用於感染性疾病B肝病毒、梅毒螺旋體、愛滋病毒和C肝病毒診斷的基因晶片的製作方法

2023-08-07 23:05:31 2

專利名稱：用於感染性疾病B肝病毒、梅毒螺旋體、愛滋病毒和C肝病毒診斷的基因晶片的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因技術領域，涉及一種基因晶片，尤其涉及一種感染性疾病診斷的基因晶片。
基因晶片是二十世紀九十年代發展起來的一項前沿生物技術。將大量的靶基因片段有序地、高密度地(點與點之間的距離一般小於500μm)排列在玻璃、矽等載體上，稱之為基因晶片。基因晶片從製作上可分為兩大類原位合成法(DNAchip)和微矩陣法(DNA mircoarray)，原位合成法由Affymetrix公司的Fodor等發明，他們將半導體中的光蝕刻技術運用到DNA合成化學中，用單核苷酸或其它生物大分子為底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸，每次循環都有特定的核苷酸結合上去，直到設定的寡核苷酸長度，每個寡核苷酸片段代表了一種特定的基因，存在於DNA晶片的特定位置上。微矩陣法最早由Stanford大學的P.Brown等發明，將PCR等方法得到的cDNA用針點或噴點的方法直接排列到玻片等介質上，從而製備成晶片。
基因晶片可以用螢光檢測和計算機軟體進行數據的比較和分析，以達到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。
基因晶片的概念可追溯到southernblot雜交技術，即DNA-DNA之間通過鹼基配對機制形成互補鏈。隨後又發展出northernblot雜交和點雜交技術。這三種技術都是將核酸樣品固定在濾膜上，樣品容易擴散，因此在單位面積上點樣的密度受到限制，無法進行大規模、高通量的DNA雜交。同時，由於濾膜面積較大而需較多探針量，檢測靈敏度較低。為了提高點樣密度和檢測靈敏度，降低探針用量，以玻璃、矽等材料為載體的基因晶片技術逐步得到了發展。
美國affymetrix公司於二十世紀八十年代末至90年代初，率先開展了這方面的研究。1992年，該公司運用半導體照相平板技術，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，誕生了世界上第一塊基因晶片。同時，探針的螢光標記，雷射共聚焦掃描和計算機分析等技術也隨之發展。1995年，第一塊以玻璃為載體的基因晶片(微矩陣)在美國Stanford大學誕生，這標誌著基因晶片技術步入了廣泛研究和應用的時期。
原位合成寡聚核苷酸晶片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等優點，適用於DNA序列測定、SNP分析等。但其缺點是合成寡聚核苷酸長度有限，因而基因特異性差，而且隨長度的增加合成錯誤率隨之增高，作為基因表達譜研究遠不如cDNA晶片。cDNA晶片是將微量cDNA片段在玻璃等載體上按矩陣密集排列並固化，也叫微矩陣(Microarray)。基因點樣密度雖不及原位合成寡聚核苷酸晶片高，但比用傳統載體，如混合纖維素濾膜或尼龍膜的點樣密度要高得多，可達到每張載玻片4萬個基因。而cDNA晶片最大的優點是靶基因檢測特異性非常好，用作表達譜研究結果可靠。目前許多國家實驗室和大製藥公司都用此類晶片。
基因晶片最早是由於高通量、大規模研究基因功能的需求而產生的，但隨著基因晶片技術的日漸成熟，人們驚喜地發現基因晶片在傳染性疾病和遺傳病的診斷上有獨特的應用前景和巨大的商業市場。感染性病原體診斷晶片就是將待測病原體的特徵基因片段(靶基因)固定於玻片上製成晶片，將從病人血清中抽提出病原體的DNA或RNA經擴增標記螢光後與晶片進行雜交，雜交信號由掃描儀掃描，再經計算機分析，判斷陰陽性。診斷晶片區別於其他檢測手段的優越性在於(1)檢測樣品為各類致病基因片段，提高了檢測效率；(2)因無需機體免疫反應，能及早診斷，且待測樣品用量較少；(3)診斷晶片技術是DNA雜交技術和螢光標記技術相結合的分子診斷方法，有極高的靈敏度、特異性和可靠性；(4)自動化程度高，利於大規模推廣應用。
在疾病診斷方面，已有一些單一疾病基因診斷晶片產品上市，例如美國的Affymetrix公司已利用基因晶片進行愛滋病(HIV)的研究工作，並有商業化的GeneChipHIVPRT診斷晶片上市，用於愛滋病的早期診斷。
但晶片技術在疾病診斷上的應用尚處於起步階段，還未大面積推廣，原因主要有(1)基因晶片技術是一項全新的技術，對人才、技術、資金的要求很高，目前只有一小部分的科研機構和高科技公司完全掌握了該項技術。
(2)現有晶片通常只能診斷一種疾病，晶片檢測成本較貴，目前很難取代常規檢測方法。
(3)晶片技術，特別是在多疾病檢測的質量保證和檢測監控方面有待於發展和創新。多疾病診斷晶片是一種多基因的反應系統，因此對傳統的PCR擴增引物設計在檢出率方面提出了更高的要求；由於多疾病診斷晶片反應系統的複雜化，對反應結果的檢測監控也提出了新的技術要求。
在威脅人類健康的各種疾病中，感染性疾病一直佔有重要位置。據世界衛生組織(WHO)99年報告，98年全球共計5390萬人死亡，其中死於感染性疾病計1300萬人，佔總人數的25％，相當於平均每小時就有1500人死於該類疾病，僅次於死於心血管疾病的31％，遠高於死於癌症的13％。這1300萬人中有50％發生在發展中國家。各種肝炎一直是威脅人類生命健康的常見病、多發病。近年來，愛滋病和各種性病的傳播也呈快速增長的態勢。
