穩定型γ-幹擾素製劑的製備方法

2023-08-08 05:25:26

專利名稱:穩定型γ-幹擾素製劑的製備方法
本發明涉及一種γ幹擾素製品。人體幹擾素有三種，α、β及γ型。α及β型較穩定，臨床主要用於非腸道給藥，目前仍處於深入系統地臨床研究之中。γ幹擾素(此後簡稱IFN-γ)很不穩定，其水溶液在貯存、冷凍或冷凍乾燥過程中活性容易下降，要得到適用於臨床的穩定製品非常困難，有一系列的難題需要解決。γ幹擾素抗腫瘤活性最強，一旦有了穩定的劑型，臨床上將會廣泛應用。
按照本發明，要使用的IFN-γ可以是任何衍生的人體γ幹擾素，天然的或用再組合製得的，例如天然產生人體IFN-γ的濃縮物，亦即天然的IFN-γ(rIFN-γ)和再組合的IFN-γ(rIFN-γ)，即通過人工培養由基因變換得到的能產生人體IFN-γ的微生物而製備出的含人體IFN-γ的物質(參見European Patent Publication NO 0089676;Nucleic Acids Research 10，2487-2501，1982;Nature，295，503-508，1982;Nucleic Acids Research 10，3605～3615，1982〕。具體地說，前述r-IFN-γ包括由146個胺基酸組成的多肽(其胺基酸順序見圖1)以及多肽的各種(碎)片段，如氨基端空位片段和羧基端空位片段，氨基空位指多肽氨基端部缺少不足4個的胺基酸，這些片段也都是在多肽上第131個胺基酸以後的位置上，或者在氨基端空位的位置上分裂的。此外，r-IFN-γ還包括有多肽(和)被絲氨酸或蘇氨酸取代了的屬於多肽的半胱氨酸殘餘部分。
其中最宜使用含146個胺基酸的多肽和缺少C
s-T
r-C
s〔脫(C
s-T
r-C
s)IFN-γ〕的氨基端空位片段。
使用含人體IFN-γ濃度高的水溶液最為有利，高濃度可用基因再組合法做到。
人體IFN-γ的比活性最好要達到1×105至1×107國際單位/毫克(此後簡寫為IU/mg)，水溶液的活性應達到1×102至1×107IU/ml，最宜為1×104至1×107IU/ml。
葡聚糖及羥乙基澱粉，可用市場買得到的產品。但是本發明的製品用於臨床的品級，應當完全與製備非腸道用血漿代用品的品級相同。葡聚糖的平均分子量為10，000～100，000，最好為40，000～70，000;羥乙基澱粉平均分子量為10，000～200，000，最宜為20，000～60，000或200，000。
IFN-γ水溶液中葡聚糖及羥乙基澱粉濃度應在1mg/ml以上，最宜為3～50mg/ml。
除葡聚糖及羥乙基澱粉外，還可把人體血清白旦白(HSA)加到製品中，加入量最宜為2～20mg/ml IFN-γ水溶液。
按照本發明，在人體IFN-γ水溶液中含有半胱氨酸殘物時，此製品還可加入還原形硫化合物，如穀胱甘肽(已還原形)、硫辛酸、半胱氨酸、硫代二甘醇、硫代乙醇胺、單硫代甘油，二硫代蘇糖醇及有1至7個碳原子的硫代鏈烷酸，其中以麩氨基硫(還原形)最宜。若允許共存時，這類還原形硫化合物最宜用量不低於0.1mg/ml，最好為0.5～10mg/ml IFN-γ溶液。
還可添加一種或幾種胺基酸作穩定劑，如甘氨酸、穀氨酸、α氨基丙酸、生理可接受的鹽類及衍生物，單糖類如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖及雙糖類，如蔗糖、麥芽糖及乳糖等，這些都有進一步改善穩定性的作用。當然，這些物質也可有挑選地組合。
