100)。圖5a顯示了用於增強傳感器的snr的一個策略。傳感器可以具有無源的嵌入感測電極0500、孔0501和在孔附近固定的帶電分析物0502。在一些情況中，存在多個純系的帶電分析物，但是這不是必須的。在一些實施中，可以利用單個孔感測一組不同的帶電分析物，然而，不具有區分帶電分析物的能力。在一些情況中，對於帶電分析物的每個集落，在傳感器中僅存在一個孔。然而，本公開內容的傳感器可每個帶電分析物集落具有多個孔0503。與單個孔相比，多個孔可以通過增加信號和/或降低噪音來增強snr。在一些實施方式中，每單獨的帶電分析物存在2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、50、100、500或1000個孔。在一些實施方式中，每單獨的帶電分析物存在至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少50、至少100、至少500或至少1000個孔。在一些情況中，傳感器採用多個孔/分析物重複，其在傳感器上不一定布置在彼此附近。然而，多個孔也可以布置在單獨的帶電分析物的集落附近和/或共享共同的感測電極0500。通過共同的感測電極使多個孔被尋址可以簡化傳感器的設計和/或促進傳感器陣列的微型化。圖5b顯示了具有多個孔0504的本公開內容的傳感器的實施方式。傳感器具有包括二氧化矽(sio2)的頂部絕緣體0505、包括氮化矽(si3n4)的底部絕緣體0506和設置在矽(si)襯底0508上的鉑(pt)電極0507。在一些實施方式中，電極具有大約75納米(nm)的厚度(如，70nmpt和5nm鈦(ti))，隔膜具有80nm氮化矽(si3n4)和70nmsio2的厚度。多個孔可以通過光刻法限定。多個孔可以被用於增強遞送至傳感器的淨電荷(如，在專用集成放大器不存在的情況中)。在一些實施方式中，傳感器具有暴露的電極。如圖6中所示，暴露的電極0600可以起到感測電極和襯底兩者的功能，帶電分析物0601可以被固定至其上。圖7a顯示了兩個有源傳感器的剖視圖。該設計包括用於有源傳感器的嵌入感測電極0700，包括專用放大器的有源電晶體0701，和用於有源裝置的互連0702。在另一實施方式中，嵌入感測電極0703可以與薄膜電晶體(tft)有源放大器0704配接並且具有用於有源裝置的互連0705。此處顯示的兩個實施方式能夠檢測帶電分析物0706。圖7b顯示了本公開內容的有源傳感器的額外的細節，其具有封閉的頂部和底部流體溝道以及它們各自的集成入裝置的電極。感測電極被夾在隔膜中，集成的放大器在附近。這樣的結構可以降低由感測電極產生的噪音。輸入/輸出(i/o)電路的其餘部分可以置於矽晶片上。傳感器可以具有集成的頂部電極0707、頂部流體腔0708、如圖7a中所描述的集成的感測放大器0709、底部流體腔0710、底部電極0711和襯底上的外圍電路0712。在一些情況中，襯底是矽。如本文中一般所用，任何提及「頂部」或「底部」僅是說明性的，這是由於傳感器可以關於重力以任何方式取向。圖7c-7e顯示了本公開內容的有源傳感器的額外的實施方式。圖7c具有遠離矽襯底中的感測電極的放大器，其可以降低由放大器產生的噪音。該實施方式包括頂部流體溝道0713、分析物0714、感測電極0715、孔感測區域0716、底部流體溝道0717、光電管放大器(cellamplifier)0718、頂部流體電極0719、底部流體電極0720、i/o電路0721、絕緣體0722和矽0723。圖7d具有開放的頂部流體溝道和封閉的底部流體溝道，其可以取消執行複雜結合過程的需要。所有的有源零件在主矽襯底上，其可以允許穩健操作，但需要較大的晶片面積來實施。該實施方式可以包括絕緣體0724、i/o電路0725、頂部流體溝道0726、光電管放大器0727、分析物0728、感測電極0729、孔感測區域0730、底部流體溝道0731、底部流體電極0732和矽襯底0733。