尤其是血站的血液檢測，B型肝炎、C型肝炎、愛滋病、梅毒四種感染性疾病是血液檢測的常規項目，但現有的檢測手段無法在同一時間內通過一次實驗確診上述四種疾病，檢測成本高而效率比較低。為此，開發研究一種用於多種感染性疾病診斷的基因晶片，對多種感染性疾病的進行準確、高效的早期診斷已成為當務之急。
本發明的目的之一在於提供一種在一塊晶片上同時固定多種疾病基因，能夠同時檢測HBV、TP、HIV和HCV四種感染性疾病的，並具有多疾病的質量保證和檢測監控體系的基因晶片；本發明的目的之二在於公開四組與上述四種感染性病毒基因組序列的保守區相對應的高檢出率的新引物。
發明的構思是這樣的(1)本發明在一塊晶片上同時固定多種疾病基因，包括但不限於HBV、TP、HIV和HCV的基因片段，只用5-100μl血清，就可以在一天內及時準確地確認被檢者是否患有上述四種感染性疾病、患何種病，既提高了效率，也降低了成本，在診斷實踐上也大有益處；(2)多疾病診斷基因晶片涉及多種複雜的物理過程和生物化學反應，如點樣，RNA和DNA模板的製備、PCR擴增、螢光標記、雜交、洗滌、檢測等過程，以及在各步驟中可能的汙染，本發明在晶片上配備相應的質量保證和檢測監控體系，該質量保證和檢測監控體系採用陰陽對照的方法進行監測，以確保檢測的準確性，減少誤差；(3)各種感染性疾病如B型肝炎、C型肝炎、愛滋病、梅毒等，同一種疾病又具有不同的亞型。對於多疾病診斷基因晶片而言，需要對各種亞型的感染情況都能概括地檢測出結果。因此，我們將各種感染性疾病的具有代表性的保守區片段作為靶基因固定在基因晶片上時，由於多疾病診斷基因晶片是一個多對引物PCR反應系統，需要高檢出率的用於RNA、DNA模板擴增的PCR引物。我們為此根據同種病毒不同亞型之間保守序列的同源性，通過計算機分析和實驗篩選，設計出用於診斷基因晶片的適合各種亞型擴增的高檢出率的新引物。
本發明亦是這樣實現的所說的基因晶片包括兩個系統，第一部分為檢測監控系統，第二部分為疾病診斷系統。
檢測監控系統至少包括四個對照元素，分別為1．點樣液，為陰性對照(1)，若雜交後檢測無信號，表明正常；若有雜交信號，表明點樣液有汙染；2．植物基因a，為陰性對照(2)，若雜交後檢測無信號，表明正常；若有雜交信號表明系統有汙染；1或2其中之一出現雜交信號，該晶片不能使用；3．植物基因b，為陽性對照(1)，該植物基因的RNA在抽提血RNA時按一定的比例加入到待檢的血清樣品中，並隨著實驗流程進行逆轉錄。若雜交後該樣品有雜交信號為正常；若無雜交信號，表明RNA抽提過程有問題或逆轉錄不正常；4．植物基因c，為陽性對照(2)，該植物基因DNA在PCR擴增摻入螢光底物時按一定的比例加入到逆轉錄的產物中，以檢測螢光底物的摻入效率。若雜交後該樣品有雜交信號為正常；若無雜交信號，表明標記效果不理想。
所說的點樣液為一種包含離子多聚物的緩衝液，可以採用美國Telechem公司生產的、商品名為Micro-Spotting Solution的點樣液；所說的植物基因a的基因序列如下述的植物基因a Sequence a所示植物基因a Sequence aArabidopsis thaliana(擬南芥)SUPERMAN(sup)geneAATTGCCAACAGGATCATGATTATCTTCTAGGGTTTTCATGGCCACCAAGATCCTACACTTGCAGCTTCTGCAAAAGGGAATTCAGATCGGCTCAAGCACTTGGTGGCCACATGAATGTTCACAGAAGAGACAGAGCAAGACTCAGATTACAACAGTCTCCATCATCATCTTCAACACCTTCTCCTCCTTACCCTAA-CCCTAATTACTCTTACTCAACCATGGCAAACTCTCCTCCTCCTCATCATTCTCCTCTAACCCTATTTCCAACCCTTTCTCCTCCATCCTCACCAAGATATAGGGCAGGTTTGATCCGTTCCTTGAGCCCCAAGTCAAAACATACACCAGAAAACGCTTGTAAGACTAAGAAATCATCTCTTTTAGTGGAGGCTGGAGAGGCTACAAGGTTCACCAGTAAAGATGCTTGCAAGATCCTGAGGAATGATGAAATCATCAGCTTGGAGCTTGAGATTGGTTTGATTAACGAATCAGAGCAAGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAATTAGATGGTAATAACTTTATCCATAAAGGATTCG--AAGTTCACAATTCTAGAAGATATGATGCTTCTCTAAGGTTAATTAGTTTCATCCATATGAAATTCTCTAAGCTTGCTATTTAGTAGAACG該植物基因a可通過對擬南芥SUPERMAN(sup)gene克隆獲得，此為已有技術。
