免疫球蛋白2的製作方法

2023-08-08 12:36:31 2

專利名稱：免疫球蛋白2的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於在哺乳動物中生產單鏈免疫球蛋白的方法，具體地講，本發明涉及一種用於在哺乳動物中生產單鏈駱駝VHH抗體的方法。還披露了用本發明方法生產的單鏈抗體及其用途。
本發明背景抗體的抗原結合結構域包括兩個獨立的區域重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL它可能是Vк或Vλ)。抗原結合位點本身是由6個多肽環形成的三個來自VH結構域(H1，H2和H3)，三個來自VL結構域(L1，L2和L3)。編碼VH和VL結構域的V基因的多種主要成分是通過基因片段的組合性重排產生的。VH基因是通過三個基因片段VH，D和JH的重組產生的。在人體內，根據單倍型，存在大約51種功能性VH片段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today，16237)，25種功能性D片段(Corbett等(1997)J.Mol.Biol.，26869)和6種功能性JH片段(Ravetch等(1981)Cell，27583)。VH片段編碼形成VH結構域的第一和第二抗原結合環的多肽鏈的區(H1和H2)，而VH，D和JH片段組合形成VH結構域第三個抗原結合環(H3)。VL基因是通過僅有2個基因片段VL和JL的重組產生的。在人體內，根據單倍型，有大約40種功能性Vк片段(Schable和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler，3741001)，31種功能性Vλ片段(Williams等(1996)JMol.Biol.，264220；Kawasaki等(1997)Genome Res.，7250)，5個功能性Jк片段(Hieter等(1982)J.Biol.Chem.，2571516)和4種功能性Jλ片段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.，172609)。VL片段編碼多肽鏈的形成VL結構域的第一和第二抗原結合環(L1和L2)的區域，而VL和JL片段組合形成VL結構域的第三個抗原結合環(L3)。據信，選自這種主要成分的抗體具有足夠的多樣性，以便至少以中等親和力結合幾乎所有的抗原。高親和力抗體是通過重排基因的「親和力成熟」產生的，其中，由免疫系統根據改善了的結合，產生並且選擇點突變。
重鏈基因座包括大量的可變鏈基因(VH；實際上不是完整基因，但包含第一編碼外顯子加上轉錄起始位點)，這些基因重組到兩個短的編碼區D和J(被稱作VDJ重組)，這兩個編碼區位於編碼重鏈Cμ的恆定區的外顯子前面，得到被稱作IgM的完整抗體重鏈區。隨後發生了類轉換，其中，所述可變區與位於IgM恆定區下遊的另一個恆定區重組，得到IgD，IgG，IgA和IgE(由位於Cμ基因下遊的各種Cδ，Cγ，Cα，Cε的外顯子編碼)。在該過程中缺失了間插的恆定區。在所述輕鏈基因座，к基因座中發生了類似過程，並且，當這一過程不會導致在λ基因座中產生抗體時發生(有關綜述參見Rajewski，K.，Nature 381，p751-758，1996；深入的綜述參見免疫學教科書，Janeway，C.，Travers，P.，Walport，M.，Capra.J.，Current BiologyPublications/Churchill Livingstone/Garland Publishing，fourthedition，1999，ISBN 0-8153-3217-3)。
駱駝類(雙峰駝，單峰駝和無峰駝)除了正常的重鏈和輕鏈抗體(在一個抗體中具有兩條輕鏈和兩條重鏈)之外，還包括單鏈抗體(僅含有重鏈)。這種抗體是由一套被稱為VHH基因的獨特的VH片段編碼的。單鏈抗體的抗原結合與在常規抗體上出現的抗原結合不同，不過，以相同方式獲得了高的親和力，即通過可變區的高變和表達所述高親和力抗體的細胞的選擇(親和力成熟)。VH和VHH分散在基因組內(即它們彼此之間是混合出現的)。在VH和VHH cDNA中的相同D片段的鑑定表明，VH和VHH共同使用了D片段。含有VHH的天然抗體缺少重鏈恆定區的CH1結構域。編碼CH1結構域的外顯子存在於所述基因組中，但是由於缺少位於CH1外顯子5』側的功能性剪接受體序列而被剪接掉。結果，VDJ區被剪接到CH2外顯子上。當VHH重組到所述恆定區(CH2，CH3)上時，就產生了一種起著單鏈抗體作用的抗體(即有兩條重鏈，沒有輕鏈相互作用的抗體)。抗原結合與常規抗體的抗原結合不同，但是以相同的方式獲得了高親和力，即通過可變區的高變和表達所述高親和力抗體的細胞的選擇而獲得。
業已使用NMR和X光晶體學技術測定了分離的VH結構域的結構(Spinell等，(1996)，Nat Structural biol.3，752)。數據表明，在駱駝VHH結構域中很好地保留了免疫球蛋白摺疊。兩個β摺疊(一個具有四個β鏈，而另一個具有五個β鏈)彼此堆積在一起，並且通過C22和C92之間的保守的結構域內二硫鍵穩定化。駱駝VHH結構域的側面相當於Fv中的正常VH上的VL界面，它具有差別很大的結構。與人VH相比，在該區域具有四個胺基酸取代。
通過檢查所有人和小鼠VH抗原結合環結構，發現僅有有限數量的可能的構像。分別披露了第一和第二抗原結合環的三種和四種不同的構像。這種規範結構是通過所述環的長度和特定殘基在關鍵位點上的存在決定的。H3環在長度和序列方面是高度可變的(Wu等(1993)Proteinsstructure，funct and genet.，16，1)。令人驚奇的是，駱駝VH結構域的抗原結合環背離了人和小鼠VHH結構域的規範環定義。這種背離是無法預測的，因為在駱駝VH和人VH之間環的長度和關鍵位點上的殘基是非常類似的。駱駝VH結構域中的所述額外規範環結構使得其抗原互補位的結構成分大於來自常規抗體的Fv片段中的VH結構域的結構成分。另外，與人或小鼠抗體相比，第一抗原結合環周圍的高變區被擴大了。人們認為，與常規抗體上的VH相比第一可變區的延長，和同時出現的抗原結合表面的擴大，部分補償了VL結構域的缺乏(Riechmann，L. Muyldermans，S(1999)，231 25-38)。
單結構域駱駝VHH抗體，以及比更大的重鏈和輕鏈抗體分子更適合於結構分析，還提供了一種小而有效的抗原結合單位。這種抗體具有多種和可變的治療潛力。另外，業已發現，駱駝單鏈抗原能結合同時具有重鏈和輕鏈的抗體無法接觸的抗原。人們認為這種能力是由於存在一個大的具有10個或10個以上胺基酸的突出的第三高變環，該高變環可以插入抗原表面的溝槽內。這一點是特別重要的，因為酶的催化位點通常位於其蛋白表面的最大的溝槽內(Ladowski，R.A(1996).Protein Science 5，2438)。所述位點對於常規抗體來說通常不是免疫原性的(Novotny，J等，(1986)Proc Nat Acad Sci USA，83，226)。在駱駝VHH cAb-Lys3的結構中，24個殘基的H3環深深地穿透進入溶菌酶的活性位點(Transue，T.R等(1998)ProtStfucture，Functand Genet，32，515)，這表明駱駝重鏈抗體具有形成特異性酶抑制劑的潛力。
最近，業已在細菌中製備了分離的駱駝VHH結構域(Riechmann，L等Journal of Immunological Methods 231(1999)，25-38)。不過，細菌表達系統具有不能進行翻譯後修飾的缺陷。所述修飾，特別是糖基化事件對於抗體有效行使功能來說是重要的，特別是在體內環境下更是如此。