上述穩定劑中，蔗糖效果較好，摻入量應為10～50mg/mlIFN-γ水溶液。
此製品還可進一步添加表面活性劑，如Tween-20，緩衝劑，等滲劑(isotonizing agent)等。
按照本發明，人體IFN-γ製品為冷凍型或冷凍乾燥型，可採用下述方法生產，例如，將葡聚糖或/及羥乙基澱粉加到含人體IFN-γ，濃度為1×102至1×107IU/ml的水溶液中，濃度達1mg/ml以上，最好為3～50mg/ml，亦可加入人體血漿白旦白(HSA)、蔗糖及其它劑。IFN-γ水溶液還可含有0.1mg/ml以上的還原硫化合物，最好為0.5～10mg/ml，及/或痕量表面活性劑，或者把還原形硫化合物及/或表面活性劑再加到這種溶液中，如前述穩定劑情況一樣。
按照本發明，可以用冷凍這種水溶液的方法製得冷凍人體IFN-γ製品，通常冷到-80℃至-30℃，冷凍產物最宜貯存於-80℃至-10℃環境之中。減壓乾燥這種冷凍製品又可製得冷凍乾燥IFN-γ製品，乾燥壓力不超過1毫米汞柱，溫度在初期的冷凍溫度到30℃範圍之內。也可解凍冷凍製品，裝入安瓿中，於減壓下進行冷凍和乾燥，製得冷凍乾燥製品。
按照本發明，冷凍乾燥的人體IFN-γ製品作為注射製劑，在生產時還有一系列其它步驟，諸如無菌過濾，消毒灌裝及冷凍乾燥等。
冷凍及冷凍乾燥人體IFN-γ製品是有用的，因為在冷凍乾燥及後來的貯存中其活性降低很小。
冷凍乾燥製品為穩定的含人體IFN-γ固體，特別適宜於非腸道給藥。冷凍乾燥製品作為注射藥劑，臨用之前要先在1～100ml的注射蒸餾水、生理鹽水、或注射葡萄糖溶液安瓿中溶解。採用適當的載體、賦形劑或稀釋劑，這種製品也可用作眼、耳、鼻藥製劑。
本發明的冷凍或冷凍乾燥人體IFN-γ製品穩定、低毒，可以像已有的人體IFN-γ製品那樣，用於各種目的。
IFN-γ的活性指的是抑制病毒生長繁殖的活性，用國際單位(IU)或單位(U)表示，按下述方法測定IU選擇一種已確定了活力單位的IFN-γ國際標準樣品，用標準樣和待測樣分別進行在人體羊膜衍生FL細胞系中對Sindbis病毒誘導細胞病變效應的抑制試驗，然後根據所得數據之比率計算待測樣品的活力。
U選擇一種已確定了活力單位的IFN-γ國際標準樣品和一種白血球衍生粗IFN-γ樣品，進行在人體羊膜衍生FL細胞系中對口腔泡疹病毒(VSV)誘導細胞病變效應的抑制試驗，比較所得數據，即可確定白血球衍生粗IFN-γ的活力;待測樣品的IFN-γ活力，則通過在人體羊膜衍生的WISH細胞系中對VSV誘導細胞病變效應的抑制試驗，測定其抗病毒活性，並以粗IFN-γ為標準，根據所得活力比率計算確定。測定中總是用標準IFN-γ樣品進行平行試驗。
溶液旦白含量根據假設E280nm＝1.0，相當於1mg計算。這樣得到的國際單位(IU)與單位(U)之間的關係為
附圖簡要說明圖1，說明含146個胺基酸的人體IFN-γ中胺基酸的順序。
圖2，說明參考舉例4(ⅰ)中的細胞內容物PLC2的結構。
以下舉例將詳細說明本
發明內容
，但這並非指對本發明的限制。
舉例中所用人體IFN-γ，除特別指明之外均用參考舉例2(Ⅱ)中所介紹的方法製得。舉例6中，人體IFN-γ用由參考舉例3介紹的方法製得，舉例8、9及10中的脫(C
s-T
r-C
s)IFN-γ用參考舉例5介紹的方法製得。