圖7e顯示了開放的頂部和底部流體溝道，其可以能夠實現外部溝道電極的使用。所有的有源零件在主矽襯底上，其可以允許穩健操作，但需要較大的晶片面積來實施。該實施方式可以包括絕緣體0734、i/o電路0735、頂部流體溝道0736、光電管放大器0737、分析物0738、感測電極0739、孔感測區域0740、底部流體溝道0741和矽襯底0742。傳感器可以被用於執行本領域內通常已知的許多分析或測量。在一些情況中，與現有技術相比，本公開內容的傳感器能夠實現改進的方法或其性能。例如，本文中描述的是雜交測定(即，微陣列)，其可以被用於檢測單核苷酸多態性(snp)。如圖8中所示，傳感器具有電荷感測孔0800，集成電荷感測電極0801在固定的雜交探針0802附近。在一些情況中，雜交探針是核酸分子，其與分析物0803雜交。分析物可以是具有與雜交探針互補的序列的第二核酸分子。根據本文中描述的方法，施加跨越孔的偏壓可以將雜交探針和分析物(探針-分析物綴合物)牽拉進入孔用於檢測0804。在一些情況中，本公開內容的裝置包括傳感器的陣列，每個具有孔，每個孔具有在孔附近附接的單獨的雜交探針。因此，每個孔-傳感器對可以檢測不同的分析物。然而，在一些情況中，靠近任意給定的孔固定的雜交探針不必是相同的(即，純系的)。給定的孔可以具有與其相關聯的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個不同類型的雜交探針。在一些情況中，不同的雜交探針中每個具有結合至其的不同的分析物，同時每種分析物具有不同的電荷。以該方式，給定的孔可以檢測和/或區分2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的分析物。本文中描述的傳感器可以被用於確定分析物(如，核酸分子)的序列。圖9a和圖9b描繪了可以用於執行合成測序(sbs)的操作，其中圖9b的操作以迭代的方式遵循圖9a的操作進行。如所示，方法使用電荷感測孔0900和電荷感測電極0901。待測序的核酸0902被固定在孔附近，例如固定至塗布在適於固相擴增的孔的圓周上的銜接頭，如圖10中所示。核酸可以是核酸的文庫之一，每一個附接至單獨的傳感器附近的單獨的銜接頭。可以使用固相聚合酶鏈反應(pcr)來擴增核酸分子以形成純系核酸分子的集落，也附接至孔附近的傳感器，例如，如國際專利申請號pct/au1992/000587中所描述，其公開內容通過具體引用併入本文，用於該相關公開內容。寡核苷酸引物0903可以與待測序的核酸雜交，然後清洗掉未雜交的引物。施加電場可以將核酸-引物複合體拉入孔0904，用於參比電荷的測量(即，在測序之前)。參比電荷可以被存儲。該高電場既可以牽拉固定的核酸進入傳感器又可以幫助去屏蔽edl。繼續圖9b，可以通過在隨後的鹼基位置0906處摻入與待測序的核酸分子互補的核苷酸0905延伸引物0903來執行sbs(即，鳥嘌呤(g)用胞嘧啶(c)和腺嘌呤(a)用胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))。過量的或未摻入的核苷酸可以被清洗掉和/或降解(如，利用腺苷三磷酸雙磷酸酶)。核苷酸的摻入在核酸-引物複合體上增加了一電子負電荷(相對於參比電荷和/或在先前迭代處測量的電荷)，其可以通過施加適於牽拉核酸-引物複合體進入孔的跨越孔的電壓被感測0907。感測的電荷可以與參比和/或先前的電荷(其任選地存儲在傳感器中)比較以產生鹼基判定(basecall)。本文中描繪的sbs過程可以通過連續地以任意順序利用四種鹼基a、g、c、t(或在rna的情況中u)迭代地攻擊系統來繼續。利用不與隨後的鹼基位置互補的鹼基攻擊系統的情況將不導致電荷的變化。在一些情況中，電荷的變化歸因於生長引物鏈的磷酸主鏈的增加的長度，其中每個鹼基位置一個負電荷。本領域技術人員將理解，可以在適合的緩衝劑存在的情況下，利用聚合酶執行核苷酸的摻入，適合的緩衝劑包括鎂和/或錳離子。