在相同的研究中，將編碼駱駝VHH結構域的基因插入了表達載體內，並且在Cos細胞中表達，以便製備多結構域蛋白。在一種例子中，通過將特定的駱駝VHH克隆在人IgG1的鉸鏈和效應功能結構域之前，製備了僅有完整的單重鏈的抗體。在Cos細胞中的表達與細菌表達系統相比所具有的優點是，在這些細胞中發生了翻譯後修飾事件。與之一致的是，發現所述抗體在抗原結合方面具有完整活性。用於製備所述構建體的DNA通常是從用B細胞製備的成熟抗體(即經歷了親和力成熟的抗體)中分離的。儘管在哺乳動物細胞中表達的所述單鏈抗體在體外環境下能夠結合一個或多個抗原，但是它們不能進行類(同種型)轉換和親和力成熟(高變)過程。因此，在Cos細胞中表達的單鏈抗體不能經歷在哺乳動物中產生的天然存在的抗體的抗體進化過程。正是這種抗體進化過程導致了能以高親和力結合的特異性抗體的產生。因此，本領域仍然需要一種可以在哺乳動物中製備單鏈VHH抗體的方法，以便可以進行正常的抗體進化過程。
另外，業已通過噬菌體展示技術，選擇並且表達了駱駝單鏈抗體(Riechmann，L. Davies，S.J.Bio.mol.NMR，6，141)。另外，儘管所述抗體構建體是用從成熟的B細胞或體細胞中分離的核酸製備的，因此，與上述情形相同，所表達的抗體不能經歷類轉換，和體細胞高變(親和力成熟)，這種變化是生產能以選擇性和高親和力結合其抗原的特殊抗體所必須的。
本發明人認為，如果能夠了解在B細胞早期抗體發育階段駱駝單鏈抗體分子進化的機制(類轉換和親和力成熟)，就可以在體內重建該系統。這樣就可以製備大量的進化單鏈抗體，用於結構、治療和診斷應用。
發明概述包括重鏈和輕鏈的抗體分子在B細胞發育期間進行類轉換。骨髓中的發育的B細胞首先表達膜結合IgM。在發育期間，表達了分泌型IgG。對於具有輕鏈和重鏈的抗體來說，將J區重組到Cμ區上，以便產生包括VHH，D和J區的IgM。通過轉變成不同的重鏈恆定區，使IgM生產細胞進一步成熟，以便產生例如IgA。重組機制包括與IgM的VH部分重組的假輕鏈，所述假輕鏈存在於早期B細胞系。
本發明人認為，了解在前B細胞發育期間單鏈抗體類轉換和/或發生親和力成熟(抗體進化)的機制，可以製備本文所定義的VHH基因座，它會導致特異性單鏈VHH抗體的產生，這種抗體經歷了與在其天然環境中產生的駱駝抗體相似或相同的進化過程。
因此，在本發明的第一方面，提供了一種用於在哺乳動物中生產VHH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達異源VHH重鏈基因座的步驟。
VHH重鏈基因座優選包括(a)至少一個各自包括一個VHH外顯子的VHH區，至少一個各自包括一個D外顯子的D區，和至少一個各自包括一個J外顯子的J區，其中，所述VHH區，D區和J區能夠重組形成VDJ編碼序列，(b)包括至少一個Cγ恆定重鏈基因的恆定重鏈區，並且當它表達時，既不表達功能性CH1結構域，也不表達功能性CH4結構域，(c)至少一個能夠將步驟(a)的J區直接與步驟(b)的Cγ恆定重鏈基因重組的重組序列(rss)。
並且，當所述基因座表達時，能夠形成完整的單重鏈IgG分子(scIgG)。
在另一方面，本發明提供了一種在哺乳動物中生產駱駝化VH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達駱駝化VH重鏈基因座的步驟。
所述駱駝化VH重鏈基因座優選包括(a)各自包括一個VH外顯子的VH區，該VH外顯子是突變的，以便其核酸序列與駱駝VHH外顯子(『駱駝化VH外顯子』)相同，包括一個D外顯子的D區，和包括一個J外顯子的J區，其中，所述VH區，D區和J區能夠重組形成VDJ編碼序列，(b)包括至少一個Cγ恆定重鏈基因的恆定重鏈區，並且當它表達時，既不表達功能性CH1結構域，也不表達功能性CH4結構域，(c)至少一個能夠將步驟(a)的J區直接與步驟(b)的Cγ恆定重鏈基因重組的重組序列(rss)。
並且，當所述基因座表達時，能夠形成完整的單重鏈IgG分子(scIgG)。
本發明人業已證實，對於單重鏈抗體來說，發生了形成scAb(完整的單重鏈抗體多肽鏈)的類轉換。該機制包括將步驟(a)的J區與步驟(b)的恆定重鏈區的Cγ重鏈區基因直接重組，優選在骨髓中重組，以便產生scIgG(單鏈IgG分子)。在構建體中存在重組信號序列(rss)，從而允許步驟(a)的J區與步驟(b)的Cγ基因直接連接。
對於本發明來說，所述哺乳動物不是人。所述轉基因哺乳動物優選比駱駝小，並且容易維持並且用需要的抗原進行免疫。理想的是，所述轉基因哺乳動物是嚙齒類動物，如兔、豚鼠、大鼠或小鼠。特別優選的是小鼠。還可以使用其他哺乳動物，包括山羊、綿羊、貓、狗和其他家養和野生哺乳動物。
當根據本發明的方法表達單鏈抗體時，優選使哺乳動物的內源重鏈基因座缺失或沉默。用於實現後一種目的的合適技術披露於以下文獻中WO00/26373或WO96/33266和(Li和Baker(2000)Genetics 156(2)809-821；Kitamura和Rajewsky(1992)；Kitamura和Rajewsky，(1992)Nature 356，154-156)。
本發明所使用的術語『VHH單重鏈抗體』表示僅由重鏈(通常為2個)組成的抗體分子，並且不包括任何輕鏈。每一個重鏈包括一個可變區(由VHH，D和J外顯子編碼)和一個恆定區。恆定區還包括一定數量的CH(恆定重鏈結構域)，它優選包括兩個一個CH2結構域和一個CH3結構域，它們是由一個恆定區基因編碼的。本文所定義的VHH單鏈抗體不具備功能性CH1結構域，並且還缺乏功能性CH4結構域。正是由於功能性CH1結構域的缺乏(在常規抗體中，具有用於錨定輕鏈恆定區的錨定部位)，導致了本發明的重鏈抗體不能與輕鏈結合，以便形成常規抗體。
本發明的術語『駱駝化(camelised)VH單重鏈抗體』表示僅由重鏈(通常為2條)組成的抗體分子，並且不包括任何輕鏈。每一個重鏈包括一個可變區(由『駱駝化VH外顯子』D和J外顯子編碼)和一個恆定區。恆定區包括至少一個恆定區基因。每一個恆定區基因包括多個恆定區外顯子，每一個外顯子編碼一個恆定區CH結構域。一般，恆定區包括兩個CH結構域一個CH2結構域和一個CH3結構域。本文所定義的駱駝化VH單鏈抗體不具有功能性CH1結構域，此外，它還缺乏功能性CH4結構域。正是由於功能性CH1結構域的缺乏(在常規抗體中，具有用於錨定輕鏈恆定區的錨定部位)，導致了本發明的重鏈抗體不能與輕鏈結合，以便形成常規抗體。
在本發明中，術語『異源』表示本文所定義的VHH重鏈基因座不是所述哺乳動物內源的。就是說，當所述哺乳動物是駱駝類，即雙峰駝或無峰駝時，所述表達是正常情況下不存在於雙峰駝或無峰駝體內的VHH基因座的表達。
本發明的『VHH重鏈基因座』由一個『VHH區』，一個『J區』，一個『D區』和一個『恆定重鏈區』組成。每一個VHH區包括一個VHH外顯子，每一個J區包括一個J外顯子，而每一個D區包括一個D外顯子，並且每一個重鏈恆定區包括一個或多個重鏈恆定區基因。另外，每一個VHH區基本上不包括一個或多個功能性VH外顯子。
本發明的『VHH外顯子/區』表示天然存在的VHH編碼序列，如存在於駱駝體內的編碼序列及其任何同源物，衍生物或片段，只要當所述核酸表達時所得到的外顯子/區能與本發明的D外顯子/區，J外顯子/區和恆定重鏈區(包括若干外顯子)重組，以便產生本文所定義的VHH單鏈抗體。
本發明的『駱駝化VH重鏈基因座』由本文所定義的一個『駱駝化VH區』，一個『J區』，一個『D區』和一個『恆定重鏈區』組成。每一個駱駝化VH區包括一個駱駝化VH外顯子，每一個J區包括一個J外顯子，而每一個D區包括一個D外顯子，並且每一個重鏈恆定區包括一個或多個重鏈恆定區外顯子。
本發明的『駱駝化VH外顯子/區』表示源於除了駱駝以外的哺乳動物的天然存在的VH編碼序列，例如，發生了突變的人VH編碼序列，以便所述序列與駱駝外顯子的序列相同。本發明的駱駝化VH外顯子在其範圍內還包括所述外顯子的任何同源物，衍生物或片段，只要外顯子/區能與D區/外顯子，J區/外顯子和包括本發明的一個或多個外顯子的恆定重鏈區重組，以便產生本文所定義的駱駝化VH單鏈抗體。
VHH和VH外顯子可以來自天然存在的來源，或者它們可以是用本領域技術人員所熟悉的並且在本文中所披露的方法合成的。