〔舉例1〕將60mg葡聚糖(平均分子量70，000)及0.5ml注射蒸餾水加到1ml含3mg穀胱甘肽的人體IFN-γ(2×105U/ml)水溶液中，再進行無菌過濾，得水溶液1.5ml，放入安瓿中，於-30℃下冷凍或冷凍乾燥;冷凍乾燥產物再用注射蒸餾水恢復原態，分析測定IFN-γ活力。
通常在進行冷凍乾燥時，要另取IFN-γ溶液，加50mg D-甘露醇，而不加葡聚糖，作為對照樣品。這種對照樣溶液也要用相同的方法冷凍乾燥。以冷凍乾燥前人體IFN-γ的活力為基準，對照樣品的剩餘活力為61%，而本發明的冷凍乾燥製品剩餘活力為94%。
〔舉例2〕取1ml人體IFN-γ(7×105U/ml)水溶液，內含3mg穀胱甘肽，加入30mg羥乙基澱粉(平均分子量200，000)和0.5ml注射蒸餾水，進行無菌過濾，得水溶液1.5ml，放入安中，於-30℃下冷凍或冷凍乾燥。冷凍乾燥產物中再加入注射蒸餾水，恢復原態，分別測定其IFN-γ活力。以冷凍或冷凍乾燥之前的活力為基準，-30℃下的冷凍製品剩餘活力為111%，冷凍乾燥製品活力為117%。這表明了製品的穩定性。在-30℃下(冷凍製品)或在40℃下(冷凍乾燥製品)貯存兩周後，按照初期活力計算，二者剩餘活力分別為121%及107%。
〔舉例3〕按舉例2的方法，另加10mg麩氨酸鈉，於-30℃下貯存兩周，冷凍乾燥製品剩餘活力為83%，冷凍製品為105%;在40℃下貯存兩周後，冷凍乾燥製品的剩餘活力與貯存初期的製品的活力相比為105%。由此看來，產品穩定。
〔舉例4〕按舉例1的方法葡聚糖量減至30mg，另加5mg人體血漿白旦白(HSA)，在-30℃下貯存兩周的冷凍乾燥製品剩餘活力為78%，冷凍製品為90%;貯存於40℃下兩周後，冷凍乾燥製品的剩餘活力為貯存初期的112%，這也說明產品穩定。
〔舉例5〕按照舉例2的方法製備的IFN-γ溶液，另加蔗糖51mg，冷凍乾燥，再用注射蒸餾水恢復原態，測定其人體IFN-γ活力，按冷凍乾燥前的人體IFN-γ溶液的活力為準，其剩餘活力為99%。
〔舉例6〕取1ml按參考舉例3的方法製備的人體IFN-γ水溶液(IFN-γ1.6×106IU/ml)，內含穀胱甘肽3mg，加入30mg羥乙基澱粉(平均分子量200，000)和0.5ml注射蒸餾水，進行無菌過濾，濾液1.5ml，裝入安瓿中，進行冷凍乾燥。冷凍乾燥產物用蒸餾水恢復原態，測定人體IFN-γ活力。以冷凍乾燥前水溶液的活力為基準，剩餘活力為88%。
〔舉例7〕取1ml用脫N2注射用蒸餾水配製的人體IFN-γ水溶液，濃度3.0×105IU/ml，與1.5ml的羥乙基澱粉(30mg)水溶液混合一起，在安瓿中冷凍乾燥。冷凍乾燥物再用注射蒸餾水恢復液態，測定其活力，剩餘活力為冷凍乾燥前的74%。
〔舉例8〕取1ml按參考舉例5的方法製得的脫-(C
s-T
r-C
s)的IFN-γ溶液(2.5×106IU/ml)，加入30mg平均分子量為70，000的葡聚糖和0.5ml注射蒸餾水，進行無菌過濾，濾液1.5ml，於安瓿中冷凍乾燥。冷凍乾燥產物用蒸餾水恢復液態，測定剩餘活力，為92%。
〔舉例9〕按照舉例8的方法，另加30mg羥乙基澱粉，代替30mg葡聚糖，得到製品的剩餘活力為95%。
〔舉例10〕按舉例9的方法，追加10mg麩氨酸鈉。得到製品的剩餘百分活力為104%。