所說的植物基因b的基因序列如下述的植物基因b Sequence b所示植物基因b Sequence b(陰影部分為其PCR擴增引物序列)水稻Usn 5sRNA gene AGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGAGCGAGCTCAATGGCTACAGGACCAACCTTATCAAAGAGAGCATCAGAATGGGTTACAATGACATTGGTGANGGCTTCTATGCTCATGGCCACCTTTCAGATGCCTTCAAAAGCTACATCCGTACACGTGATTATTGTACCACTTCCAAGCATATAGTTCAGATGTGTATGAATGTGATTCT 該植物基因b可通過對水稻Usn 5sRNA gene克隆獲得，此為已有技術。
所說的植物基因c的基因序列如下述的植物基因c Sequence c所示植物基因c Sequence c(陰影部分為其PCR擴增引物序列)水稻Usn 5sRNA gene ACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATNNCGTCGACCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTACTAAGAGTTACTATGCATCACAGTACCAGCTCTAAGCATTTATATTTTAAAAAATAGCTTGGCCTCAAATGTGACAGATCGTTCTGTCAAGTCTCTAGATGCTTAAATATCCAGAGCTGTTTACACAGCATCATATTTAAAACCACA
該植物基因c可通過對水稻Usn 5sRNA gene克隆獲得，此為已有技術。
疾病診斷系統至少將四種感染性疾病病原體的保守區中的兩種作為靶基因固定在晶片上，具體如下HBV病毒靶基因選自HBV病毒的保守區，共設計了2個保守區段。若其中一個雜交有信號，即表明該血清樣品含有HBV病毒，為陽性血清；若2個均沒有雜交信號，則為陰性血清；梅毒螺旋體TP病毒靶基因選自TP病毒的保守區，共設計了4個保守區段。若其中一個雜交有信號，即表明該血清樣品含有TP病毒，為陽性血清；若4個均沒有雜交信號，則為陰性血清；HIV病毒靶基因選自HIV病毒的保守區，共設計了4個保守區段。若其中一個雜交有信號，即表明該血清樣品含有HIV病毒，為陽性血清；若4個均沒有雜交信號，則為陰性血清；HCV病毒靶基因選自HCV病毒的保守區，共設計了4個保守區段。若其中一個雜交有信號，即表明該血清樣品含有HCV病毒，為陽性血清；若4個均沒有雜交信號，則為陰性血清；所說的HBV、TP、HIV、HCV病毒保守區靶基因為已有公開技術，其基因序列如下HBV保守區HBV sequence 1250 TCTAGATACCGCCTCAGCTCTATATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTTAGTTATGTTAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAAATCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACAGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCAC 543HBV sequence233 CTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCATATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCG 211TP保守區TP sequence193CGCAGACTGCTTGGTAGAGAGCGCCAGCGCGCTTTCCCGGCGTTGGGGGATCAGCGAAGCGCTCCTGGGCGCCACGCTCGTGAGCCTGGGCACCACCACCCCCGAGGCAGCCGTGTCTGTATACGCTGCGCTCTGCGGCAACGCCGACTTAGCACTCGGAAACGCCATAGGATCCATCGTGTGGATACCGGTTTCATTCTCGGACTCGGGGCACTCCTTGCACGCCCCGGGCTCGCGCTC GACACACACTTGATGCGCCGGCACGCGCGGGTGCAATTGTTCGTCGTATGCGCGC 388TP sequence2681 AGC CGCAACCATC ATCGCCTTTGGCACCAGCGTGCCAGAACTCGTCTCTGCCATCACCGCAGTACGCCGCGGACACGGCGCACTGGCAGTGGGAAACATAGTAGGTGCGGATATCCTCAATGTGCTGTTTGTAGTCGGAGCTG CCGCGTCTCT TACGCCACAC GGCCTGCCGG TGCCAAAAATCTTTTCTCTG CTACACCTGC CTGCCATGCT GTTAGTCGTG GGAATCTTTCACGCGTGCGCACTCGGCCGCAGGACCCTCACCCGCCCTGCCGGTGTGCTCCTGTGCGCGGTATATGGGCTGTTCGTGCTGCTAAACGGATTGCTCAGGGGCACAGGACCCTAATCGGAGTCAGAGAGCGGTCCAGGCTTTCCATTCATGTCCGCAAGATATCCTGCAAGGGTGTGGCACG TTGCGCGCGCCTCTGCCAGT TTCTTGCGCT CTGCGGTCAC 1113TP sequence3118 A ATACAGGACT