食甲基菌吡咯喹啉醌合成相關基因簇及其編碼蛋白系統的製作方法

2023-08-08 12:45:51 2

專利名稱：食甲基菌吡咯喹啉醌合成相關基因簇及其編碼蛋白系統的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物生物技術領域，具體涉及一種新的食甲基菌吡咯喹啉醌合成基因簇及其編碼蛋白系統。
背景技術：
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)繼吡啶核苷酸和核黃素後，於二十世紀七十年代發現的第三種氧化還原酶的輔酶，被認為是一種新的B族維生素。迄今為止， 已知能夠合成PQQ的生物均為革蘭氏陰性菌，其中以甲基營養菌的產量最高。研究表明， PQQ具有刺激某些微生物和動植物生長、防治肝損傷、促進神經生長因子生成、調節體內自由基水平和調節免疫等多種生理功能，可能用於阿爾茨海默氏症、心血管疾病和糖尿病等疾病的防治。已知能夠合成PQQ的生物包括有乙酸鈣不動桿菌 (Acinetobactercalcoaceticus)、月市炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、焚光假單胞菌(Pseudomonas fluo—rescens)、扭月兌甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)、B譽有機甲基桿菌(Methylobacterium organophilum)、氧化葡||桿菌(Glu-conobacter oxydans)、 中 1、司腸細菌(Enterobacterintermedium)、耐$高身寸球菌(Deinococuus radiodurans)、草生歐文氏菌(Erwinia her-bicola)、鞭毛甲基菌(Methylobacteriu flagellatum)、綠膿假單 1 |if (Pseudomonas aeruginosa)等。PQQ的生物合成涉及4-7個基因(pqqA，B, C，D，Ε, F，G)，這些基因在染色體上一般成簇排列。有的Pqq基因連續排列成1個基因簇，如肺炎克雷伯氏菌為pqqABCDEF ；而有的則分布在2個基因簇中，如在扭脫甲基桿菌中有2個簇，一個為pqqAB⑶E，另一個為pqqFG。 有的Pqq基因與依賴PQQ的脫氫酶基因相鄰。不同細菌的PQQ合成基因序列具有一定的保守性。除了已經確證pqqA編碼多肽為PQQ合成前體以及pqqC是催化PQQ合成反應中最後一步反應的酶以外，其他基因的功能目前還不是很清楚。

發明內容
本發明的目的是提供一種食甲基菌吡咯喹啉醌合成基因簇及其編碼蛋白系統。本發明的菌株MP688通過⑶H酶法從土壤中分離得到，食甲基菌(Methylovorus sp.)新菌株，已於2010年8月20日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為 CGMCC No. 4096。本發明所提供的吡咯喹啉醌合成蛋白系統，來源於食甲基菌MP688 (CGMCC No. 4096)，包括1)由 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11 所
示的胺基酸組成的蛋白質；或2)在 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11所示的胺基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。 本發明還提供編碼上述蛋白系統的基因簇，其為pqqAB⑶E基因簇。pqqAB⑶E基因簇的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，全長3416bp，包括5個PQQ合成基因pqqA、pqqB、 pqqC、pqqD、pqqE。自 SEQ ID No. 15，端第 1 72 位鹼基為 pqqA 基因序列(SEQ ID No. 2)， 編碼蛋白序列為SEQ ID No. 3。自SEQ ID No. 15，端第235-1152位鹼基為pqqB基因序列 (SEQ ID No. 4)，編碼蛋白序列為 SEQ ID No. 5。自 SEQ ID No. 15，端第 1193-1924 位鹼基為pqqC基因序列(SEQ IDNo. 6)，編碼蛋白序列為SEQ ID No. 7。自SEQ ID No. 15，端第 1899-2183位鹼基為pqqD基因序列(SEQ ID No. 8)，編碼蛋白序列為SEQ ID No. 9。