〔參考舉例1〕菌株RRI(pRK 248 CIts，pRC 231/IFI-900)，載有人體IFN-γ代表基因，放在M-9葡萄糖介質中於30℃下進行培養，直至細胞濃度達到3～4×108個細胞/ml，再加葡萄糖和酪氨酸至濃度各為1.0%及0.5%;於42℃下誘導1小時後，離心分離培養物，收集的細胞經冷凍後，貯存起來。(參閱例8日本未審查專利公告№189197/1983)
〔參考舉例2〕取1000g按參考舉例1方法得到的冷凍細胞，加100mM的Tris-氯化氫緩衝液(PH7.0)3000ml，Tris-氯化氫緩衝液中含7M鹽酸胍及2mM酚乙基磺醯氟化物。於4℃下攪拌此混合物，離心分離(17000rpm)30分鐘，得清淨透明的上清液，再用簡稱PBS的緩衝液稀釋70倍。PBS緩衝液含137mM氯化鈉，27mM氯化鉀、8mM磷酸氫二鈉及147mM磷酸二氫鉀。再用Sharples分離機(10，000rpm)除去沉澱，用Perico薄膜過濾器(Millipore Corp;截斷分子量10，000)濃縮上清液(220l)到15l，置於40℃過夜;濃縮液又用Sharples離心機再次除去沉澱，得到的上清液以流速1000ml/hr引入裝有抗體的濾柱(Ab(Moγ2-11.1);5×30cm)(參閱Specification Japanese patent application NO 176091/1983 filed on Sept.22，1983);此後將下述溶液依次通過此抗體柱2500ml PBS溶液，5000ml含1M氯化鈉及0.1% Tween 20的磷酸鹽(10mM)緩衝液，2500ml PBS及2500ml含0.5M鹽酸胍(20mM)磷酸鹽緩衝液(PH7.0)。最後，用後一種溶液衝洗抗體柱，得到500ml有抑制病毒活性的洗出餾分。
(Ⅱ)，取420ml上述洗出餾分，加穀胱甘肽(已還原形)，使之濃度達10mM，再引入到Sephacryl S-200(製藥)濾柱(9×100cm)中。此濾柱事先需用25mM醋酸鹽緩衝液進行補償。醋酸鹽緩衝液(PH6.0)含1mM乙二胺四醋酸鹽、150mM氯化鈉，10mM穀胱甘肽(被還原形)及2M鹽酸胍。最後再用同樣的緩衝液衝洗濾柱，收集單體洗出餾分(450ml)。這樣處理得到的IFN-γ(0.410mg/ml)比活性為3.4×106IU/mg。
〔參考舉例3〕取450ml按參考舉例2製備的含單體IFN-γ洗出餾分，加入含10mM穀胱甘肽(已還原形)、150mM氯化鈉、0.5M鹽酸胍及0.01%Tween 20的醋酸鹽(25mM)緩衝液(PH6.0)25ml，攪拌後即得旦白含量0.05mg/ml的低濃度溶液。再將此溶液通過Sephadex G-25濾柱(14×100cm)，用前述的醋酸鹽緩衝液(PH6.0)衝洗濾柱，得無鹽酸胍含IFN-γ的洗出餾分3180ml，旦白含量55.8mg/ml，溶液旦白濃度0.049mg/ml，旦白回收率84.8%，比活性3.5×106IU/mg(旦白)。Sephadex G-25濾柱事先需用前述組成的醋酸鹽緩衝液補償。
由上得到的溶液於4℃下老化48小時後，用Diaflo-PM10，直徑43mm(Amicon超過濾薄膜)的超過濾膜濃縮至159ml，濃縮液清淨透明，旦白濃度0.92mg/ml，旦白回收率93.9%(146.3mg)，IFN-γ比活性6.8×106IU/mg。
〔參考舉例4〕生產脫-(C
s-T
r-C