TCCAGCGCAT GGCCGTACGT GTGTTGTACG TACAGCCTGCTCTACCTAGG CTTTCAGGGT AGCACCAAGC ATCCAAATGG CCTTTCCCAACGTCCTCAGT ATGTCTGTGA TAATGCCGTC AGTCACTGCA TCCCCACTTTCAGCTGCAAG TACTTGCGTT TGGCTGAATC GCGTACTTAG GTATTCAAAATCCCGCTTTA CGCGCGCAAG CGCAGAGACG ATAGTGATCT CTTTCTCCGTCTCTTCTGCA ATTCCACTCA ACGCAAGGTA TTCAGCCATA GACGCA 414TP sequence4598CGCAGATAGCAGCAATGGCACGAGCGTCCGGTACACCGGGGGCGCTGGCTCCAACTGCAGCGCTCGTGGCGGTGCTGTGGTATTTTTTTCCATCTGTACACATGTTCATCGTTCTTTCTCCTCCAAACTTTAAAGCAAAAACCATGCCAACAAAAAATCGAAAGAAATGGAGCATAACCACTGTCTTTTTGGACTTTTCCCGGCTTTTTTTCACCGATTGGTAAAATAATCATTTATTTTCACCGAGATTTCGTGAAGTTTCAGCGAAATCTTTTTTCCAGGAGACGTAATTCTCAATCCACCAAGCCTC C 908HIV保守區HIV sequence1
225 AGCTCT CTCGACGCAG GACTCGGCTT251 GCTGAAGCGC GCACGGCAAG AGGCGAGGGG CGGCGACTGG TGAGTACGCC301 AAAAATTTTG ACTAGCGGAG GCTAGAAGGA GAGAGATGGG TGCGAGAGCG351 TCAGTATTAA GCGGGGGAGA ATTAGATCGA TGGGAAAAAA TTCGGTTAAG401 GCCAGGGGGA AAGAAAAAAT ATAAATTAAA ACATATAGTA TGGGCAAGCA451 GGGAGCTAGA ACGATTCGCA GTTAATCCTG GCCT 484HIV sequence2762 GTACATCAG GCCATATCAC CTAGAACTTT AAATGCATGG801 GTAAAAGTAG TAGAAGAGAA GGCTTTCAGC CCAGAAGTGA TACCCATGTT851 TTCAGCATTA TCAGAAGGAG CCACCCCACA AGATTTAAAC ACCATGCTAA901 ACACAGTGGG GGGACATCAA GCAGCCATGC AAATGTTAAA AGAGACCATC951 AATGAGGAAG CTGCAGAATG G 971HIV sequence34267GGTA AGAGATCAGG CTGAACATCT TAAGACAGCA4301 GTACAAATGG CAGTATTCAT CCACAATTTT AAAAGAAAAG GGGGGATTGG4351 GGGGTACAGT GCAGGGGAAA GAATAGTAGA CATAATAGCA ACAGACATAC4401 AAACTAAAGA ATTACAAAAA CAAATTACAA AAATTCAAAA TTTTCGGGTT4451 TATTACAGGG ACAGCAGAAA TCCACTTTGG AAAGGACCAG CAAAGCTCCT4501 CTGGAAAGGT GAAGGGGCAG TAGTAATACA AGATAATAGT GACATAAAAG4551 TAGTGCCAAG AAGAAAAGCA AAGATCATTA GGGATTATGG AAAACAGATG4601 GCAGGTGATG ATTGTGTGGC AAGTAGACAG GAT 4633HIV sequence47244GAACCAT7251 TAGGAGTAGC ACCCACCAAG GCAAAGAGAA GAGTGGTGCA GAGAGAAAAA7301 AGAGCAGTGG GAATAGGAGC TTTGTTCCTT GGGTTCTTGG GAGCAGCAGG7351 AAGCACTATG GGCGCAGCCT CAATGACGCT GACGGTACAG GCCAGACAAT7401 TATTGTCTGG TATAGTGCAG CAG 7423HCV保守區HCV sequence1261 GCCTTGTGGT ACTGCCTGAT AGGGTGCTTG CGAGTGCCCC301 GGGAGGTCTC GTAGACCGTG CACCATGAGC ACGAATCCTA AACCTCAAAG AAAAACCAAA361 CGTAACACCA ACCGCCGTCC ACAGGACGTC AAGTTCCCGG GCGGTGGTCA GATCGTTGGT421 GGAGTTTACC TGTTGCCGCG CAGGGGCCCC AGGTTGGGTG TGCGCGCGCT CAGGAAGACTHCV sequence24651 GGCTTTACCG GCGACTTTGA CTCAGTGATC4681 GACTGTAACA CATGTGTCAC CCAAACAGTC