圖9c顯示了使用本公開內容的傳感器進行sbs的方法的另一描繪，並且類似於關於圖9a和圖9b描述的步驟。如所示，方法使用電荷感測孔0908。待測序的核酸0909被固定在孔附近，例如固定至塗布0910在適於固相擴增的孔的圓周上的銜接頭。核酸可以是核酸的文庫之一，每一個附接至單獨的傳感器附近的單獨的銜接頭。可以使用固相聚合酶鏈反應(pcr)來擴增核酸分子以形成純系核酸分子的集落0911。寡核苷酸引物0912可以與待測序的核酸雜交，然後清洗掉未雜交的引物。施加電場可以將核酸-引物複合體拉入孔0913，用於測量參比電荷(即，在測序之前)。可以通過在隨後的鹼基位置處摻入與待測序的核酸分子互補的核苷酸0914延伸引物(即，鳥嘌呤(g)用胞嘧啶(c)和腺嘌呤(a)用胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u))來執行sbs。過量的或未摻入的核苷酸可以被清洗掉和/或降解(如，利用腺苷三磷酸雙磷酸酶)。核苷酸的摻入在核酸-引物複合體上增加了一電子負電荷(相對於參比電荷和/或在先前迭代處測量的電荷)，其可以通過施加適於牽拉核酸-引物複合體進入孔的跨越孔的電壓被感測0915。可以向傳感器提供密集居群固定的dna以及可以執行固相pcr擴增或橋式擴增。可以利用(3-氨基丙基)-三甲氧基矽烷(aptms)的分子氣相沉積來執行晶片表面的氣相矽烷化。使用交聯劑n-(p-馬來醯亞胺基苯基)異氰酸酯(pmpi)，可以將作為pcr引物的硫醇修飾的寡核苷酸附接至晶片表面。存在可以使用的多種其他交聯劑。圖10顯示了共價附接核酸至電荷傳感器表面的方法的實例，與本公開內容的各個方面一致。包括羥基基團1001(和/或羥基化的)的sio2表面1000可以被矽烷化(如，使用氨基矽烷1002)。矽烷化可以在氣相中執行。交聯劑(如，pmpi1003)可以被用於連接矽烷上的氨基和5'硫醇-修飾的引物1004上的巰基。得到的本文中描述的表面化學的產物顯示在1005。實踐中，感測晶片被等離子清潔、再水化和使用化學氣相沉積系統利用(3-氨基丙基)-三甲氧基矽烷(aptms)官能化。通過在氬氣氣氛下，在40℃下，在無水甲苯中暴露至2.3mm的n-(p-馬來醯亞胺基苯基)異氰酸酯(pmpi)溶液2小時，氨基官能化的表面隨後被轉化為硫醇-反應性基團。隨後利用無水甲苯清洗表面並在氬氣流中乾燥，隨後使用硫醇化的寡核苷酸進行dna固定。在固定之前，使用三(2-羧乙基)膦(tcep)作為還原劑還原硫醇化的寡核苷酸並使用自旋柱(mwco＝3000)脫鹽。可以在控制的氣氛下，在1m的nacl緩衝溶液中，以10μm的濃度直接將硫醇化的寡核苷酸點樣至感測晶片上持續6小時，隨後大量的清洗。各種表面修飾步驟之後進行x射線光電子能譜法，並且預期成分的存在和峰位移確認感測表面的轉化。橋式pcr擴增自身通過在標準pcr管中連同合適的試劑和先前製備的900個鹼基對(bp)模板熱循環傳感器晶片來進行。附著化學的結果是共價鍵牢固地將900bpdna分子固定至晶片表面的鏈。選擇900bp模板的長度，是由於其長度緊密匹配製造的孔長度。固相擴增的dna分子通過限制酶被線性化。通過螢光顯微鏡利用合適激發的sybrgold核酸染料來驗證來自固相擴增的固定的核酸的密集存在。圖10顯示了具有和不具有固定的dna分子的電荷傳感器晶片的顯微鏡圖像。為了驗證螢光響應的結果是來自成功的橋式擴增而非來自非特異性結合，進行了若干對照實驗。在每個實驗中，在通常將導致pcr擴增的熱循環之前，省略表面化學中的成分(氨基矽烷、交聯劑和硫醇化的寡核苷酸)。圖10顯示了結果。任意成分的缺乏導致低水平的螢光，其表示僅當三個表面化學成分中所有都在適當位置時固相pcr擴增才是成功的，如1008中所示。在沉積氨基矽烷和培育硫醇化的寡核苷酸引物而不存交聯劑的情況中，稍稍提高的螢光亮度推測為低水平的帶負電的寡核苷酸至矽烷的帶正電的氨基的非特異性粘合。圖10顯示了傳感器表面上固相pcr擴增的dna的光學顯微鏡研究的實例，與本公開內容的各個方面一致。