s)IFN-γ(ⅰ)變換體產生IFN-γ的代表細胞內容物PRC23/IFI-900〔參見例7〕用限制酶NdeⅠ及NcoⅠ消化，分離出一個710bp的NdeⅠ-NcoⅠ DNA片段(A)，此片段(A)含IFN-γ基因域。此外，細胞內容物又分別被限制酶Bgl Ⅱ及Eco RⅠ所消化，又分離出一個265bp DNA片段(B)，此碎片段(B)含λ Pe促進於。片段A、B及用化學法合成的含旦白合成啟動密碼子的寡核苷酸
AATTCATGCAGGATCCAGTACGTCCTAGGTAT用T4-DNA連結酶，以Nde Ⅰ及Eco RⅠ粘性端作為連接點，使彼此又連接起來。這樣得到的DNA片段，經過Nco Ⅰ及Bgl Ⅱ的作用與細胞內容物pRC 23/IFI-900相連結，構成了一個代表細胞內容物pLC2，密碼為C
s-T
r-Cys空位的IFN-γ多肽(見圖2)。這種細胞內容物。按照Cohn等人用的方法，用於傳遞Escherichia Coli RRI(pRK 248 cIts)〔P.N.A.S.(USA)，69，2110，1972〕，得到一種變換體，Escherichia Coli(＝E.Coli)PRI(pLC2，pRK 248 cIts)。
(ⅱ)變換體培養菌株E.Coli RRI(pLC2，pRK 248 cIts)，載有由(ⅰ)構成的細胞內容物，於35℃下，在50ml液體介質中進行震蕩培養，此液體介質中含有1%細菌胰化旦白腖，0.5%酵母萃取物，0.5%氯化鈉及7μg/ml四環素。然後將培養液移入2.5l的M9培養基中，於35℃下成長4小時，於42℃下成長3小時，最後用離心分離法攝取細胞，並將其貯存於-80℃環境中.M-9培養基含0.5%酪氨酸、0.5%葡萄糖及7μg/ml四環素。
(ⅲ)純化過程取7.1g按(ⅱ)節方法製得的冷凍細胞，懸浮於22ml含7M鹽酸胍及2mM酚基甲基磺醯氟的Tris-氯化氫(0.1M)緩衝液中，攪拌1小時(4℃)後，以10，000×g的速率離心分離30分鐘，得24ml上清液，再用300ml PBS稀釋，並引入到抗體柱(Moγ2-11.1，柱容量15ml)，流速ImI/min，然後用60ml含0.5M鹽酸胍的磷酸鈉(20mM)緩衝液洗柱，再用45ml含2M鹽酸胍的磷酸鈉緩衝液衝洗，得到25ml有抑制病活性的餾分，將此餾分通過Sephacryl S-200(製藥)柱(2.6×94cm，柱容量500ml)，再用25mM的醋酸銨緩衝液(PH6.0)衝洗，得40ml有抗病毒活性的餾分。醋酸銨緩衝液含有1mM乙二胺四醋酸，0.15M氯化鈉，10mM半胱氨酸及2M鹽酸胍;Sephacryl S-200(製藥)柱使用前需用此醋酸銨緩衝液補償處理。
最後得到了(C
s-T
r-C
s)空位的IFN-γ多肽脫(C
s-T
r-C
s)IFN-γ，重7.0mg，比活性2.7×106IU/mg。
〔參考舉例5〕取2.2ml由參考舉例4(ⅱ)方法得到的含脫-(C
s-T
r-C
s)IFN-γ洗出餾分，旦白含量為0.331mg/ml，加入8倍體積的含150mM氯化鈉及2M鹽酸胍的醋酸鹽(25mM)緩衝液，進行稀釋(PH6.0)，攪拌，得到的低濃度溶液再通過Sephadex G25柱(2.6×15cm)，用含150mM氯化鈉的醋酸鹽緩衝液衝洗，得到無鹽酸胍的脫(C
s-T
r-Cys)含IFN-γ的洗出餾分30ml。此餾分旦白濃度0.022mg/ml，清淨透明，於4℃下老化24小時後，用Diaflo-PMIO，直徑25mm超濾薄膜(Amicon超濾薄膜)濃縮至0.68ml，然後再用(0.2μm)過濾器過濾，得0.68ml清澈透明上清液，其旦白濃度0.67mg/ml，旦白回收率63%。Sephadex G-25柱事先用含150nM NaCl的醋酸鹽緩衝液進行補償處理。