GATTTCAGCT TGGACCCTAC CTTCACCATT4741 GAGACGACGA CCGTGCCCCA AGACGCAGTG TCGCGCTCGC AACGGCGAGG CAGGACTGGT4801 AGGGGCAGGA GAGGCATCTA CAGGTTTGTG ACTCCGGGAG AGCGGCCCTC GGGCATGTTC4861 GATTCCTCGG TCCTGTGTGA GTGCTATGAC GCGGGCTGTG CTTGGTATGA GCT 4913HCV sequence36117 CACG6121CACTATGTGC CTGAGAGCGA CGCCGCAGCG CGTGTCACTC AGATCCTCTC CAGCCTTACC6181 ATCACCCAGC TGTTGAAGAG GCTCCACCAG TGGATTAACG AGGACTGCTC CACGCCATGC6241 TCCGGTTCGT GGCTAAGGGA TGTTTGGGAC TGGATATGCA CGGTGT 6286HCV sequence48424 AAGCGGC GTGCTGACGA CTAGCTGCGG TAATACCCTT8461 ACATGTTACT TGAAGGCCTC TGCGGCCTGT CGAGCTGCAA AGCTCCAGGA CTGCACGATG8521 CTCGTGTGCG GAGACGACCT CGTCGTTATC TGTGAAAGCG CGGGAACCCA AGAGGACGCG8581 GCGAGCCTAC GAGTCTTCAC GGAGGCCATG ACTAGGTACT CTGCCCCCCC CGGGGACCCG8641 CCCCAACCAG AATACGACCT GGAGCTGATA ACATCATGCT CCTCGAATGT GTCGGTCGCG8701 CACGATGCAT CCGGCAAGAG AGTATACTAC CTCACCCGTG 8740所說的基因晶片中，上述作為靶基因的保守區序列可通過DNA合成儀合成或克隆取得，並經PCR擴增，以上方法為常規方法，具體方法可見〖分子克隆實驗指南〗，科學出版社98版上公開的技術，此處不再贅述。擴增產物可以採用常規方法點樣(點樣的具體方法可見Cartisian7500點樣儀的使用)於特殊處理的玻片上。
同時，為檢測出血清中可能存在的多種RNA、DNA病原體，亦需同時製備血清中多種感染性病原體的RNA、DNA模板，該製備方法為常規方法。但上述步驟所獲得的血清中多種感染性病原體的RNA、DNA模板，必須進行PCR擴增並螢光標記探針，才能與晶片上的靶基因進行雜交。為此，本發明設計了一系列針對所需診斷的感染性疾病病毒靶基因的高檢出率的引物，分別表述如下1．HBV擴增引物的設計一共設計了二對引物，其序列如下HBV primer1HBV1:5′ TCT AGA TAC CGC CTC AGC TC 3 pre c 和 c geneHBV 1 C:5 GTG CGA ATC CAC ACT CCG AA 3 pre c 和 c geneHBV primer2HBV2: 5 CTA GGA GGC TGT AGG CAT AA 3 pre c 和c geneHBV2C: 5 CGA GAG TAA CTC CAC AGT AG 3 pre c 和 c gene2．TP擴增引物的設計一共設計了四對引物，其序列如下TP primer1TP1: 5 CGC AGA CTG CTT GGT AGA GA 3 gene Tp1034TP1C:5 GCG CGC ATA CGA CGA ACA AT 3 gene Tp1034TP primer2TP2: 5 AGC CGC AAC CAT CAT CGC CT 3 gene Tp1034TP2C: 5 GTG ACC GCA GAG CGC AAG AA 3 gene Tp1034TP primer3TP3: 5 AAT ACA GGA CTT CCA GCG CA 3 gene TYF1TP3C: 5 TGC GTC TAT GGC TGA ATA CC 3 gene TYF1TP primer4TP4: 5 CGC AGA TAG CAG CAA TGG CA 3 gene TYF1TP4C: 5 GGA GGC TTG GTG GAT TGA GA 3 gene TYF13．HIV擴增引物的設計一共設計了四對引物，其序列如下HIV primer1HIV1: 5 AGC TCT CTC GAC GCA GGA CT3HIV1C: 5 AGG CCA GGA TTA ACT GCG AA3HIV primer2HIV2: 5 GTA CAT CAG GCC ATA TCA CC 3HIV2C: 5 CCA TTC TGC AGC TTC CTC AT 3HIV primer3HIV3: 5 GGT AAG AGA TCA GGC TGA AC 3HIV3C: 5 ATC CAG TCT ACT TGC CAC AC 3HIV primer4HIV4: 5 GAA CCA TTA GGA GTA GCA CC 3HIV4C: 5 CTG CTG CAC TAT ACC AGA CA 34．