同樣，在本發明中，術語『D外顯子』和『J外顯子』包括天然存在的D和J外顯子序列，這些序列存在於駱駝或其他哺乳動物物種中。術語D外顯子和J外顯子的範圍內還包括它的衍生物，同源物和片段，因為所得到的外顯子能與本文所披露的重鏈抗體基因座的其餘部分重組(駱駝化VH或VHH)，以便產生本文所披露的單鏈抗體。D和J外顯子/區可源於天然存在的來源或可以用本領域技術人員所熟悉的、並且披露於本文中的方法合成。
另外，本發明的重鏈抗體基因座(VHH或駱駝化VH)包括編碼恆定重鏈多肽的DNA區(恆定重鏈區)的DNA。
每一個恆定重鏈區主要包括至少一個恆定區重鏈基因，該基因是Cγ，以便可以產生單鏈IgG。每一個恆定重鏈基因包括一個或多個恆定重鏈外顯子，它可以是來源於駱駝或非駱駝的，並且是從Cμ、Cδ，Cγ1-4，Cε和Cα1-2中選擇的。在本發明的重鏈抗體基因座中的至少一個重鏈恆定區外顯子優選是源於人、小鼠或兔的。優選至少一個Cγ重鏈外顯子是源於人的。在表達時，所述恆定重鏈區缺少存在於雙鏈抗體中的功能性CH1和CH2結構域。優選在本發明的恆定重鏈區中只存在一個或多個具有修飾過的(無功能的)CH1結構域的Cγ2和/或Cγ3基因。
本文所定義的『恆定重鏈基因座外顯子』(『CH外顯子』)包括天然存在的CH外顯子序列，如存在於駱駝類或人或包括兔和小鼠在內的其他哺乳動物中的CH外顯子。術語『CH外顯子』的範圍還包括它的衍生物、同源物和片段，只要當它是恆定重鏈區的成分時，CH外顯子能夠形成功能性單重鏈抗體(包括由VHH外顯子或駱駝化VH外顯子編碼的區)。
一般，CH基因包括三個或四個外顯子(CH1-CH4)，它能編碼每一個恆定重鏈多肽的不同結構域，通常由兩個多肽構成本文所定義的單重鏈抗體。不過，正如上文所披露的，VHH和駱駝化VH單鏈抗體不具有功能性CH1(含有輕鏈結構域錨定區)或CH4。因此，本發明的單重鏈抗體基因座具有一個或多個不能表達功能性CH1或CH4結構域的基因。這種現象可能通過所述恆定重鏈區基因的CH1和CH4外顯子的突變、缺失、取代或其他處理產生。
在本發明的一種優選實施方案中，單鏈VHH基因座包括至少一個恆定重鏈基因，其中編碼CH1和CH4的結構域的核酸是突變、缺失或取代或以其他方式處理過的，以便所表達的本文所定義的VHH單鏈抗體的恆定重鏈不包括功能性CH1結構域和CH4結構域。
為了消除疑問，上文所提到的術語『來源於兔的』或『來源於人的』，表示包括本發明的重鏈抗體基因座(駱駝化VH或VHH)的一個或多個外顯子的核酸序列與一個或多個天然存在的兔或人抗體基因座外顯子相同。本領域技術人員可以理解的是，所述外顯子可源於天然來源，或者可以用本領域技術人員所熟悉的和本文所披露的方法合成。
每一個VHH或『駱駝化VH區』分別包括一個VHH外顯子或『駱駝化VH外顯子』，每一個J區和D區分別包括一個J和D外顯子。優選的是，每一個重鏈基因座包括一個以上，兩個以上，三個以上，四個以上，五個以上，六個以上J和/或D區外顯子。最優選的是，本發明的VHH基因座或駱駝化VH基因座包括與駱駝相同數量的VHH外顯子/區和/或D外顯子/區和/或J外顯子/區。
優選的是，本發明這一方面的方法是通過表達VHH重鏈基因座或駱駝化VH重鏈基因座生產單鏈抗體，所述基因座包括一個或多個本文所定義的來源於人、兔或小鼠的恆定重鏈外顯子。就是說，本發明的單重鏈抗體優選是通過雜合的駱駝/人基因座或雜合的駱駝/兔基因座或雜合的駱駝/小鼠基因座的表達產生的。在本發明這一方面的特別優選的實施方案中，根據本發明方法表達的單重鏈基因座包括來源於駱駝的所有VHH外顯子和來源於人、兔或小鼠的所有D、J和恆定重鏈區外顯子。在本發明這一方面的另一種優選實施方案中，根據本發明方法表達的單重鏈基因座包括所有駱駝化VH外顯子，和來源於人或兔或小鼠的所有D、J和恆定重鏈區外顯子。
在本發明上述方面的一種優選實施方案中，所述重鏈基因座還包括一個或多個盒位點，所述位點允許基因座從一個載體裝盒(cassetting)到另一個載體中。優選一個或多個盒位點位於所述基因座的5』前導序列中和/或位於所述基因座的3』非翻譯區。優選有一個或多個盒位點同時位於所述基因座的5』前導序列中和所述基因座的3』非翻譯區。例如，所述直接裝盒，允許將核酸轉移到細菌表達載體中，以便添加標記和信號等。
上述所披露的這種用於製備雜合單重鏈抗體的方法可以特別適用於製備用於人治療的抗體，通常將抗體施用於與所述抗體的來源不同的脊椎動物時，導致出現針對所施用抗體的免疫應答。因此，雜合的駱駝/人單鏈抗體在給人施用時很可能比駱駝單鏈抗體具有更低的免疫原性。
在本發明中，所述抗體包括基本上相同的成分。基本上相同表示具有超過80％的同源性，更優選超過85％，90％，95％的同源性。更優選超過96％，97％，98％的同源性。最優選的是，基本上相同表示突變的人VH區與駱駝VHH區的同源性超過99％。
在另一方面，本發明提供了一種可以通過本發明方法獲得的VHH單重鏈抗體，其中，所述抗體的由VHH外顯子編碼的部分是由來源於駱駝的外顯子編碼，而所述抗體分子的其餘部分是由來源於人的外顯子編碼。
在另一方面，本發明提供了一種可以通過本發明方法獲得的VHH單重鏈抗體，其中，所述抗體的由VHH外顯子編碼的部分是由來源於駱駝的外顯子編碼的，而恆定重鏈區是由來源於兔的一個或多個外顯子編碼的。
在另一方面，本發明提供了一種可以通過本發明方法獲得的VHH單重鏈抗體，其中，所述抗體的由VHH外顯子編碼的部分是由來源於駱駝的外顯子編碼的，而恆定重鏈區是由來源於小鼠的一個或多個外顯子編碼的。
在另一方面，本發明提供了一種可以通過本發明方法獲得的駱駝化單重鏈抗體。
優選的是，本發明這一方面的駱駝化VH單重鏈抗體完全是由本文所定義的來源於人的外顯子編碼的。
在本發明這一方面的另一種優選實施方案中，駱駝化VH單重鏈抗體包括由來源於兔的一個或多個外顯子編碼的恆定重鏈區。
在另一種實施方案中，根據本發明這一方面的駱駝化VH單重鏈抗體包括由來源於小鼠的一個或多個外顯子編碼的恆定重鏈區。
與現有技術的抗體相比，通過本發明方法生產的抗體的優點是，它能經歷與在它的正常環境中產生的單鏈駱駝抗體相似或相同的類轉換過程。可以通過本發明方法獲得的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。它們優選是單克隆抗體。抗體可以用本領域技術人員所公知的方法製備。優選將雜交瘤用於製備單克隆抗體。有關技術是本領域技術人員所熟悉的，並且披露於本文中。
在另一方面，本發明提供了一種包括本發明的VHH重鏈基因座的載體。
在另一方面，本發明提供了一種包括本發明的駱駝化VH重鏈基因座的載體。
合適的載體為本領域技術人員所熟知。有利的是，優選適合插入大量核酸，足以編碼完整的免疫球蛋白重鏈基因座的載體。合適載體包括酵母和細菌人工染色體，如YACs和BACs。有利的是，構建載體，以便將編碼本文所定義的單重鏈抗體基因座的核酸直接裝盒到不同的載體中。例如，可以將編碼單重鏈抗體的逆轉錄cDNA『裝盒』到細菌表達載體中，以便添加標記、信號或表位等。
在另一方面，本發明提供了一種用本發明的VHH基因座轉化過的宿主細胞。
在另一方面，本發明提供了一種表達本發明的異源VHH重鏈基因座的轉基因哺乳動物。
在另一方面，本發明提供了一種表達本發明的駱駝化VH重鏈基因座的轉基因哺乳動物。
在本發明中，術語『轉基因哺乳動物』的範圍不包括轉基因人。本發明的轉基因哺乳動物優選是比駱駝類小的哺乳動物。所述哺乳動物優選選自下列一組小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、猴子和兔。優選是小鼠。
在本發明的轉基因哺乳動物中，優選使所述轉基因動物的內源重鏈基因座缺失或沉默。用於後一種目的的合適技術披露於以下文獻中WO00/26373或WO96/33266和(Li和Baker(2000)Genetics 156(2)809-821；Kitamura和Rajewsky(1992)；Kitamura和Rajewsky，(1992)Nature 356，154-156)。