顯示了具有大約900個鹼基的固相pcr擴增的dna的傳感器的亮場顯微鏡圖像1006(淺灰色區域為sinx/sio2隔膜)。暗的多孔區域為具有孔陣列的pt感測電極。1μm的孔通過光刻法限定。還顯示了在1006中所示的位置處晶片的螢光顯微鏡圖像1007。sybrgold染色的dna螢光表示大量的dna分子和成功的固相pcr擴增。在1008顯示了一系列對照實驗，其中已經省略了表面化學中的成分以增強具有各種缺少表面化學的晶片的螢光亮度。隨著核酸被固定，與本公開內容的各個方面一致，可以以下面的方式操作無源或有源傳感器晶片：i)可以向陰極施加正電勢，ii)施加電勢可以靠近孔以將固定的分析物(如，核酸)分子拉入孔的方式產生電場和iii)在外電場下孔中分析物分子的存在留下電信號至(如，鉑)感測電極，其電勢可以被記錄用於分析。隨著分析物共價地固定至頂表面，可以通過觀察陰性對照實驗、具有每分子附著有900個電子(e-)的單鏈(ss)dna的晶片、和具有每分子附著有1800e-電荷的雙鏈(ds)dna的晶片之間的信號差異，測試傳感器區分電荷的能力，在陰性對照實驗中不對傳感器晶片進行表面化學。圖11顯示了電荷傳感器的說明的實例，與本公開內容的各個方面一致。電荷傳感器設置的示意圖包括連接至頂部電極1101的電流放大器1100、晶片外的單位增益電壓放大器1102、感測電極1103(75nm的鉑電極)、絕緣隔膜1104、底部電極1105和在sio2表面上的固定的(線性化的)核酸分子1106。當向陰極施加正電勢時，核酸分子被牽拉進入孔，改變感測電極1103的電勢。可以在低濃度鹽(如，100μm的kcl)中進行測量以增強電檢測。如圖11的底部大部分所示，在以毫伏(mv)為單位增加和顯示施加的陰極電勢1108時，可以以伏特為單位測量和監測傳感器電勢1107(1102的輸出)。每一條曲線代表利用不同傳感器晶片的測量(即，實線、短虛線和長虛線)。最上邊一組線1109代表沒有附著核酸的陰性對照。中間一組線1110代表已經使900個鹼基的ssdna附著至它們的那些晶片。最下邊一組線1111代表已經使900個鹼基對的dsdna附著的那些晶片。雖然觀察到一些晶片至晶片變體，但是總的來說，傳感器能夠區分三種情況之間淨電荷差異。利用大約900個鹼基之間觀察到的100mv差異，我們看見110μv/鹼基。圖12a顯示了圖11中描述的裝置的電子顯微鏡圖像。焊墊(bondpad)1200顯示有2x冗餘。微孔傳感器孔區域1201可以由信號線1202附接。傳感器區域可以由單一鉑電極提供。顯微照片還顯示了矽襯底1203和sio2/sinx隔膜1204。圖12b顯示了本公開內容的傳感器的孔的電子顯微照片的兩個實例，包括俯視圖1205(sio2側)和仰視圖1206(si3n4側)。比例尺為1μm和測量的孔直徑為大約1.15μm。圖13顯示了電荷傳感器的實例和操作電荷傳感器的結果。傳感器具有如圖6中所描述的暴露的金感測電極1300。傳感器進一步包括sinx隔膜1301、固定在一個硫醇化的5'末端處的450bp的dsdna1302、頂部電極1303、底部電極1304、孔(直徑為2μm)1305和提供傳感器信號輸出1307的單位增益放大器1306。在縱軸上以伏特(v)為單位繪製傳感器電勢1308(在1307處)作為以毫伏(mv)為單位施加的偏壓1309(在1304處施加)的函數。向底部電極1304施加負偏壓導致核酸分子被牽拉出孔1310，並且與沒有核酸分子的對照(較大的正方形標記)相比，當核酸被附著至傳感器時，在傳感器電勢中沒有測量到有意義的差異(較小的菱形標記)，如曲線的最左側部分1311中所顯示。向底部電極1304施加正偏壓導致分子被牽拉進入孔1312。在低正偏壓下沒有觀察到差異，如曲線的中間部分1313所示。然而，在高正偏壓下，傳感器電勢相對於對照顯著地降低，如曲線的最右側部分1314所示。在高正偏壓下，沒有dna被附著至晶片的對照情況1315顯示了反映施加負偏壓的結果的傳感器輸出，導致對稱的操作。