HCV擴增引物的設計一共設計了四對引物，其序列如下HCV primer1HCV1: 5 GCC TTG TGG TAC TGC CTG AT 3HCV1C: 5 ACC GCT CGG AAG TCT TCC TG 3HCV primer2HCV2: 5 GGC TTT ACC GGC GAC TTT GA 3HCV2C: 5 AGC TCA TAC CAA GCA CAG CC 3HCV primer3HCV3: 5 CAC GCA CTA TGT GCC TGA GA 3HCV3C: 5 ACA CCG TGC ATA TCC AGT CC 3HCV primer4HCV4: 5 AAG CGG CGT GCT GAC GAC TA 3HCV4C: 5 CAC GGG TGA GGT AGT ATA CTC T 3上述引物可以採用DNA合成儀人工合成並經HPLC純化，該方法為一種現有的技術，本發明不再贅述。
所說的引物的可以對同一病原體的各種亞型進行擴增，大大提高了診斷晶片上病原體檢出率。擴增採用〖分子克隆實驗指南〗，科學出版社98版上公開的技術，此處不再贅述。以下將通過附圖對本發明所說的基因晶片作詳細的說明。


圖1為所說的基因晶片的示意圖。圖中A--------------檢測監控系統B--------------疾病診斷系統1--------------點樣液2--------------植物基因a3--------------植物基因b4--------------植物基因c5--------------HBV病毒靶基因6--------------HCV病毒靶基因7--------------HIV病毒靶基因
8--------------TP病毒靶基因圖2為用於基因晶片診斷疾病的操作流程圖。
由
圖1可見，檢測監控系統A由點樣液1、植物基因a2、植物基因b3和植物基因c4所組成；疾病診斷系統B由HBV病毒靶基因5、HCV病毒靶基因6、HIV病毒靶基因7和TP病毒靶基因8所組成；每一種病毒靶基因均由每一種病毒的若干保守區所構成。
用上述公開的新的引物擴增並螢光標記探針，並與所說的基因晶片進行雜交，即可對人體的感染性病毒進行診斷，用螢光掃描儀掃描，並使用分析軟體分析雜交結果。掃描結果顯示正對照有螢光信號；負對照沒有螢光信號，根據信號的有無來判斷待測樣品是陰性還是陽性。
由上述公開的技術方案可見，由於所說的晶片可以同時對多種感染性病毒進行檢測，大大縮短了診斷時間，並大大提高了診斷的準確性又降低了診斷成本。將具有十分深遠的意義。
以下將通過實施例對本發明的有關細節作進一步的闡述，但實施例並不限制本發明的保護範圍。
實施例1HBV擴增引物一共設計了兩對引物，其中HBV primer1序列如下HBV primer1HBV1:5′TCT AGA TAC CGC CTC AGC TC 3 pre c和c geneHBV 1 C:5 GTG CGA ATC CAC ACT CCG AA 3 pre c和c gene上述序列可採用DNA合成儀進行人工合成並用HPLC純化，具體見〖分子克隆實驗指南〗第538頁，科學出版社98版。
所有其他的擴增引物亦可採用以上方法合成。
實施例2診斷晶片探針製備2.1目的從病人血液中製備RNA病毒標本，通過反轉錄等步驟使樣品帶有Cy3或Cy5的螢光標記，同時製備血清中多種感染性病原體DNA和RNA模板。2.2製備方法2.2.1製備步驟1血清樣品DNA、RNA抽提前處理液配製成120ul/管(其中10％為焦碳酸二乙酯(DEPC),90％為無水乙醇)步驟1．10ul前處理液加100ul血清、植物基因b 0.1ng一起混勻。2．37℃,6分鐘。3．沸水浴10分鐘。4．65℃烘乾15分鐘。(烘乾時把管子蓋子打開)。5．15000轉/分鐘，離心5分鐘，備用。注65℃烘乾必須用水浴鍋，烘乾時把水浴鍋蓋子打開。2.2.2製備步驟2反轉錄製備模板DNA2.2.2.1向步驟1製備含的DNA、RNA沉澱的eppendorf管內，依次加入下列試劑Milli-Q H2O(超純水) 11μl15μmol/l HCV、HIV、植物基因b反轉錄引物2μl用手指彈eppendorf管底部充分溶解沉澱，混勻樣品，5000rpm離心5sec，置於70℃水浴鍋內保溫5min。2.2.2.2取出該eppendorf管，置於冰上1min,5000rpm離心5sec。2.2.2.3向該eppendorf管內依次加入以下試劑0.1mol/l DTT(二硫蘇糖醇) 2μl逆轉錄緩衝液(buffer) 4μl10mmol/l dATP-dGTP-dCTP-dTTP昆和物 1μl用手指彈eppendorf管底部10次，混勻樣品，5000rpm離心5分鐘，置於42℃水浴鍋內保溫2分鐘。
其中，逆轉錄緩衝液buffer配方如下配45ml,165ul/管10×逆轉錄緩衝液 6mlDEPC-H2O 39ml,10×逆轉錄緩衝液配方如下配40ml,pH8.2,1M Tris-HCl 10ml