抗體生產細胞可源於本發明的轉基因動物，並且用於，例如，製備用來生產本文所定義的VHH單鏈抗體的雜交瘤。作為補充或替代方案，使用本領域技術人員所熟悉的重組DNA技術可以從本發明的轉基因哺乳動物中分離核酸序列，並且用於生產單鏈抗體。作為替代或補充方案，可以通過對本發明的轉基因動物進行免疫，製備特殊的單鏈抗體。
因此，在另一方面，本發明提供了一種通過用一種抗原免疫本發明的轉基因哺乳動物而生產單鏈抗體的方法。
在本發明這一方面的一種優選實施方案中，所述哺乳動物是小鼠。
在本發明中，術語『免疫』哺乳動物，表示給本發明的轉基因哺乳動物施用一種抗原，以便誘導針對這種抗原的免疫應答。用於免疫所述哺乳動物的合適方法為本領域技術人員所熟知，並且披露於本文中。合適的抗原可以是天然存在的或合成的。天然存在的抗原包括蛋白，例如，它可能是酶或輔因子，肽和核酸分子。本領域技術人員可以理解的是，以上所列舉的例子並非是窮舉性的。
在另一方面，本發明提供了本文所披露的單重鏈抗體用作細胞內結合試劑的用途。
在另一方面，本發明提供了本發明的單鏈抗體作為酶抑制劑的用途。
在另一方面，本發明提供了通過本發明方法可獲得的抗體在製備用於預防和/或治療疾病的藥物中的用途。
在最後一方面，本發明提供了本發明的重鏈抗體基因座在預防和治療疾病中的用途。


圖1表示本發明的優選單鏈抗體基因座。
定義『基因』包括編碼完整mRNA的一個或多個外顯子。『抗體基因』包括V，D，J外顯子，它們能重組形成VDJ編碼區，該編碼區隨後進一步與包括一個或多個恆定重鏈外顯子的恆定重鏈區重組。有許多V，DJ和C外顯子的亞型。一個特定的V區具有一個外顯子，一個D區具有一個外顯子，一個J區具有一個外顯子，以及一個C區具有若干外顯子。當選擇了一個V外顯子，一個D外顯子，一個J外顯子和一個C區時，在重組之後它們共同形成一個完整基因。
『外顯子』和『內含子』。外顯子是脫氧核苷酸的編碼序列或信使序列。就是說，它是真核生物的最終會以成熟的mRNA或rRNA分子形式表達的任何DNA序列。在外顯子之間通常分散有內含子。內含子是非編碼DNA序列。就是說，它們是最終不會以成熟RNA分子形式表達的DNA序列。為了製備成熟mRNA，將內含子從新轉錄的RNA上剪切掉。
本發明的『VHH重鏈基因座』由『VHH區』，『J區/外顯子』，『D區/外顯子』和『恆定重鏈區』組成。每一個VHH區包括一個VHH外顯子，每一個J區包括一個J外顯子，而每一個D區包括一個D外顯子，以及每一個重鏈恆定區包括一個或多個重鏈恆定區外顯子。
本發明的『VHH外顯子』表示天然存在的VHH編碼序列，如存在於駱駝體內的序列，及其任何同源物、衍生物或片段，只要當所述核酸表達時，當本文所定義的VHH區的成分與本發明的至少一個D區，至少一個J區和至少一個恆定重鏈區重組時，所得到的外顯子能夠產生本文所定義的VHH單鏈抗體。
本發明的『駱駝化VH基因座』由一個或多個本文所定義『駱駝化VH區』，一個或多個『J區』，一個或多個『D區』，和『恆定重鏈區』組成。每一個駱駝化VH區包括一個駱駝化VH外顯子，每一個J區包括一個J外顯子，而每一個D區包括一個D外顯子，並且每一個重鏈恆定區包括一個或多個重鏈恆定區基因。
在本文中，『駱駝化VH外顯子』表示源於除了駱駝以外的哺乳動物，例如，業已突變了的人的天然存在的VH編碼區，以便所述序列與駱駝外顯子的序列相同。本發明的駱駝化VH外顯子的範圍，還包括所述外顯子的任何同源物、衍生物或片段，只要當本文所定義的駱駝化VH區的成分與本發明的至少一個D區，一個J區，和一個恆定重鏈區重組時所得到的外顯子能夠產生本文所定義的駱駝化VH單鏈抗體。
本文所定義的『恆定重鏈區外顯子』(『CH外顯子』)包括天然存在的CH外顯子序列，例如存在於駱駝或人或包括兔和小鼠在內的其他哺乳動物中的序列。術語『CH外顯子』的範圍還包括其衍生物，同源物，和片段，只要當所述CH外顯子是恆定重鏈區的一種成分時，它能夠形成本文所定義的功能性單重鏈抗體。一般，CH外顯子具有四種不同類型(CH1-CH4)，它們編碼每一種恆定重鏈多肽的不同部分(結構域)。不過，本發明的VHH和駱駝化VH單鏈抗體不具有功能性CH1結構域(含有輕鏈結構域錨定區)，也不具有功能性CH4結構域。存在大量的恆定重鏈區外顯子的亞型。不同的抗體類型具有不同的CH外顯子，例如，IgM分子具有一個或多個Cμ恆定區外顯子，而IgG分子具有一個或多個Cγ外顯子。
本發明的『VHH單重鏈抗體』表示僅由重鏈(通常為2條)組成的抗體分子，而不包括任何輕鏈。每一個重鏈包括一個可變區(由VHH、D和J外顯子編碼)，和一個恆定區。恆定區還包括多個由恆定重鏈區外顯子編碼的CH結構域，通常它包括兩個結構域一個CH2結構域和一個CH3結構域。本文所披露的VHH單鏈抗體不具有功能性CH1結構域，也不具有功能性CH4結構域。正是由於缺乏功能性CH1結構域(在常規抗體中具有用於錨定輕鏈恆定區的錨定位置)，導致了本發明的重鏈抗體不能與輕鏈締合形成常規抗體。被稱為scIgG2和/或scIgG3的抗體的亞類僅包括Cγ2和/或Cγ3基因。
本發明的術語『駱駝化VH單重鏈抗體』表示僅由重鏈(通常為2條)組成的抗體分子，而不包括任何輕鏈。每一個重鏈包括一個可變區(由『駱駝化VH外顯子』，D和J外顯子編碼)和一個恆定區。由恆定區外顯子編碼的恆定區另外編碼多個CH結構域，通常包括兩個一個CH2結構域和一個CH3結構域。本文所定義的駱駝化VH單鏈抗體不具有功能性CH1結構域或功能性CH4結構域。由於缺乏功能性CH1結構域(在常規抗體中具有用於錨定輕鏈恆定區的錨定位置)本發明的重鏈抗體不能與輕鏈締合形成常規抗體。
本文所使用的『抗體』表示能夠結合選定靶位的抗體或抗體片段，並且包括單克隆抗體和多克隆抗體，工程化抗體，包括嵌合的、CDR-嫁接的和人源化的抗體，以及通過噬菌體展示或其他技術生產的人工選擇的抗體。小的抗體片段具有用於根據其小的大小和同時具有的優良組織分布能力進行用於診斷和治療用途的優良特性。
『抗體進化』表示在抗體發育期間出現的類轉換和親和力成熟(體細胞高變)的過程，它會導致能選擇性地結合，並且具有高親和力的抗體的產生。
發明詳述一般技術除非另有說明，本文所使用的所有技術和科學術語具有本領域普通技術人員所普遍理解的相同含義(例如，細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、雜交技術和生物化學)。將標準技術用於分子、遺傳學和生物化學方法(一般參見，Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocolsin Molecular Biology(1999)4th Ed，John Wiley Sons，Inc.。以上文獻被收作本文參考)和化學方法。另外，有關標準免疫學技術可以參見Harlow Lane.，A Laboratory Manual Cold Spring Harbor，N.Y.。
本發明的VH/h重鏈基因座在第一方面，本發明提供了一種用於在哺乳動物中生產VHH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達異源VHH重鏈基因座的步驟。
在另一方面，本發明提供了一種用於生產在哺乳動物中生產駱駝化VH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達駱駝化VH重鏈基因座的步驟。
本發明的各種VHH重鏈基因座的構建在發明概述部分說明。
優選的是，本發明的基因座包括一個或多個FRT(flp重組靶)位點(http//www.esb.utexus.edu)，和兩個或兩個以上LoxP位點(它由兩個13bp的反向重複序列組成，這兩個序列由8bp的不對稱間隔區隔開)(Brian Sauer，Methods of Enzymology；1993，Vol225，890-900)。