在高正偏壓下，dna分子被附著至晶片的情形1316導致成功的核酸電荷檢測。為了說明工作原理，模擬圓柱對稱模型系統，其中60bp的雙鏈(ds)dna的片段放置在水性納米孔的中心(最具挑戰性的檢測方案)，如圖14a中示意性所示。系統包括陰極1409、金屬電極1410、固體電介質1411、虛擬接地1412、陽極1413和帶電分子1414。使用廣義偏微分方程求解公式prophet解泊松-能斯特-普朗克(pnp)方程連同斯託克斯方程以穿越孔的離子和流體傳輸建模，以解非線性、共軛模型方程。pnp方程為：其中εw為溶液的介電常數，q為基本電荷，d±和μ±分別為陽離子和陰離子的擴散係數和遷移率。通過斯託克斯-發散方程建模流體傳輸。其中p為溶劑壓力和γ為溶劑粘度。在下面提出的表1顯示了重要的模擬參數的值。表1：模擬參數和值參數值溶液介電常數(εw)80ε0絕緣體介電常數(εi)8ε0陽離子/陰離子遷移率(μ±)7.62×10-8m2/vs陽離子/陰離子擴散係數(d±)2×10-9m2/s體相離子濃度(c0)10mm溶劑粘度(γ)0.001ns/m2dna遷移率(μ)3.5×10-8m2/vsdna擴散係數(d)1.8×10-11m2/sdna源末端體相濃度2.7nm在圖14b-d中展示實例模擬結果。模擬器的有效性已經由其準確模擬dna易位行為通過致動應用的類似尺寸的柵控孔的能力顯示。圖14b顯示了在施加0v和7v外部電偏壓下，由於帶電分子的存在，模擬的靜電勢電荷的實例的等值曲線(contourplot)，與本公開內容的各個方面一致。在零外部電偏壓1400下，觀察到德拜休克爾屏蔽行為。相反，對於跨越孔施加的7v的電偏壓1401，觀察到顯著的長距離靜電相互作用(如由較亮顏色和場線所指示)。隔膜被制模為500nm厚度的固體電介質層。離子溶液為1mm的kcl。孔半徑設定為300nm，在該摩爾濃度下對應於大約30德拜長度。利用圖14a的裝置結構執行進一步模擬，其與本公開內容的各個方面一致。對於不同的孔半徑(如圖14c中所示)和偏壓條件，諸如有效的柵氧化物厚度(電介質絕緣體)(如圖14d中所示)，已經計算了感測效率，或感應電荷的分數β。參考圖14c，當電極和溶液之間沒有氧化物時，顯示了在1v1402、2v1403和3v1404下由生物分子感應的感測電極中電荷的分數。在圖14d中顯示了0v1405、1v1406、2v1407和3v1408下在感測電極上電介質形成對感測效率的影響的實例曲線。示意性曲線顯示了在感測電極上電介質形成對感測效率的影響。這模擬夾在兩個絕緣層之間的感測金屬電極。假設生物分子電荷為–q，金屬電極中的感應電荷是q』＝βq，其基本上是由放大器電路感測的電荷的量。該建模的一個結論可以是，利用跨越孔最適度的dc電偏壓，當生物分子在孔的中心處時，對於500nm的孔，可以被感測的電荷在生物分子電荷的大約20％和大約40％之間。實踐中，由於分析物(如，dna)被固定靠近孔的周圍而不是在中心的方式，電荷可以被遞送更加靠近感測電極。圖15顯示了本公開內容的個體傳感器的電路圖。傳感器包括感測電極1500，其為了便於製造電晶體模擬器可以被稱為「柵」。傳感器還具有頂部絕緣體1501、頂部(或源)電極1504、底部絕緣體1507、底部(或漏)電極1509和溝道位置1506——在此處模擬感測發生。頂部絕緣體1501和底部絕緣體1507可以是相同的或任選地可以由不同的材料組成。電路模型包括各種零件，包括從柵至頂部電解質體(或源)的電容cgs1502、從柵至溝道的電容cc1503、溝道-源極電阻rgs1505、溝道-漏極電阻rgd1508和柵-漏極電容cgd1510。在1511和1512展示使這些元件與源極(vs)處、漏極(vd)處、溝道(vc)中和柵(vg)處電壓相關聯的方程式。圖16顯示了實驗測量的結果，對應於圖15中描述的一些電路圖元件，其中各個圖線表示各個傳感器的測量。柵和漏極之間的阻抗1600顯示為頻率的函數。該曲線的下降斜率1601代表cgd(在1510)，斜率的最小值1602代表rgd(在1508)，以及該曲線的上升斜率1603代表儀器的感應係數。柵和源極之間的阻抗1604也顯示為頻率的函數。該曲線的下降斜率1605代表cgs(在1502)，曲線的最小值1606代表rgs(在1505)，以及該曲線的上升斜率1607代表儀器的感應係數。孔可以為任意適合的大小或形狀。孔可以是圓形、橢圓形、正方形、矩形、三角形、細長狹縫，或5、6、7、8、9、10或更多側的多邊形。本公開內容的傳感器和方法可以使用「納米孔」，但不要求孔是納米孔，其一般被限定為具有至少大約1納米(nm)和至多5nm或10nm的直徑的孔。不被任何具體理論約束，這是因為本方法不依賴於通過感測分析物阻滯離子流通過孔，諸如美國專利6,428,959中所描述，其公開內容通過具體引用併入本文，用於該相關公開內容。因此，孔可以大於納米孔，其能夠實現更容易地可製造的和操作的裝置。本公開內容的孔可以由任何適合的材料製成(即，孔可以是材料中的洞)，包括sio2、sin、氧化鋁(al2o3)、金或雲母。在一些情況中，孔是生物孔，諸如脂質膜內的蛋白通道。孔的側壁可以具有任何適合的形狀。在一些例子中，側壁是直的並且與隔膜的表面成直角(如，如圖1中所示)。在一些情況中，側壁不與隔膜的表面成直角。側壁可以是傾斜的。如圖17中所示，孔可以在隔膜的順式側(附著分析物的隔膜的側)上比在反式側上更寬。在一些實施方式中，孔可以還在反式側上比順式側上更寬。在一些情況中，孔是沙漏形的或倒沙漏形的。可以改變孔的形狀以操縱感測區域1700的性質，例如為了優化任意具體的感測特性，諸如snr。在一些情況中，錐形孔幾何結構可以導致分析物在感測電極表面上更牢固和/或可重複的放置1701。圖18顯示了與印刷電路板(pcb)配接的傳感器晶片的實例。pcb1800將傳感器晶片1801容納在插座中。在該例子中，利用絲焊製造從pcb至傳感器晶片的電連接1802。可以利用聚二甲基矽氧烷(pdms)1803將晶片和絲焊流體地且電學上絕緣。圖19顯示了可以集成有傳感器的流體池的實例。圖19的左部分描繪了流體池的分解視圖以顯示內部結構，同時圖19的右部分顯示了組裝時的流體池的圖片。底部流體池1900可以由聚四氟乙烯(ptfe)製造並可以形成用於底部流體儲器1901的流體密封。儲器可容納電解質並具有用於底部電極的開孔以接觸電解質。流體池可以設計為安裝集成有pcb1902的傳感器，如圖18中所描述。頂部流體池1903也可以由ptfe製造並且可以形成用於頂部流體儲器1904的流體密封。頂部流體儲器可容納電解質並具有用於頂部電極的開孔以接觸電解質。流體池還可以具有用於去離子水的儲器1905，其可以有助於使裝置工作的環境潮溼。圖20顯示了能夠操作本公開內容的傳感器的儀器。儀器可以被容納在法拉第籠2000(如，由固體銅製造)內。顯示圖19中描述的傳感器和流體池2001。儀器可以具有電極2002、外部放大器電路2003、用於放大器電路和施加靜電勢的電池組2004以及控制儀器的電纜2005。圖21a顯示了集成的傳感器陣列的實例。陣列可以具有任意數目的傳感器，例如，本領域技術人員將認識到，傳感器的具體數目不重要，無論多個傳感器是最小值或達若干/數百萬。在一些情況中，陣列的個體傳感器中每個是個體可尋址的。個體可尋址的傳感器可以個體控制(如，具有施加至陽極或陰極的偏壓)和/或個體閱讀(如，由感測電極導出的信號)。在一些情況中，陣列的多個傳感器是作為一組可尋址的。在一些例子中，多個傳感器共享共同的陽極和/或陰極，用於施加跨越傳感器的電場。返回至圖21a，傳感器可以以任何適合的方式尋址和/或具有任何適合的集成電路。例如，電荷傳感器中每個單個池2100可以通過垂直接入電路2101尋址。陣列還可以具有靜噪電路2102、模擬-數字電路2103和水平接入電路2104。顯示池2100內細節，包括電源(如，vdd引線)2105、源極跟隨器放大器2106、選擇器(select)2107和數據2108。實例靜噪電路2102可以包括參考選擇器2109、參考存儲器(storage)2110、比較器2111、模擬數據輸出2112、閱讀存儲器2113和閱讀選擇器2114。圖21b和圖21c顯示了本公開內容的集成傳感器陣列的傳感器電路的額外的實施方式。圖22圖解了去屏蔽的物理學。當系統處於平衡2201時，靜電勢(ψ)顯示德拜長度2202內的大幅變化，抗衡離子2200有效地屏蔽電荷(-q，如，dna)。根據德拜休克爾模型，鹽濃度對德拜長度具有影響。例如，對於100毫摩爾(mm)氯化鉀(kcl)，德拜長度為大約1納米(nm)，對於10mmkcl，德拜長度為大約3.4nm，和對於1mmkcl，德拜長度為大約10nm。相反，處於平衡，淨抗衡離子電流2203(j淨)為大約零，其中抗衡離子電流的偏流分量(j偏流)2204(庫倫吸力(coulombicattraction))有效地平衡擴散分量(j擴散)2205。然而，在外場存在(非平衡條件)的情況中，抗衡離子可以流動2206。靜電勢處於非平衡2207，其中淨抗衡離子電流是非零2208(即，正)並且抗衡離子流動。可以使用任何技術，或技術的組合，製造本公開內容的傳感器，諸如光刻法。在下面提出的表2顯示了製作本公開內容的無源傳感器的方法的實例。表2-製造無源傳感器的實例方法如圖解，可以實施各種模塊和/或其他基於電路的構件塊以執行本文中描述和/或附圖中顯示的操作和作業中的一個或多個。在這樣的背景中，這些模塊和/或構件塊代表執行這些或相關操作/作業中的一個或多個的電路。例如，在一些實施方式中，一個或多個模塊和/塊為離散的邏輯電路或可編程的邏輯電路，其配置和布置用於執行這些操作/作業，如在本文中顯示的電路模塊/塊中。在一些情況中，可編程電路是編程以執行一組(或多組)指令(和/或結構數據)的一個或多個計算機電路。指令(和/或結構數據)可以為儲存在存儲器(電路)中並從存儲器(電路)可訪問的固件或軟體形式。作為實例，第一和第二模塊/塊包括基於cpu硬體的電路和一組固件形式的指令的組合，其中第一模塊/塊包括具有一組指令的第一cpu硬體電路，和第二模塊/塊包括具有另一組指令的第二cpu硬體電路。本公開內容提供了計算機控制系統，其可以被用於調節或以其他方式控制本文中提供的傳感器和方法。例如，本公開內容的控制系統可以被編程以控制工藝參數以感測分析物。圖23顯示了計算機系統2301，其被編程或以其他方式配置以調節傳感器的操作。例如，計算機系統2301可以調節流速、溫度、壓力、機械操縱、施加的電壓或其他電輸入和/或輸出等。計算機系統2301包括中央處理單元(cpu，本文中也為「處理器」和「計算機處理器」)2305，其可以是單核或多核處理器，或用於並行處理的多個處理器。計算機系統2301還包括內存或內存位置2310(如，隨機存取存儲器、只讀存儲器、快閃記憶體)、電子存儲單元2315(如，硬碟)、與一個或多個其他系統通信的通信接口2320(如，網絡適配器)和外圍裝置2325，諸如高速緩存、其他存儲器、數據存儲器和/或電子顯示器適配器。內存2310、存儲單元2315、接口2320和外圍裝置2325通過通信總線——諸如主板——與cpu2305通信。存儲單元2315可以是用於存儲數據的數據存儲單元(或數據存儲庫)。cpu2305可以執行一系列機器可讀指令，機器可讀指令可以嵌入程序或軟體中。指令可以存儲在存儲位置，諸如內存2310。由cpu2305執行的操作的實例可以包括讀取、解碼、執行和寫回。存儲單元2315可以存儲文件，諸如驅動程序、程序庫和保存程序。存儲單元2315可以存儲由用戶生成的程序和記錄的會話，以及與程序相關的輸出(一個或多個)。存儲單元2315可以存儲用戶數據，如用戶首選項和用戶程序。在一些情況中，計算機系統2301可以包括一個或多個額外的數據存儲單元，這些存儲單元位於計算機系統2301外部，諸如位於通過內網或網際網路與計算機系統2301通信的遠程伺服器。計算機系統2301可以與系統2330通信，其包括具有集成的流體和/或處理元件的裝置。這樣的處理元件可以包括傳感器、流量調節器(如，閥)和配置為引導流體的泵送系統。如本文中所描述的方法可以經由儲存在計算機系統2301的電子存儲位置——諸如在內存2310或電子存儲單元2315上——的機器(如，計算機處理器)可執行的代碼實施。機器可執行或機器可讀代碼以軟體的形式提供。在使用期間，代碼可以由處理器2305執行。在一些情況中，代碼可以從存儲單元2315取回並存儲在內存2310上，準備由處理器2305訪問。在一些處境中，電子存儲單元2315可以被排除，以及機器可執行指令被儲存在內存2310上。代碼可以被預編譯並配置為供具有適於執行代碼的處理器的機器使用，或可以在運行期間被編譯。可以以程式語言提供代碼，程式語言可以選擇為使代碼能夠以預編譯或編譯時(as-compiled)的形式執行。本文中提供的系統和方法的方面，諸如計算機系統2301，可以包含在編程中。技術的各個方面可以被認為是通常以攜帶在一類機器可讀介質上或包含在一類機器可讀介質內的機器(或處理器)可執行的代碼和/或相關數據的形式的「產品」或「製品」。機器可執行代碼可以被存儲在電子存儲單元上，諸如內存(如，只讀存儲器、隨機存取存儲器、快閃記憶體)或硬碟。「存儲」型介質可以包括計算機、處理器等的有形存儲器的任意一種或所有，或其相關模塊，諸如各種半導體(電路)存儲器、磁帶驅動器、磁碟驅動器等，其可以提供在任意時間的非臨時存儲，用於軟體編程。軟體的所有或部分有時可以通過網際網路或各種其他遠程通信網絡通信。例如，這樣的通信可以能夠從一個計算機或處理器加載軟體進入另一個，例如，從管理伺服器或主機進入應用伺服器的計算機平臺。因此，可以負載軟體元件的另一類介質包括光、電和電磁波，諸如通過有線或光地上通信線(landline)網絡和越過空中鏈路用來跨過本地裝置之間的物理接口。負載這樣的波的物理元件，諸如有線或無線鏈路、光學鏈路等，也可以被看作負載軟體的介質。如本文中所使用，除非限制在非臨時、有形「存儲」介質，術語諸如計算機或機器「可讀介質」指參與向處理器提供指令用於執行的任何介質。因此，機器可讀介質——諸如計算機可執行代碼——可以採取許多形式，包括但不限於有形存儲介質、載波介質或物理傳輸介質。非易失性存儲介質包括，例如，光碟或磁碟，諸如任意計算機(一個或多個)等中的任意存儲裝置，可被用於實施附圖中所示的資料庫等。易失性儲存介質包括動態存儲器，諸如這樣的計算機平臺的主存儲器。有形傳輸介質包括同軸電纜；銅線和光纖，包括包含計算機系統內的總線的線。載波傳輸介質可以採取電或電磁信號、或聲或光波的形式，聲或光波諸如在射頻(rf)和紅外(ir)數據通信期間產生的那些。因此，例如，計算機可讀介質的常見形式包括：軟盤、軟磁碟、硬碟、磁帶、任意其他磁介質、cd-rom、dvd或dvd-rom、任意其他光介質、穿孔卡片紙帶、任意具有孔圖案的其他物理儲存介質、ram、rom、prom和eprom、flash-eprom、任意其他存儲器晶片或卡盤、傳輸數據或指令的載波、傳輸這樣的載波的電纜或鏈路、或任意其他介質，計算機可以從該介質閱讀編程代碼和/或數據。這些形式的計算機可讀介質中許多可以向處理器提供一條或多條指令的一個或多個序列用於執行。由上述應當理解，雖然已經圖解並描述了具體的實施，但是可以對其進行各種修改並且本文中考慮這些修改。例如，本文中描述的實施方式可以組合或修改以又得到更多本發明的實施方式。由說明書內提供的具體實例也非旨在限制本發明。雖然已經參考前述說明書描述了本發明，本文中優選的實施方式的描述和說明不意味著以限制含義解釋。此外，應當理解，本發明的所有方面不限於本文中陳述的依賴多種條件和變量的具體的描繪、配置或相對比例。本發明的實施方式的形式和細節的各種修改對本領域技術人員將是明顯的。因此，應當考慮，本發明也將覆蓋任何這樣的修改、變化和等效形式。所附權利要求旨在限定本發明的範圍並且因而覆蓋這些權利要求和其等效形式的範圍內的方法和結構。當前第1頁12