自SEQ ID No. 15，端第2232-3416位鹼基為pqqE基因序列(SEQ ID No. 10)，編碼蛋白序列為SEQ ID No. 11。 在pqqAB⑶E基因簇中，pqqA基因由單獨的啟動子控制，pqqB⑶E組成一個操縱子， pqqC和pqqD基因編碼區有沈個鹼基的重疊。MP688的PQQ合成基因與扭脫甲基桿菌AMl 的PQQ合成基因排列方式相同，兩者pqqABCDE基因序列核苷酸相同性為53. 0%。本發明另一個目的在於提供另一個吡咯喹啉醌合成蛋白系統，包括1)由SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 16所示的胺基酸組成的蛋白質；或2)在SEQ ID No. 14和SEQ ID No. 16所示的胺基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。本發明還提供編碼上述蛋白系統的基因簇，其為pqqAB⑶E基因簇和pqqFG基因簇。所述的PqqFG基因簇的核苷酸序列如SEQ IDNo. 12所示，全長2735bp，包括2個PQQ合成基因 pqqF、pqqG。自 SEQ ID No. 12 5，端第 1-1350 位鹼基為 pqqF基因序列(SEQ IDNo. 13)， 編碼蛋白序列為SEQ ID No. 14。自SEQ ID No. 12 5，端第1419_27；35位鹼基為pqqG基因序列(SEQ ID No. 15)，編碼蛋白序列為(SEQ ID No. 16)。食甲基菌MP688與扭脫甲基桿菌 AMl的pqqFG基因序列核苷酸相同性為49. 9%。本領域技術人員可以理解的是，上述的分離的蛋白質也包括那些胺基酸序列與 SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ IDNo. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 14 和 SEQ ID No. 16所示的序列具有較高同源性的蛋白質，例如胺基酸序列同源性大於90%、甚至95 %、甚至98 %的各自蛋白的衍生蛋白。此外，本領域技術人員應當了解，考慮到密碼子的簡併性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。大腸桿菌DH5a自身不能合成PQQ，也沒有PQQ合成基因。通過PCR擴增得到食甲基菌MP688的pqqAB⑶E基因簇，pqqFG基因簇，將上述兩個基因組簇分別連入載體，導入大腸桿菌DH5 α中，表達得到吡咯喹啉醌合成相關蛋白，通過醌酶SDH活性DCIP法檢測，能夠檢測到宿主菌有PQQ的合成。將帶自身調控序列的pqqABCDE基因簇、帶自身調控序列的pqqFG基因簇和 pqqAB⑶E基因簇+pqqFG基因簇連入廣宿主質粒pBBRlMCS2，通過結合轉移導入食甲基菌 MP688，能不同程度提高MP688的PQQ產量，並且兩者有協同效應。含有PQQ合成基因簇的載體、細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。本發明提供的pqqAB⑶E和/或pqqFG基因簇可應用於生產吡咯喹啉醌。
本發明的吡咯喹啉醌合成相關基因簇及其編碼蛋白將在研究PQQ生物合成、改良和構建PQQ生產菌株和生產PQQ中起到重要作用。通過提高吡咯喹啉醌合成相關基因的基因劑量可以有效提高吡咯喹啉醌的產量。


圖1為MP688基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳。其中M λ -Hindi11分子量標準；1 MP688基因組DNA。圖2為食甲基菌MP688的染色體環狀圖譜。其中，從外圈到內圈依次代表1 正鏈上的編碼序列；2 負鏈上的編碼序列；3 :G+C含量，外凸代表大於基因組平均G+C含量，內凹代表小於基因組平均G+C含量；4 =GC skew曲線外凸代表大於0，內凹代表小於0。圖3為MP688基因組中PQQ合成相關基因簇。其中A為pqqAB⑶E基因簇；B為 pqqR；基因簇。圖4為pqqABCDE基因簇PCR擴增。其中M λ -HindIII分子量標準；1 :pqqABCDE
擴增產物。圖5為pqqFG基因簇PCR擴增。M :Trans2K plusll分子量標準；1 :pqqFG擴增產物。圖6 為 p0K12_pqqABCDE 的活性檢測。1 陰性對照 p0K12/DH5 α ；2 :SDH+PQQ ；3 SDH ；4 =PQQ ；5 :SDH+p0K12-pqqABCDE/DH5 α 裂解液；6 :SDH+p0K12_pqqABCDE/DH5 α 上清液；7 :p0K12-pqqABCDE/DH5 α 裂解液；8 :p0K12_pqqABCDE/DH5 α 上清液。圖7為導入PQQ合成基因簇對食甲基菌MP688PQQ產量的影響。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1ΜΡ688菌株基因組DNA的提取挑取食甲基菌ΜΡ688單菌落，接種到MPQ液體培養基(1L MPQ培養基中0.2g MgSO4 · 7H20，3g (NH4)2SO4,1. 4g KH2PO4, 3gNa2HP04,, JKM 12rC，20min。再加入維生素溶液 ImL,金屬離子溶液lmL，甲醇9. 5mL。金屬離子溶液檸檬酸鐵30g、氯化鈣30g、氯化錳5g、 硫酸鋅5g、硫酸銅0. 5g，用H2O定容至1L，待溶液完全溶解後，過濾滅菌。維生素溶液2mg 生物素、400mg泛酸鈣、AOOmgVB1JOOmg VB6、200mg對氨基苯甲酸、2mg葉酸、2g肌醇、400mg 煙酸、200mg核黃素，用H2O定容至1L，過濾滅菌)試管中，200r/min，30°C培養活化48h。1% 的體積比例接種到500mLMPQ培養基中，200r/min, 30°C培養48h。根據文獻進行微生物基因組提取(《精編分子生物學實驗指南》F.奧斯伯、R.布倫特、R.E.金斯頓著，顏子潁、王海林譯。2. 4(39 40))，提取的DNA的效果如圖1所示。實施例2MP688菌株基因組測序MP688經SOLEX測序，總讀長369Mbp，基因組的覆蓋率達到了 1 倍。MP688基因組DNA由一條環形染色體組成，全長2，862，39Ibp，G+C含量為55. 44%。使用Glimmer 3.0 進行細菌基因組的基因預測，預測有2730個編碼框，編碼區百分比為90. 41 %。基因組中發現有46個tRNA和2個rRNA操縱元(圖2)。實施例3MP688菌株基因組注釋中的PQQ合成基因
根據MP688全基因組測定序列，經Glimmer 3. 0軟體基因預測，同COG、KEGG, SWISSPROT、TrEMBL資料庫比對並進行基因注釋，並進行人工校正。發現MP688基因組中PQQ 合成相關基因序列包括1個pqqAB⑶E，1個pqqFG基因簇(圖3)。實施例4pqqAB⑶E基因簇導入大腸桿菌中指導PQQ合成以MP688基因組為模板，以SEQ ID No. 17和18為引物擴增pqqABCDE基因(圖4)。 PCR條件94°C變性lmin，5(TC復性lmin，72°C延伸90s，反應進行30個循環。瓊脂糖凝膠電泳後回收目的片段。將上述經)(ba I/Nde I雙酶切的兩個基因分別插入經)(ba I/Nde I雙酶切的載體p0K12 (GenBank登錄號AF223639)，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，獲得攜帶完整結構基因的重組表達質粒p0K12_pqqABCDE和p0K12-pqqre。挑p0K12_pqqABCDE單菌落於LB液體培養基，37 °C、220r/min培養1 後，轉接於LB液體培養基；37°C、220r/min培養12h,收集ImL菌體，重懸於600L 20mmol/L pH = 8. OTris-HCl緩衝液中，冰浴超聲處理，低溫離心，上清液用於酶活性檢測。利用DCIP法檢測活性，取20L菌體超聲裂解液、IOL SDH(60mg/L)、500L DCIP檢測液、混合後觀察顏色變化。將p0K12-pqqAB⑶E/Dffia菌體裂解後，檢測樣品的PQQ活性，出現了特異性的檢測液褪色。陽性對照及表達樣品加入檢測液後，檢測液立即由綠色變為黃色(圖6)，說明 p0K12-pqqAB⑶E質粒轉入大腸桿菌DH5 α後，能夠指導PQQ的合成。實施例5pqqAB⑶E基因簇、pqqFG基因簇轉入MP688菌株提高PQQ產量以MP688基因組為模板，SEQ ID No. 19和20為引物擴增pqqABCDE基因，以SEQ ID No. 21 和 22 為引物擴增 pqqFG (圖 5)。PCR 條件94°C變性 lmin，50°C 復性 lmin，72°C 延伸90s，反應進行30個循環。瓊脂糖凝膠電泳後回收目的片段。PBBR1MCS2是一種廣宿主質粒，能夠在食甲基菌MP688中自主複製。pqqAB⑶E 的PCR產物回收片度與載體PBBR1MCS2分別經Bio I/HindiII雙酶切，回收酶切片段，通過T4DNA連接酶連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，構建重組質粒 pBBRlMCS2-pqqABCDE。採用三親本雜交方法，分別以含有載體pBBRlMCS2-pqqABCDE的大腸桿菌DH5a為供體菌，MP688為受體菌，含有質粒pRK2013的Ε. coli HBlOl為輔助菌，將對數生長期的供體菌、輔助菌、受體菌按1 1 2體積比混合，塗布於無抗性的MPQ平板， 30°C過夜培養。從MPQ平板上挑取重組菌株及對照菌株，分別接種於5mL相應抗性的液體 MPQ培養基中過夜培養，按1 100體積比分別轉接相同OD值的菌落於IOOmL相應抗性的液體MPQ培養基，300C同步培養，每隔24h取樣測定PQQ含量。按照同樣流程，將pqqFG基因，插入載體PBBR1MCS2的Xhol/Hindlll位點，構建載體pBBRlMCS2-pqqFG。通過三親本結合轉移將構建載體分別導入受體菌MP688，觀察它們對 MP688PQQ合成的影響。以MP688基因組DNA為模板，以SEQ ID似.23和對為引物擴增pqqFG基因。PCR 程序同前。將擴增得到的pqqFG基因經HindIII酶切後，插入載體pBBRl MCS2_pqqAB⑶E 的HindIII位點，構建載體pBBRlMCS2-pqqAB⑶E-pqqR；。通過三親本結合轉移將構建載體分別導入受體菌MP688，觀察其對MP688PQQ合成的影響。結果如圖7所示。結果表明，在食甲基菌MP688中分別導入帶有自身調控序列的 pqqABCDE基因簇、pqqTO基因簇能夠不同程度的提高菌株PQQ產量，兩者共同導入較單獨導入某一個基因簇更能提高菌株PQQ產量，顯示兩個基因簇在提高菌株PQQ產量方面有一定的協同效應。從圖7中可以看出，導入兩個基因簇增加的PQQ產量的增加量，大於單獨導入 pqqABCDE的增加量和pqqFG的增加量之和。 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.食甲基菌吡咯喹啉醌合成的蛋白系統，包括1)由SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11 所示的胺基酸組成的蛋白質；或2)在SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 11 所示的胺基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。
2.食甲基菌吡咯喹啉醌合成的蛋白系統，包括1)由SEQID No. 14和SEQ ID No. 16所示的胺基酸組成的蛋白質；或2)在SEQID No. 14和SEQ ID No. 16所示的胺基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。
3.編碼權利要求1所述蛋白系統的基因簇。
4.根據權利要求3所述的基因簇，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示，共有5個基因， 具體為pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE。
5.編碼權利要求2所述蛋白系統的基因簇。
6.根據權利要求5所述的基因簇，其核苷酸序列如SEQID No. 12所示，共有2個基因， 具體為pqqF、pqqG。
7.含有權利要求3和/或權利要求6所述的基因簇的細胞系。
8.含有權利要求3和/或權利要求6所述的基因簇的表達載體。
9.含有權利要求8所述的表達載體的宿主細胞。
10.權利要求3和/或權利要求6所述的基因簇在生產吡咯喹啉醌中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種食甲基菌吡咯喹啉醌合成基因簇及其編碼蛋白系統，分別為pqqABCDE和pqqFG。本發明還公開了編碼上述吡咯喹啉醌合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.12所示。本發明提供的基因簇均能促進食甲基菌吡咯喹啉醌的合成量，共同導入上述兩個基因簇具有在促進吡咯喹啉醌的合成上具有協同增效的作用。
文檔編號C07K14/195GK102219836SQ20111004971
公開日2011年10月19日 申請日期2011年3月1日 優先權日2011年3月1日
發明者安佳佳, 張惟材, 智靜娟, 李淼鑫, 楊延新, 楊璐, 汪建華, 熊向華, 韋娜 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所