1M Kcl 20ml10mg/ml明膠4mlDEPC-H2O 6ml2.2.2.3向該eppendorf管內加入0.5μl SuperScriptⅡ反轉錄酶，用手指彈eppendorf管底部10次，混勻樣品，5000rpm離心5分鐘，置於42℃水浴鍋內保溫20分鐘。2.2.2.4從水浴鍋內取出eppendorf管，備用。2.2.3製備步驟3PCR標記探針2.2.3.1吸取5μl步驟2中製備的轉錄產物和10mM的HBV、TP、植物基因c各1μl於0.2ml薄壁管管中，並依次加入下列試劑ddH2O 28.5μl10×PCR Buffer 5μl25mmol/l MgCl224μl10mmol/l dATP-dGTP-dCTP昆合物1μl1mmol/l dTTP 1μl0.1mmol/l Cy3-dUTP 1μl0.1mmol/l Cy5-dUTP 1μl15μmol/l HBV、HCV、HIV、TP、植物基因b、植物基因c引物混合物1μlTaq酶 0.5μl用手指彈eppendorf管底部10下，混勻樣品。2.2.3.2將薄壁管置於MJ Research PTC-225 PCR儀中按下列程序進行PCR反應①95℃1.5min②95℃20sec③55℃20sec④72℃2min⑤goto②for 39 cycles⑥72℃5min
⑦4℃forever(待機)⑧END2.2.3.3取出薄壁管，-20℃蔽光保存。2.2.4 製備步驟4產物DNA的純化使用MicroSpin S-200 Columes試劑盒提供的S-200純化柱純化DNA。2.2.5 製備步驟5標記效果檢查2.2.5.1用10μl移液器吸取微量(0.5μl)的標記產物，分點3個於一個乾淨的玻片上。2.2.5.2將點上樣品的玻片置於80℃烘箱中乾燥1分鐘。2.2.5.3將乾燥的玻片用ScanArray 3000掃描儀掃描，觀察標記效果，與標準曲線作比較，讀出標記核苷酸的濃度(Cn)，按如下公式換算標記探針的總量(T):T=50Cn。ScanArray 3000掃描儀使用方法見附錄。2.3質量指標檢測出的探針總量(T)應大於0.5ng(暫定)。
實施例3基因晶片的應用及結果分析感染性病原體診斷晶片是將待測病原體的特徵基因片段(靶基因)固定於玻片上製成晶片，將從病人血清中抽提出病原體的DNA或RNA經擴增標記螢光製成探針，與晶片進行雜交，雜交信號由掃描儀掃描，再經計算機分析，判斷陰陽性。診斷基因晶片的應用步驟包括生物信息分析、晶片設計、模板DNA製備、靶基因PCR、點樣、診斷晶片探針製備、雜交、結果分析等步驟，具體流程見圖2。1．生物信息分析，晶片設計，具體內容見本文技術方案；2．病毒基因保守區DNA、RNA的選擇與模板的製備，具體內容見本文技術方案；3．靶基因PCR(PCR步驟見「分子克隆實驗指南」科學出版社98版)3.1於0.2ml薄壁管內加入ddH2O 36.3μl150ng/μl模板DNA1μl25μmol/L引物 1μl輕彈管壁2次以混勻樣品。3.2 將薄壁管置於MJ RESEARCH PR PTC 225 PCR儀中95℃變性2min。3.3 立即置於冰上，在每孔中加入酶混合液10×buffer5μl25mmol/L MgCl24μl10mmol/L dNTP 2μlTaq酶 0.7μl用槍來回吸打3次，充分混勻樣品。3.4 將薄壁管置於MJ RESEARCH PCT 225 PCR儀按下列順序進行擴增①95℃20sec②55℃20sec③72℃ 2min④循環①-③步驟39次⑤72℃5min⑥4℃ forever(待機)⑦END3.5 從PCR儀中取出反應管，取1μl走電泳。通常每管PCR產物總量應達到2-5μg。3.6 取2-5次相同PCR產物合併到一1.5ml eppendorf管中，加入1/10vol3MNaAC(PH5.2)，或加入等體積異丙醇，來回吸排混勻，20℃過夜。3.7 4℃12000rpm離心10min。3.8 棄上清，加入500μl 75％乙醇顛倒洗滌3次，4℃12000rpm離心5min。3.9 輕輕倒去上清，倒置於吸水紙上，室溫乾燥10min。4．診斷晶片探針製備，具體內容見實施例2。5．點樣5.1 Poly Lysine玻片上的點樣5.1.1 將乾燥的PCR產物溶於8μl ddH2O中，取出0.5μl走1％瓊脂糖膠電泳，估計濃度，濃度應大於1μg/μl。5.1.2 向溶解的PCR產物加入等體積的2×Spot溶液中(Sigma)，再用1×Spot溶液調整濃度為0.5μg/μl,Biofuge fresco離心機12000rpm離心10min。]5.1.3 用Carstisian 7500點樣儀進行點樣。5.1.4 將點樣後的玻片置溼潤的鋁質飯盒中2hr，進行再水合。5.1.5 100℃強烈乾燥1min,4℃保存或進行以下操作。5.1.6 置紫外交聯儀中，能量值設定60mj/cm2，時間設置5min。5.1.7 將玻片插入盛有0.2％SDS(十二烷基硫酸鈉)的染色缸內2min。5.1.8 在晶片上覆蓋200μl琥珀酸酐溶液處理15min。5.1.9 置於盛有ddH2O的染色缸內浸泡5min，重複2次。5.1.10晾乾，密封存於4℃冰箱或立即使用。5.2 矽化玻片上的點樣5.2.1 將乾燥的PCR產物溶於8μl ddH2O中，取出0.5μl走1％瓊脂糖凝膠電泳，估計濃度，濃度應大於1μg/μl。5.2.2 向溶解的PCR產物加入等體積的2×Spot溶液中(Sigma)，再用1×Spot溶液調整濃度為0.5μg/μl,Biofuge fresco離心機12000rpm離心10min。5.2.3 用Carstisian 7500點樣儀進行點樣。5.2.4 將點樣後的玻片置溼潤鋁質飯盒中4 hr，進行再水合。4℃保存或進行以下操作。5.2.5 置於紫外交聯儀中，能量值設定65mj/cm。5.2.6 置於盛有0.2％SDS溶液的染色缸內浸泡5min。5.2.7 在晶片上覆蓋300-500μl 0.2mol/L硼氫化鈉溶液處理5min。5.2.8 用ddH2O 1-2ml衝洗一下。5.2.9 95℃水浴鍋內變性2min。5.2.10 迅速置於盛有95％乙醇的染色缸內浸泡30sec。6．雜交6.1 將製備的經抽乾的探針加入6.5μl預熱的6×SSPE+0.4％SDS+10xDenhardt溶液，在避光條件下充分振蕩溶解DNA，加入6.5μlFormamide(甲醯胺)溶液振蕩混勻，5000rpm離心10sec。6.2 將溶解的探針和待雜交的玻片置於95℃的水浴鍋內變性2min。6.3 將變性好的探針避光冰浴。6.4 將玻片插入到盛有無水乙醇的染色缸內室溫放置30sec，取出置於95℃水浴鍋外罩上烤乾。6.5 用鑷子上端取12μl的上述探針，滴於玻片上，用鑷子上端將18×18mm蓋玻片蓋於其上，玻片置於專用玻片盒中，封上PARAFILM。6.6 將玻片盒置於6層紗布的溼潤的飯盒內，將飯盒置於Robbins Mode11000雜交爐內，42℃雜交，3hr。6.7 立即放入盛有2×SSC+0.2％SDS溶液的燒杯中，使蓋玻片自然脫落。6.8 準備三個染色缸，分別裝有2×SSC+0.2％SDS,1×SSC+0.2％SDS,0.1×SSC+0.2％SDS放入50℃水浴鍋中。6.9 將玻片依次浸入以上三個染色缸中洗滌10min。6.10再將玻片浸入裝有0.1×SSC的染色缸中涮洗10sec，避光晾乾後掃描。注Cy5對光敏感，因此操作時儘量避光。
上述Denhardt為封閉劑(50×Denhardt溶液中含5克聚蔗糖及5克聚乙烯吡咯酮和5克牛血清蛋白加水至500ml)。SSC是氯化鈉與檸檬酸鈉的混和的標準鹽溶液。7． 結果分析將玻片用ScanArray 3000掃描儀掃描，並使用Imagene軟體分析雜交結果。
掃描結果顯示正對照有螢光信號；負對照沒有螢光信號，根據信號的有無來判斷待測樣品是陰性還是陽性，由此可知被檢血清是否感染有隨檢的病毒。
權利要求
1．用於感染性疾病HBV、TP、HIV和HCV診斷的基因晶片，其特徵在於，該基因晶片包括檢測監控系統(A)和疾病診斷系統(B)兩個系統所說的檢測監控系統(A)至少包括四個對照元素，分別為陰性對照點樣液(1)、陰性對照植物基因a(2)、陽性對照植物基因b(3)和陽性對照植物基因c(4)；所說的疾病診斷系統(B)設有四種感染性疾病病原體核酸的保守區序列，分別為HBV病毒靶基因，選自HBV病毒的核酸保守區；梅毒螺旋體TP病毒靶基因，選自TP病毒的核酸保守區；HCV病毒靶基因，選自HCV病毒的核酸保守區；HIV病毒靶基因，選自HIV病毒的核酸保守區。
2．如權利要求1所述的晶片，其特徵在於，每個病原體靶基因選擇有2-4個核酸保守區序列。
3．如權利要求1所述的晶片，其特徵在於所說的點樣液為一種包含離子多聚物的緩衝液；所說的植物基因a的基因序列如Sequence a所示；所說的植物基因b的基因序列如Sequence b所示；所說的植物基因c的基因序列如Sequence c所示。
4．如權利要求1所述的晶片，其特徵在於，配備有四組針對晶片所需診斷的感染性疾病病毒靶基因的高檢出率的擴增引物，分別為一組HBV擴增引物，其核苷酸序例如HBV primer 1或HBV primer 2所示；一組HCV擴增引物，其核苷酸序例如HCV primer 1、HCV primer2、HCV primer 3或HCV primer4所示；一組HIV擴增引物，其核苷酸序例如HIV primer1、HIV primer2、HIV primer3或HIV primer4所示；一組TP擴增引物，其核苷酸序例如TP primer 1、TP primer 2、TP primer 3或TP primer4所示。
5．一組HBV擴增引物，其特徵在於，其核苷酸序例如HBV primer 1或HBVprimer 2所示。
6．一組HCV擴增引物，其特徵在於，其核苷酸序例如HCV primer 1、HCVprimer 2、HCV primer 3或HCV primer4所示。
7．一組HIV擴增引物，其特徵在於，其核苷酸序例如HIV primer 1、HIVprimer2、HIV primer3或HIV primer4所示。
8．一組TP擴增引物，其特徵在於，其核苷酸序例如TP primer1、TPprimer 2、TP primer3或TP primer4所示。
9．如權利要求1-4任一所述的基因晶片的應用，其特徵在於，可用於多種感染性病毒的診斷。
10．如權利要求1-4任一所述的基因晶片的應用，其特徵在於，可用於HBV病毒、梅毒螺旋體TP病毒、HCV病毒或HIV病毒的診斷。
全文摘要
本發明公開了一種用於感染性疾病HBV、TP、HIV和HCV診斷的基因晶片,並提供了用於診斷基因晶片的適合各種亞型擴增的高檢出率的新引物。該基因晶片包括檢測監控系統(A)和疾病診斷系統(B)兩個系統。由於所說的晶片可以同時對多種感染性病毒進行檢測,並設有檢測監控系統,不僅大大縮短了診斷時間,且大大提高了診斷的準確性,降低了診斷成本,尤其可以用於血站的血液檢測,將具有十分深遠的意義。
文檔編號C12Q1/04GK1310236SQ0011170
公開日2001年8月29日 申請日期2000年2月21日 優先權日2000年2月21日
發明者毛裕民, 謝毅, 李瑤 申請人:上海博道基因技術有限公司