圖1中各符號意義如下Ala 丙氨酸Asn 天門冬醯胺Asp 天門冬氨酸Cys 半胱氨酸Gln 穀氨醯胺Glu 穀氨酸His 組氨酸Ile 異亮氨酸Leu 亮氨酸Lys 賴氨酸Met 旦氨酸Phe 苯丙氨酸Pro 脯氨酸Ser 絲氨酸Ihr 酪氨酸Val 纈氨酸Arg 精氨酸Gly 甘氨酸
權利要求
1.人體γ-幹擾素製劑的製備方法，其特點是在人體γ-幹擾素溶液中加入葡聚糖和(或)羥乙基澱粉，然後將所得到的溶液冷凍以製取冷凍製劑。如有必要的話，還可在減壓下將冷凍製劑乾燥，以製取冷凍乾燥製劑。
2.按照權利要求
1的方法，其特點是人體γ-幹擾素是再組合人體γ-幹擾素。
3.按照權利要求
2的方法，其特點是再組合人體γ-幹擾素是來源於高濃度的人體再組合γ-幹擾素的水溶液。
4.按照權利要求
2的方法，其特點是再組合的人體γ-幹擾素的比活性為1×105至1×107國際單位/毫克。
5.按照權利要求
1的方法，其特點是人體γ-幹擾素製劑是濃度為1×102至1×107國際單位/毫升的水溶液。
6.按照權利要求
1的方法，其特點是製劑中含有葡聚糖。
7.按照權利要求
6的方法，其特點是葡聚糖的平均分子量為10000至100，000。
8.按照權利要求
1的方法，其特點是製劑中含有羥乙基澱粉。
9.按照權利要求
8的方法，其特點是羥乙基澱粉的平均分子量為10，000至200，000。
10.按照權利要求
1的方法，其特點是葡聚糖和(或)羥乙基澱粉是濃度為3～50毫克/毫升的水溶液。
11.按照權利要求
1的方法，其特點是，製劑中還含有人體血清白蛋白。
12.按照權利要求
1的方法，其特點是製劑中還含有雙糖。
13.按照權利要求
12的方法，其特點是所說的雙糖是蔗糖。
14.按照權利要求
1的方法，其特點是製劑中還含有胺基酸。
15.按照權利要求
1的方法，其特點是製劑中還含有還原硫化合物。
16.按照權利要求
15的方法，其特點是，該特點是該還原硫是穀胱甘肽(還原型)。
17.按照權利要求
15的方法，其特點是還原硫化合物是濃度為0.5～100毫克/毫升的水溶液。
18.按照權利要求
1的方法，其特點是製劑為冷凍形式。
19.按照權利要求
1的方法，其特點是製劑為冷凍乾燥形式。
20.按照權利要求
1的方法，其特點是冷凍過程是在-80℃至-30℃的溫度範圍內進行的。
21.按照權利要求
1的方法，其特點是乾燥過程是在減壓下進行的，其壓力不超過0.1毫米汞柱。
22.一種使人體γ-幹擾素穩定的方法，其特點是將葡聚糖或羥乙基澱粉，或二者的混合物加入到人體γ-幹擾素的水溶液中，然後將所得到的溶液冷凍，而且如有必要的話，還可將所製得的冷凍溶液在減壓下進行乾燥。
專利摘要
將葡聚糖或/及羥乙基澱粉加到人體γ-幹擾素的水溶液中，進行冷凍，如果需要，還可以在減壓下進一步乾燥這種冷凍溶液，即可製備出一種穩定的人體γ-幹擾素製品。
文檔編號C07K14/52GK85101930SQ85101930
公開日1986年7月9日 申請日期1985年4月1日
發明者赤木彌三郎, 三浦泰幹, 星野哲夫 申請人:武田藥品工業株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan