作物種子鹼性脂肪酶活性平板快速檢測方法
2023-08-08 04:30:06
專利名稱：作物種子鹼性脂肪酶活性平板快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種種子中鹼性脂肪酶活性的平板檢測方法。
背景技術：
脂肪酶(E.C.3.1.1.3)是一種甘油酯水解酶，可以水解脂肪分子中的甘油酯鍵，將脂肪(甘油三酯)水解為甘油及游離脂肪酸，是脂肪分解代謝中第一個參與反應的酶，所以一般認為是脂肪水解的調速酶，對脂肪的轉化速率起著調控作用。其催化反應如下
脂肪酶廣泛存在於動、植物及微生物中，對其脂類的消化和吸收過程中起重要作用。作物種子中的脂肪酶，按其最適PH範圍可分為酸性、中性和鹼性三類。脂肪經不同類型的脂肪酶水解後同樣生成甘油和游離脂肪酸。
以水稻為例，稻穀中脂類含量約為3％，85％分布在稻穀的種皮和胚中。稻穀脂肪極易受儲藏影響。稻穀在氧氣及高溫條件下儲藏以後，脂肪極易發生水解、氧化，致使稻穀品質劣變。稻穀脂類的變化被認為是導致稻穀陳化的最主要因素。稻穀脂肪酶則是稻穀儲藏過程中脂肪酸敗變質的主要原因之一。隨著稻穀的儲藏，脂肪的分解，游離脂肪酸含量增加，脂肪酸組成發生變化，嚴重影響了稻穀的食用品質和營養品質。
長期以來，稻穀種子脂類與陳化的研究始終受到人們的關注，脂肪酶的研究主要集中於中性脂肪酶與大米的風味。但對水稻種子鹼性脂肪酶的研究由於其含量極少而很少有人重視，只是2001年印度科學家Kanchan Bhardwaj等在PlantPhysiology上發表一篇關於水稻種子鹼性脂肪酶的分離純化和特性研究的文章，該鹼性脂肪酶既具有脂肪酶活性又具有磷脂酶A2的活性，其所用的鹼性脂肪酶檢測方法為放射性同位素標記法，而對水稻等作物種子鹼性脂肪酶與稻穀儲藏陳化變質的關係未有研究。筆者通過許多實驗證明鹼性脂肪酶能攻擊儲存性脂肪和脂肪酶之間的膜相結構，而導致儲存性脂肪和中性脂肪酶之間的充分接觸，其缺失能延緩稻穀儲藏陳化變質，是稻穀儲藏的關鍵酶。
對於水稻等作物種子鹼性脂肪酶的檢測，除了上述放射性同位素標記法，目前，還沒有其他的測定方法。對於微生物鹼性脂肪酶檢測方法則大致有鹼滴定方法或用分光光度法兩類。
鹼滴定方法原理脂肪在脂肪酶的作用下產生游離脂肪酸，再利用酸鹼中和反應使酸鹼指示劑終點變色。缺點該方法只能用於大量整粒材料粉碎，且必須離心取上清，才能加底物反應，該方法的穩定性易受pH緩衝液，耗鹼體積小及指示劑終點變色不明顯影響。
分光光度法原理脂肪在脂肪酶的作用下產生游離脂肪酸，再利用脂肪酸與銅離子形成銅皂，經萃取後進行比色測定。缺點該方法也只能用於大量整粒材料粉碎，且必須離心取上清，才能加底物反應。在測定時，乳化體系、底物、體系的pH條件、溫度、反應時間和穩定時間的變化，可能會使測定結果差別較大。另外，象PVA的聚合度、乳化液製備時的攪拌速度、體系的離子強度及終止劑的不同等也會影響測定結果，並且由於反應過程的複雜性，還會帶進許多隨機誤差，難以確保測定的精密度。
發明內容
通過對水稻等作物鹼性脂肪酶活性測定方法的研究和比較，建立了一種快速、直觀、靈敏的固體瓊脂平板脂肪酶活性測定方法。本發明的測定水稻等作物種子鹼性脂肪酶的酶活的快速檢測方法主要原理利用作物種子鹼性脂肪酶在一定條件下分解三醯甘油酯，所釋放出的游離脂肪酸使指示劑(維多利亞藍)變色的原理，根據變色圈直徑的大小對酶活性進行粗略分析，特別適合於作物種子鹼性脂肪酶缺失材料的篩選和其酶提純過程中大批量樣品酶活性的估測以及酶活性條帶和其它蛋白質條帶的區分。
本發明的技術方案如下作物種子鹼性脂肪酶活性快速檢測方法，包括以下步驟(1)、取種子中的鹼性脂肪酶富集部位，用Tris-HCl緩衝液配製粗酶液；(2)、製作固體瓊脂檢測平板；(3)、在固體瓊脂平板上打孔，加粗酶液，定時觀察孔周圍的變色情況，有變色圈則表示鹼性脂肪酶活性高，無變色圈則表示鹼性脂肪酶缺失。
所述的檢測方法，其特徵在於包括以下步驟(1)、粗酶液的製備取稻胚20-40粒放入研缽中，加入150-300 1PH7.0-7.5 Tris-HCl緩衝液，充分研磨後，即粗酶液；玉米胚則取1～4粒，雙子葉作物大豆、花生等取種子子葉10～20mg放入研缽中，加入800-1200 1PH7.0-7.5 Tris-HCl緩衝液，充分研磨後，即粗酶液；(2)、瓊脂平板的製作組方比例瓊脂粉0.3～1.0g，橄欖油或三丁酸甘油脂1～2ml，2～5％聚乙烯醇3～4ml，1～2％維多利亞藍0.5～1.0ml，0.02～0.1mol/l，PH9～11的NaOH-Gly緩衝液40～50ml；(3)、脂肪酶活性的測定在固體瓊脂平板上打孔，將粗酶液加入孔中，置於25-40℃恆溫培養箱中進行酶解反應，定時觀察孔周圍的變色情況，有變色圈則表示鹼性脂肪酶活性高，無變色圈則表示鹼性脂肪酶缺失。
所述的檢測方法，其特徵在於步驟(1)、(2)、(3)為(1)、粗酶液的製備取稻胚30粒放入研缽中，加入200 1PH7.5 Tris-HCl緩衝液，充分研磨後，即粗酶液；玉米胚則取1～2粒，雙子葉作物大豆、花生等取種子子葉10～20mg放入研缽中，加入1000 1PH7.5 Tris-HCl緩衝液，充分研磨後，即粗酶液；(2)、瓊脂平板的製作組方比例瓊脂粉0.5g，三丁酸甘油脂1.25ml，3％聚乙烯醇3.75ml，1％維多利亞藍0.5ml，0.05mol/l、PH10.0的NaOH-Gly緩衝液45ml；(3)、脂肪酶活性的測定在固體瓊脂平板上打孔，後用注射針頭將孔內瓊脂挑出，在酒精燈上烘烤背面，使瓊脂與平皿底部緊貼，將粗酶液約100l加入孔中，置於30℃恆溫培養箱中進行酶解反應。
本發明的脂肪酶的酶活的快速檢測方法優點①、能直接取水稻等作物種子胚、糊粉層、子葉等材料，用量少，無需離心。
②、利用脂肪酶在一定條件下分解三丁酸甘油酯所釋放出利用作物種子鹼性脂肪酶在一定條件下分解三醯甘油酯所釋放出的游離脂肪酸使指示劑(維多利亞藍)變色的原理，根據變色圈直徑的大小對酶活性進行粗略分析，這樣做具有過程簡單、快速、穩定性好、直觀、靈敏等特點。因為提供脂肪酶存在和缺失的陰、陽對照，對結果判別一目了然。用於選育種子鹼性脂肪酶缺失的水稻等作物品種，可從根本上解決稻穀陳化變質的問題。
③、不需複雜的實驗條件和高精密的試驗儀器。易於製成試劑盒，便於攜帶和推廣。對使用者來說，不要求較高的文化，步驟簡單，並可根據對照進行結果判斷，易於操作；④、本快速顯色方法也可用於其它作物如大豆、玉米、花生等種子鹼性脂肪酶活性檢測。
本發明的脂肪酶的酶活的快速檢測方法用途①、可供農作物育種者在選擇鹼性脂肪酶缺失的材料、品系、品種中，根據鹼性脂肪酶酶活性有無判斷鹼性脂肪酶基因的表達情況，決定該材料的利用價值。
②、糧食部門(特別是國家、地方、部隊專用糧貯備庫)中長期種子庫、農民貯糧大戶作為檢測其耐貯藏性，加工品質的依據。
③、該方法可以作為科研單位對脂肪酶酶(含鹼性脂肪酶酶)的研究。
④、食品、醫藥行業作為原料質量標準之一；種子部門作為品種儲藏特性鑑定的指標之一。
具體實施例方式
一、粗酶的提取取稻胚20～30粒(玉米胚則取1～2粒，雙子葉作物大豆、花生等取種子子葉10～20mg)放入研缽中，加入200～1000 1PH7.5 Tris-HCl緩衝液，充分研磨後，即粗酶液。
二、瓊脂平板的製作瓊脂粉0.3～1.0g，橄欖油或三丁酸甘油脂1～2ml，聚乙烯醇(2～5％)3～4ml，維多利亞藍(1～2％)0.5～1.0ml，40～50mlNaOH-Gly(0.02～0.1mol/l，PH9～11)緩衝液，微波加熱溶解後振蕩倒並傾倒到平皿上凝固形成瓊脂平板。
三、脂肪酶活性的測定在固體瓊脂平板上打孔，後用注射針頭將孔內瓊脂挑出，在酒精燈上烘烤背面，使瓊脂與平皿底部緊貼，將粗酶液約100～200l加入孔中，置於30℃～40℃恆溫培養箱中進行酶解反應，定時觀察孔周圍的變色情況。有變色圈則表示鹼性脂肪酶活性高，無變色圈則表示鹼性脂肪酶缺失。
權利要求
1.作物種子鹼性脂肪酶活性快速檢測方法，包括以下步驟(1)、取種子中的鹼性脂肪酶富集部位，用Tris-HCl緩衝液配製粗酶液；(2)、製作固體瓊脂檢測平板；(3)、在固體瓊脂平板上打孔，加粗酶液，定時觀察孔周圍的變色情況，有變色圈則表示鹼性脂肪酶活性高，無變色圈則表示鹼性脂肪酶缺失。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於包括以下步驟(1)、粗酶液的製備取稻胚20-40粒放入研缽中，加入150-300l PH7.0-7.5 Tris-HCl緩衝液，充分研磨後，即粗酶液；玉米胚則取1～4粒，雙子葉作物大豆、花生等取種子子葉10～20mg放入研缽中，加入800-1200l PH7.07.5 Tris-HCl緩衝液，充分研磨後，即粗酶液；(2)、瓊脂平板的製作組方比例瓊脂粉0.3～1.0g，橄欖油或三丁酸甘油脂1～2ml，2～5％聚乙烯醇3～4ml，1～2％維多利亞藍0.5～1.0ml，0.02～0.1mol/l，PH9～11的NaOH-Gly緩衝液40～50ml；(3)、脂肪酶活性的測定在固體瓊脂平板上打孔，將粗酶液加入孔中，置於25-40℃恆溫培養箱中進行酶解反應，定時觀察孔周圍的變色情況，有變色圈則表示鹼性脂肪酶活性高，無變色圈則表示鹼性脂肪酶缺失。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於步驟(1)、(2)、(3)為(1)、粗酶液的製備取稻胚30粒放入研缽中，加入200l PH7.5 Tris-HCl緩衝液，充分研磨後，即粗酶液；玉米胚則取1～2粒，雙子葉作物大豆、花生等取種子子葉10～20mg放入研缽中，加入1000l PH7.5 Tris-HCl緩衝液，充分研磨後，即粗酶液；(2)、瓊脂平板的製作組方比例瓊脂粉0.5g，三丁酸甘油脂1.25ml，3％聚乙烯醇3.75ml，1％維多利亞藍0.5ml，0.05mol/l、PH10.0的NaOH-Gly緩衝液45ml；(3)、脂肪酶活性的測定在固體瓊脂平板上打孔，後用注射針頭將孔內瓊脂挑出，在酒精燈上烘烤背面，使瓊脂與平皿底部緊貼，將粗酶液約1001加入孔中，置於30℃恆溫培養箱中進行酶解反應。
全文摘要
本發明公開了一種作物種子鹼性脂肪酶活性快速檢測方法，其操作步驟是先取種子中的鹼性脂肪酶富集部位，用Tris－HCl緩衝液配製粗酶液；然後加到固體瓊脂平板的孔中，進行酶解反應，定時觀察孔周圍的變色情況，有變色圈則表示鹼性脂肪酶活性高，無變色圈則表示鹼性脂肪酶缺失。可用於其它作物如大豆、玉米、花生等種子鹼性脂肪酶活性檢測。不需複雜的實驗條件和高精密的試驗儀器，易於製成試劑盒，便於攜帶和推廣。
文檔編號G01N1/28GK1773262SQ20051009515
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月27日 優先權日2005年10月27日
發明者張瑛, 吳躍進, 餘增亮, 何成芳, 蔣家月, 劉潔, 吳瑾華, 陳葉萌 申請人:中國科學院等離子體物理研究所