在本發明的基因座中優選具有至少兩個LoxP位點。FRT位點在所述基因座中的存在使得可以生產單拷貝轉基因，而Lox位點的存在使得在必要時可以缺失IgM和IgD重鏈基因。
(A)載體本發明還提供了包括本發明構建體的載體。主要提供了兩種類型的載體，複製載體和轉化載體。
(I)複製載體可以將本發明的構建體摻入到諸如BAC載體的重組可複製載體中。可以將所述載體用於在相容的宿主細胞中複製所述構建體。因此，在另一種實施方案中，本發明提供了一種製備本發明構建體的方法，包括將本發明的構建體導入可複製載體，將所述載體導入相容的宿主細胞，並且在所述構建體能夠複製的條件下生長所述宿主細胞。可以從所述宿主細胞中回收所述構建體。合適的宿主細胞包括諸如大腸桿菌的細菌、酵母、哺乳動物細胞系和其他真核細胞系，如昆蟲Sf9細胞(杆狀病毒)。
(II)轉化載體還可以將本發明的構建體摻入到能夠將所述構建體插入受體基因組、並因此實現轉化的載體中。除了本發明的構建體之外，所述轉化載體可以包括一個或多個以下成分。
啟動子啟動子通常是從能夠在哺乳動物細胞中起作用的啟動子中選擇的，不過，也可以使用原核啟動子和能夠在其他真核細胞中起作用的啟動子。啟動子通常源於病毒或真核基因的啟動子序列。例如，它可以是源於發生表達的細胞的基因組的啟動子。對於真核啟動子來說，它可以是以遍在方式起作用的啟動子(如α-肌動蛋白、β-肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)或以組織特異性方式起作用的啟動子(如免疫球蛋白基因的啟動子)。它們還可以是對特殊刺激有反應的啟動子，例如，能結合甾體激素受體的啟動子。還可以使用病毒啟動子，例如，Moloney鼠白血病病毒長末端重複(MMLV LTR)啟動子，Rous肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子或人巨細胞病毒(CMV)IE啟動子。另外有利的是，所述啟動子是誘導型的，以便異源基因的表達水平，在細胞的生命時間內是可以調節的。誘導型表示用啟動子可以調節獲得的表達水平。
另外，可以通過添加其他調節序列，例如增強子序列，對上述任一種啟動子進行修飾。優選能夠調節在抗體生產細胞中表達的組織特異性增強子。具體地講，可以包括成功地在體內激活抗體基因座所需要的重鏈增強子(Serwe，M.，和Sablitzky，F.，EMBO J.12，p2321-2321，1993)。還可以使用基因座控制區(LCRs)，特別是免疫球蛋白LCR。還可以使用包括來自兩個或兩個以上不同啟動子的序列元件的嵌合啟動子。
其他載體成分除了啟動子和所述構建體之外，本發明的載體優選包括可用於優化所述載體在插入了該載體的哺乳動物中的功能的其他元件。這些元件為本領域技術人員所熟知，並且，舉例來說，披露於以下文獻中Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989。
載體的構建用於轉化哺乳動物胚胎的載體是使用本領域眾所周知的方法構建的，包括，但不限於限制性內切核酸酶消化、連接、質粒和DNA和RNA純化、DNA測序等標準化技術，例如，這些技術披露於以下文獻中Sambrook，Fritsch，和Maniatis，eds.，Molecular CloningALaboratory Manual.，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y. )。一般，載體構建包括以下步驟a)使內源小鼠基因座失活，例如，使用公開的剔除方法之一(例如，Kitamara，D和Rajewski K.，Nature 352，p154-156，1992)。
b)本文所披露的合適重鏈區的DJ和IgM區是作為重組DNA從人PAC，BAC或YAC文庫中定位的，並且是作為限制酶片段，例如Sall片段克隆的。該區還包括用於在體內成功地激活抗體基因座所需要的重鏈增強子(參見Serwe，M.，Sablitzky，F.，EMBO J.12，p2321-2321，1993)。
c)首先，通過用常規技術構建合適的基因組DNA文庫，將大量VHH或『駱駝化VH外顯子』克隆為粘粒。由於VHH外顯子定位在本文所披露的VH外顯子之間，這些外顯子隨後隨同VHH外顯子一起克隆。因此，產生了一系列VH和VHH外顯子。這一系列的基因可以作為MluI(或其他限制酶)片段分離。
d)3′人免疫球蛋白重鏈LCR-所述基因座表達所需要的調節區是作為SceI限制片段克隆的。
e)所述恆定區重鏈外顯子是作為分離的限制片段克隆的。通過在細菌內進行同源重組(Imam等，2000)，通過除去CH1外顯子和/或CH4外顯子的剪接受體序列(Nguyen等，同上)，使得由相應的外顯子編碼的CH1和/或CH4結構域沒有功能。
步驟b-e提供了『VHH重鏈基因座』或『駱駝化VH重鏈基因座』的片段(圖3)，這些片段將接管在步驟a)中披露的失活的小鼠基因座的功能。所述基因座是通過將每一個片段以合適的順序克隆到合適的載體，例如，含有包括上述所有限制位點的接頭區的BAC載體中而構建的(圖1)。按照本發明方法製備的基因座，其大小通常為200-250kb。可以通過本領域技術人員所熟知的標準實驗室技術從所述載體中分離並且純化所述基因座。然後，可以將編碼本發明的『VHH重鏈基因座』或『駱駝化VH重鏈基因座』的純化核酸(圖3)通過標準技術導入源於在步驟a)中所披露的剔除小鼠的小鼠受精卵內，以便獲得能表達一個或多個本發明基因座的轉基因小鼠。
本發明的單鏈抗體應當理解的是，本發明的術語『單重鏈抗體』和『VHH重鏈基因座』還包括從任何來源獲得的同源多肽和核酸序列，例如，相關的細胞同源物，來自其他物種的同源物及其變體或衍生物。
因此，本發明包括本文所披露的單重鏈抗體和VHH重鏈基因座的變體、同源物或衍生物。
在本發明中，同源序列包括在胺基酸水平上，超過至少30，優選50，70，90或100個胺基酸，具有至少80，85，90，95，96，97，98，99，99.5，99.6，99.7，99.8，99.9％的同一性的胺基酸序列。儘管同源性還可以被理解成相似性(即具有相似化學特性/功能的胺基酸殘基)，在本發明中，它優選表示序列同一性方面的同源性。
同源性比較可以通過肉眼進行，或者更常見的是，藉助於可方便獲得的序列比較程序進行。這些市場上出售的電腦程式可以計算兩個或兩個以上序列之間的百分同源性。百分同源性可以在連續序列中計算，即一個序列與另一個序列比對，並且將一個序列中的每一個胺基酸直接與另一個序列中的相應的胺基酸進行比較，每次比較一個殘基。這種比較被稱為「無空位」比對。通常，這種無空位比對僅在相對較少數量的殘基上進行(例如少於50個連續胺基酸)。
儘管這是一種非常簡單和一致的方法，但是它無法考慮，例如，本來應該相同的序列對，由於一個插入或缺失，將會導致隨後的胺基酸殘基不能恰當比對，因此，在進行總體比對時，很有可能導致百分同源性的顯著降低。因此，大多數序列比較方法被設計用於產生考慮到了可能的插入和缺失的最佳比對，而不會過度對總體同源性罰分。這一目的是通過在序列比對中插入「空位」以便使局部同源性最大化而實現的。
不過，這種更複雜的方法為存在於比對中的每一個空位規定了「空位罰分」，以便對於相同數量的相同胺基酸來說，具有儘可能少的空位的序列比對——體現了兩個比較序列之間的更的相關性——將獲得比具有很多空位的序列更高的得分。通常使用「親族空位成本(affinegap costs)」，它通常用於對空位的存在罰相對高的分，並且對所述空位中每一個後續的殘基罰相對少的分。這是最常用的空位評分系統。高的空位罰分，理所當然地會產生具有較少空位的最優比隊。大多數比對程序允許對空位罰分進行修改。不過，在將所述軟體用於序列比較時，優選使用預設值。當使用GCG Wisconsin Bestfit軟體包(參見下文)時，對於空位的胺基酸序列的預設空位罰分為-12，而對於每一個延伸來說為-4。
因此，最大百分同源性的計算，首先需要產生最優比對，這種比對考慮到了空位罰分。用於進行這種比對的一種合適的電腦程式是GCG Wisconsin Bestfit軟體包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)。可以進行序列比較的其他軟體的例子包括，但不局限於BLAST軟體包(參見Ausubel等，1999，同上，第18章)，FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS成組比較工具。BLAST和FASTA都可用於脫機和聯機檢索(參見Ausubel等，1999，同上，第7-58到7-60頁)。不過，優選使用GCG Bestfit程序。
儘管能夠以同一性形式測量最終百分同源性，所述比對過程本身通常不基於全或無的成對比較。相反，通常使用一種成比例的相似性評分矩陣，它能根據化學相似性或進化距離為每一種成對的比較確定得分。通常使用的這種矩陣的例子是BLOSUM62矩陣-用於BLAST程序組的預設矩陣。如果已經提供，GCG Wisconsin程序通常使用公共預設值或客戶符號比較表(更多的細節參見用戶手冊)。對於GCG軟體包來說，優選使用公共預設值。或對於其他軟體來說，使用諸如BLOSUM62的預設矩陣。
一旦所述軟體產生了最優比對，就可以計算百分同源性，優選百分序列同一性。所述軟體通常是將其作為序列比較的一部分而進行的，並且產生了數字結果。
用於生產本發明單鏈抗體的方法(A)轉基因動物可以將本發明的基因座和載體導入一種動物，以便產生轉基因動物。因此，本發明還提供了包括本文所披露的構建體的轉基因動物。
可以通過本領域技術人員所了解的任何技術將所述基因座插入受體動物的基因組中，例如，通過顯微注射。在將核酸導入受精卵之後，用本領域技術人員所熟知的標準方法進行重新植入。通常，對替代宿主進行麻醉，並且將所述卵插入輸卵管。植入特定宿主體內的卵的數量有所不同，但是通常與該物種天然產生的後代的數量相當。
另外，可以將所述DNA導入胚胎幹細胞(ES)，可以將這種細胞插入宿主胚胎，以便通過標準技術產生轉基因小鼠。
在另一種實施方案中，可以將所述DNA導入任何細胞。用所述細胞的細胞核取代來自任何物種的受精卵的細胞核，以便產生轉基因動物。這種核轉移技術為本領域技術人員所熟知。
可以通過任何合適的方法篩選替代宿主的轉基因後代中轉基因的存在。篩選通常是通過Southern或Northern分析進行的，使用至少與所述轉基因的一部分互補的探針。可以使用對由所述轉基因編碼的抗體特異的配體進行的Western印跡分析作為篩選的替代或補充方案。通常，檢測被認為以最高水平表達轉基因的組織或細胞，不過，任何組織或細胞類型都可用於這種分析。
所述轉基因哺乳動物的後代可以通過讓所述轉基因哺乳動物與合適的配偶體交配，或通過從所述轉基因哺乳動物獲得的卵和/或精子的體外受精而獲得。在採用體外受精時，可以將受精的胚胎植入替代宿主，或在體外溫育，或進行這兩種操作。在通過交配產生轉基因後代時，可以讓所述轉基因哺乳動物與親代系回交。無論採用哪一種方法，都可以用上述方法或其他合適的方法評估所述後代中轉基因的存在。
所述動物可以改變，只要是哺乳動物就行。所述動物優選是非人哺乳動物，如嚙齒類，更優選是大鼠或小鼠。就此而言，所述受體動物還優選不能產生包括輕鏈的抗體，或者最起碼產生這種抗體的能力降低。為此，所述受體動物可以是「剔除」動物，它可能具有產生輕鏈被關閉或阻遏的抗體所需要的一個或多個基因。
通過使用不能產生包括輕鏈的抗體或起碼具有降低的產生這種抗體的能力的宿主動物，本發明的方法在用特定抗原刺激時，能夠有效生產大量的單鏈抗體和來自本發明轉基因動物的抗體生產細胞。
(B)噬菌體展示技術用於噬菌體展示的載體將所編碼的多肽融合於，例如，基因III蛋白(pIII)或基因VIII蛋白(pVIII)，以便展示在絲狀噬菌體，如M13的表面。參見Barbas等，Phage DisplayA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press(2001)(ISBN 0-87969-546-3)；Kay等(eds.)，Phase Display of Peptides and ProteinsA LaboratoryManual，San DiegoAcademic Press，Inc.，1996；Abelson等(eds.)，Combinatorial Chemistry，Methods in Enzymology vol.267，Academic Press(May 1996)。
原核宿主特別適用於生產本發明的噬菌體展示抗體。現在業已完善了噬菌體展示抗體的技術，其中，將抗體可變區片段融合於，例如，基因III蛋白(pIII)或基因VIII蛋白(pVIII)上，以便展示在如M13的絲狀噬菌體表面上，Sidhu，Curr.Opin.Biotechnol.11(6)610-6(2000)；Griffiths等，Curr.Opin.Biotechnol.9(1)102-8(1998)；Hoogenboom等，Immunotechnology，4(1)1-20(1998)；Rader等，Current Opinionin Biotechnology 8503-508(1997)；Aujame等，Human Antibodies 8155-168(1997)；Hoogenboom，Trendsin Biotechnol.1562-70(1997)；de Kruif等，17453-455(1996)；Ba rbas等，Trends in Biotechnol.14230-234(1996)；Winter等，Ann.Rev.Immunol.433-455(1994)，最近業已彙編了製備、繁殖、篩選(淘選)和使用所述文庫的抗體片段所需要的技術和方法，Barbas等，Phage DisplayA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)(ISBN 0-87969-546-3)；Kay等(eds.)，Phage Display of Peptides and ProteinsA Laboratory Manual，Academic Press，Inc.(1996)；Abelson等(eds.)，CombinatorialChemistry，Methods in Enzymology vol.267，Academic Press(May1996)，以上文獻被以其全文形式收作本文參考。
對於本文所述的包括其片段的抗體的噬菌體展示來說，它們優選與噬菌體g3p蛋白融合。
(C)雜交瘤可以用業已建立的方法，利用重組DNA技術在細菌，優選在哺乳動物細胞培養物中生產本發明的單鏈抗體。所選擇的細胞培養系統優選能分泌單鏈抗體產物。
雜交瘤細胞或哺乳動物宿主細胞的體外繁殖是在合適的培養基中進行的，這些培養基是常見的標準培養基，例如，Dulbecco′s改進的Eagle培養基(DMEM)或RPMI 1640培養基，任選補充了哺乳動物血清，例如，胎牛血清或微量元素和生長維持添加劑，例如，飼養細胞，如正常小鼠腹膜溢泌細胞，體細胞，骨髓巨噬細胞，2-氨基乙醇，胰島素，運鐵蛋白，低密度脂蛋白，或油酸等。諸如細菌細胞或酵母細胞的宿主細胞的擴增，同樣是在本領域所公知的合適培養基中進行，例如，對於細菌來說，使用LB，NZCYM，NZYM，NZM，Terrific培養液，SOB，SOC，2×YT，或M9基本培養基，而對於酵母來說，使用YPD，YEPD，基本培養基，或完全基本Dropout培養基。
在體外生產中，提供了相對純的免疫球蛋白製劑，並且可以放大以提供大量的需要的免疫球蛋白。用於細菌細胞、酵母或哺乳動物細胞培養的技術為本領域技術人員所公知，並且包括均勻懸浮培養，例如，在氣升式反應器或在連續攪拌反應器，或固定化或限制細胞培養物中培養，例如在空心纖維，微膠囊中，在瓊脂糖微珠或陶瓷柱上培養。
還可以通過在體內擴增哺乳動物細胞獲得大量需要的免疫球蛋白。為此，將產生需要的免疫球蛋白的雜交瘤細胞注射到組織相容性哺乳動物中，導致抗體生產腫瘤的生長。在注射之前，任選用烴激發所述動物，特別是使用諸如降植烷(四甲基-十五烷)的礦物油。在1-3周之後，從所述哺乳動物的體液中分離免疫球蛋白。例如，雜交瘤細胞是通過以下方法獲得的通過將合適的骨髓瘤細胞與來自Balb/c小鼠的抗體生產脾細胞融合，或將源於能產生需要的抗體的雜交瘤細胞系Sp2/0的轉染過的細胞經腹膜內途徑注射到任選用降植烷處理過的Balb/c小鼠體內，並且在1-2周之後，從所述動物中採集腹水。
例如，上述及其他技術披露於以下文獻中Kohler和Milstein，(1975)Nature 256495-497；US 4,376,110；Harlow和Lane，Antibodiesa Laboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor，這些文獻被收作本文參考。用於製備重組抗體分子的技術披露於上述文獻中，並且還披露於諸如EP 0623679；EP 0368684和EP 0436597的文獻中，這些文獻被收作本文參考。
在所述細胞培養上清液中篩選需要的抗體，優選通過免疫印跡，通過酶免疫測定，例如，夾心測定或斑點測定，或放射免疫測定對表達需要的靶的細胞進行免疫螢光染色而篩選。
為了分離所述抗體，可以濃縮存在於所述培養上清液或腹水中的抗體，例如，通過用硫酸銨沉澱，用諸如聚乙二醇的吸溼材料透析，或通過選擇性膜過濾等。如果必要和/或需要的話，通過常用的層析方法純化，例如凝膠過濾、離子交換層析，用DEAE-纖維素層析和/或(免疫)親和層析，例如，用靶分子或用蛋白-A進行的親和層析。
(3)轉基因動物的免疫在另一方面，本發明提供了一種用於生產本發明單鏈抗體的方法，包括給本發明的轉基因動物施用一種抗原。
由本發明的轉基因動物生產的單鏈抗體包括多克隆和單克隆單鏈抗體及其片段。如果需要多克隆抗體，可以用來自收集的，並且按本發明方法處理過的免疫動物的抗原和血清免疫所述轉基因動物(例如，小鼠、兔、山羊、馬等)。如果含有多克隆抗體的血清含有針對其他抗原的抗體的話，可以通過免疫親和層析和本領域技術人員所熟知的類似技術，純化感興趣的多克隆抗體。用於純化和加工多克隆抗血清的技術同樣為本領域所公知。
本發明單鏈抗體的用途本發明的單鏈抗體，包括其片段可用於體內治療和預防用途，用於體外和體內診斷用途，用於體外測定和試劑用途等。
本發明單鏈抗體的治療和預防用途包括給諸如人的受體哺乳動物施用上述抗體。
與駱駝VHH單鏈抗體分子相比，在人治療方面『駱駝化VH單鏈重鏈抗體』具有若干優點。例如，駱駝化VH單鏈抗體在基於VH3基因家族的抗體的情況下具有蛋白A結合位點。另外，在給人施用時，駱駝化VH單鏈抗體預期具有比駱駝VH單鏈抗體低的免疫原性。
還應當理解的是，與常規雙鏈抗體相比，『駱駝化VH單重鏈抗體』和『駱駝VHH單重鏈抗體』具有某些不同的物理特徵。例如，由於缺少功能性CH1重鏈結構域，本發明的抗體不能結合與補體的典型途徑的激活相關的補體分子C1q。
基本上純的單鏈抗體，包括其至少為90-95％均質的片段優選用於給哺乳動物施用，98-99％或更高的均質性最優選用於藥物學用途，特別是當所述哺乳動物是人時。一旦根據需要進行了部分或純化至均質，即可將本文所披露的單鏈抗體用於診斷或治療(包括身體外的治療)，或用於開發和實施採用本領域技術人員所公知的程序的測定方法。
本發明的選定的單鏈抗體通常可用於預防、抑制或治療炎症狀態，變應性過敏，癌症，細菌或病毒感染，以及自身免疫疾病(包括，但不局限於I型糖尿病，多發性硬化，類風溼關節炎，系統性紅斑狼瘡，克隆氏病和重症肌無力)，以及用於預防移植排斥。例如，消除調節性T細胞或幹擾募集可導致增強了的免疫應答，這可能特別適用於治療可能逃脫正常免疫應答的感染。
另外，選定的單鏈抗體，包括其片段可用於在它們在脊椎動物中正常不定位的區域調節免疫應答。例如，可以使用本領域技術人員所公知的技術將本文所披露的一種或多種抗體用於輸注、注射到脊椎動物組織中。本文所披露的抗體在所述異位環境中的存在可被用於例如，在移植排斥期間調節免疫應答等。
在本申請中，術語「預防」包括在誘導疾病之前施用所述預防性組合物。「阻遏」表示在誘導事件之後，但是在所述疾病的臨床出現之前施用所述組合物。「治療」包括在疾病症狀開始表現之後施用所述預防性組合物。
可以獲得動物模型系統，該系統可用於篩選本發明的選定抗體在預防或治療疾病方面的效果。用於檢測易感的小鼠系統性紅斑狼瘡(SLE)的方法為本領域所公知(Knight等(1978)J.Exp.Med.，1471653；Reinersten等(1978)New Eng.J.Med.，299515)。通過用來自另一種物種的可溶性AchR蛋白誘導所述疾病，在SJL/J雌性小鼠中檢測重症肌無力(MG)(Lindstrom等(1988)Adv.Immunol.，42233)。關節炎是通過注射II型膠原在小鼠的易感株中誘導的(Stuart等(1984)Ann.Rev.Immunol.，42233)。業已披露了通過注射分支桿菌熱激蛋白在易感大鼠體內誘導佐劑關節炎的模型(VanEden等(1988)Nature，331171)。通過按公開方法施用甲狀腺球蛋白，在小鼠體內誘導甲狀腺炎(Maron等(1980)J.Exp.Med.，1521115)。胰島素依賴型糖尿病(IDDM)在某些小鼠株中可以天然存在或可以誘導，如通過Kanasawa等(1984)Diabetologia，27113所披露的方法誘導。小鼠和大鼠體內的EAE被用作人MS的模型。在該模型中，通過施用髓鞘鹼性蛋白誘導了脫髓鞘疾病(參見Paterson(1986)Textbook of Immunopathology，Mischer等，eds.，Grune和Stratton，New York，pp.179-213；McFarlin等(1973)Science，179478和Satoh等(1987)J.Immunol.，138179)。
一般，本發明的選定的單鏈抗體是以純化形式與藥理學合適的載體一起使用的。通常，所述載體包括水溶液或醇/水溶液，乳液或懸浮液，包括鹽水和/或緩衝培養基的任何溶液。腸胃外載體包括氯化鈉溶液，Ringer′s右旋糖，右旋糖和氯化鈉以及乳酸化Ringer′s。如果必須在懸浮液中保持多肽複合物，合適的、生理學上可以接受的佐劑可以從增稠劑中選擇，如羧甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，凝膠和藻酸鹽。
靜脈內載體包括液體和營養添加劑和電解質添加劑，如基於Ringer′s右旋糖的添加劑。還可以存在防腐劑和其他添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack(1982)Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版)。
本發明的選定的單鏈抗體，包括其片段可以被用作單獨施用的組合物使用或與其他製劑組合使用。其中可以包括各種免疫治療藥物，如環孢菌素、氨甲蝶呤、阿黴素或順鉑和免疫毒素。藥物組合物可以包括各種細胞毒性或其他試劑與選定抗體，或本發明的T細胞或甚至是本發明選定抗體的組合的「雞尾酒」。
本發明藥物組合物的施用途徑可以是本領域普通技術人員所公知的任何途徑。對於治療來說，包括，但不局限於免疫治療，可以按照標準技術給任何患者施用本發明的選定抗體、受體或其結合蛋白。所述施用可以是任何合適的方式，包括腸胃外、靜脈內、肌內、腹膜內、經皮、經肺途徑，或者還可以通過用導管直接輸注。施用的劑量和頻率取決於患者的年齡、性別和狀況，同時施用的其他藥物，禁忌症和醫生考慮的其他參數。
本發明的選定的抗體可以冷凍乾燥以便保存，並且，在使用之前在合適的載體中重配。可以採用已知的冷凍乾燥和重配技術。本領域技術人員可以理解的是，冷凍乾燥和重配可以導致不同程度的功能活性喪失，並且，必須將用量上調以便進行補償。
另外，本發明的抗體可用於診斷目的。例如，本文所披露的抗體可以用在疾病狀態下特異性表達的抗原製備或產生，或者在特定疾病狀態期間其水平發生改變。
對於諸如診斷或示蹤目的的某些用途來說，可以添加標記物。合適的標記物包括，但不局限於下列任意一种放射性標記，NMR自己旋標記和螢光標記。用於檢測標記的方法為本領域技術人員所熟知。
合適的放射性標記的例子包括鎝99m(99mTc)或碘-123(123I)。諸如碘-123，碘-313，銦-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，鎵，錳或鐵的標記物，使得這些標記物可以通過NMR進行檢測。諸如11C甲硫氨酸和FDG的標記物適用於正電子發射體層攝影術的技術。使用PET的方法和方案的說明為本領域技術人員所熟知。
合適的螢光團是GFP或其突變體。GFP及其突變體可以按照本領域眾所周知的方法通過作為融合多肽表達與本發明的抗體或靶分子一起合成。例如，轉錄單位可以作為所需要的GFP或免疫球蛋白或靶分子的框內融合體形式構建，並且通過常規PCR克隆和連接技術插入上述載體。
本發明的抗體可以用能夠產生信號的任何試劑標記。所述信號可以是任何可檢測的信號，如誘導可檢測基因產物的表達。可檢測基因產物的例子包括生物發光多肽，如螢光素酶和GFP，可以通過特殊測定檢測的多肽，如β-半乳糖苷酶和CAT，以及調節宿主細胞生長特徵的多肽，如代謝所需要的酶，如HIS3，或抗生素抗性基因，如G418。
為了進行預防和/或治療性治療，可以施用含有本發明的選定抗體的組合物或它的混合物。在某些治療用途中，可以在選定細胞群中獲得至少部分抑制、阻遏、調節、殺滅、或某些其他可測定參數的合適用量，被定義為「治療有效劑量」。為了達到上述劑量所需要的量取決於疾病的嚴重程度和患者自身免疫系統的一般狀態，不過一般為0.00005-5.0mg選定的單鏈抗體/kg體重，更常用的劑量為0.0005-2.0mg/kg/劑。對於預防性用途來說，還可以以類似的或略低一些的劑量施用含有本發明的選定多肽的組合物或其混合物。
含有一種或多種本發明的選定抗體的組合物可用於預防性和治療性設置，以便有助於改變、滅活、殺滅或除去哺乳動物中的選定靶細胞群。另外，還可將本文所披露的多肽的選定組成成分用於在體外選擇性地殺滅、消除或有效除去異質細胞收集物中的靶細胞群。可以在體外將來自哺乳動物的血液與選定的抗體、細胞表面受體或其結合蛋白混合，以便殺滅或除去所述血液中的不需要的細胞，以便按照標準技術送回到所述哺乳動物中。
在另一方面，本發明提供了將本文所披露的單重鏈抗體用作細胞內結合試劑的用途。
本發明的抗體可以在任何細胞類型中表達，並且可以結合併且影響任何細胞內成分的功能。例如，細胞內成分可以是細胞骨骼成分，參與基因表達和/或表達調節的分子，參與細胞成分功能調節的酶或分子。本領域技術人員可以理解的是，以上所列舉的並非是窮舉性的。例如，當所述成分是酶抑制劑時，本發明的抗體可以增強或減弱所述酶的活性。酶的活性位點通常位於蛋白表面上最大的溝槽中。所述位點對於常規抗體來說，通常是沒有免疫原性的(Novotny等，(1986)Proc.Nat.Acad USA，83，226)。本發明單鏈抗體的長的H3環深深地穿透至酶的活性位點，使得它們起著有效酶抑制劑的作用。
具體地講，本發明的單鏈抗體和/或其片段和/或組合物特別適合用作抗病毒和/或抗細菌藥物外部使用，例如，以霜劑形式用於皮膚，用於陰道等。另外，本發明的抗體片段和組合物還可用於治療設備，如用於經常會出現偶然機會性感染的場所。例如，抗體、其片段和組合物特別適用於醫院環境，特別是密集的護理單位。另外，本發明的抗體、其片段和組合物可用於治療人工或天然組織的移植物質。例如，支架或受CMV或其他病毒感染的骨髓。
另外，可以給本發明的抗體附加其他功能，如轉運肽和/或提供一種酶活性的功能性成分，例如激酶，蛋白酶，磷酸酶，脫乙醯酶，乙醯酶，遍在化酶，sumolation酶，甲基化酶等。另外，可以將其他抗體連接在本發明的單鏈抗體或其片段上。本領域技術人員可以理解的是，以上所列舉的並非是窮舉性的。
在上面的說明書中所提到的所有文獻都被收作本文參考。在不超出本發明範圍和構思的前提下，本發明所披露的各種方法和系統的各種改進，對本領域技術人員來說是顯而易見的。儘管業已結合具體優選實施方案對本發明進行了說明，應當理解的是，要求保護的發明不應當被過度局限於所述具體實施方案。實際上，對所披露的用於實施本發明的方案的各種改進對於生物化學、分子生物學和生物技術或相關領域的技術人員來說是顯而易見的，這些改進被認為屬於以下權利要求書的範圍。
權利要求
1.一種用於在哺乳動物中生產VHH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達異源VHH重鏈基因座的步驟。
2.如權利要求1的方法，其中，所述VHH重鏈基因座包括(a)至少一個各自包括一個VHH外顯子的VHH區，至少一個各自包括一個D外顯子的D區，和至少一個各自包括一個J外顯子的J區，其中，所述VHH區，D區和J區能夠重組形成VDJ編碼序列，(b)包括至少一個Cγ恆定區重鏈基因的恆定重鏈區，並且當它表達時，既不表達功能性CH1結構域，也不表達功能性CH4結構域，(c)一個能夠將步驟(a)的J區直接與步驟(b)的Cγ恆定重鏈基因重組的重組序列(rss)，並且，當所述基因座表達時，能夠形成完整的單重鏈IgG分子(scIgG)。
3.一種在哺乳動物中生產駱駝化VH單重鏈抗體的方法，包括在所述哺乳動物中表達駱駝化VH重鏈基因座的步驟。
4.如權利要求3的方法，其中，所述駱駝化VH重鏈基因座包括(a)至少一個各自包括一個VH外顯子的VH區，該VH外顯子是突變的，以便其核酸序列與駱駝VHH外顯子(『駱駝化VH外顯子』)相同，至少一個各自包括一個D外顯子的D區，和至少一個包括一個J外顯子的J區，其中，所述VH區，D區和J區能夠重組形成VDJ編碼序列，和(b)包括至少一個Cγ恆定重鏈基因的恆定區重鏈區，並且當它表達時，既不表達功能性CH1結構域，也不表達功能性CH4結構域，(c)一個能夠將步驟(a)的J區直接與步驟(b)的Cγ恆定重鏈基因重組的重組序列(rss)，並且，當所述基因座表達時，能夠形成完整的單重鏈IgG分子(scIgG)。
5.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，所述基因座包括一個或多個FRT位點。
6.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，所述基因座包括兩個或兩個以上LoxP位點。
7.如權利要求1或2的方法，其中，所述VHH重鏈基因座包括至少一個來源於人的D區和至少一個來源於人的J區。
8.如權利要求3或4的方法，其中，所述駱駝化VH重鏈基因座包括至少一個來源於人的D區和至少一個來源於人的J區。
9.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，所述恆定重鏈區包括至少一個來源於駱駝的恆定重鏈基因。
10.如權利要求1-8中任意一項的方法，其中，所述恆定重鏈區包括至少一個非駱駝來源的恆定區重鏈基因。
11.如權利要求10的方法，其中，至少一個恆定區重鏈基因來源於人。
12.如權利要求11的方法，其中，至少一個恆定區重鏈基因來源於兔。
13.如權利要求11的方法，其中，至少一個恆定區重鏈基因來源於小鼠。
14.如上述權利要求中任意一項的方法，其中，所述重鏈基因座還包括使所述基因座能夠裝盒的一個或多個盒位點。
15.如權利要求14的方法，其中，所述一個或多個盒位點位於所述重鏈基因座中，位於該基因座的5』前導序列中。
16.如權利要求15的方法，其中，所述一個或多個盒位點位於所述重鏈基因座中，位於該基因座的3』非翻譯區中。
17.通過權利要求1、2和5-16中任意一項的方法可獲得的VHH單重鏈抗體，其中，由VHH外顯子編碼的抗體部分是由來源於駱駝的外顯子編碼的，而所述抗體分子的其餘部分是由一個或多個來源於人的區域編碼的。
18.通過權利要求1、2和5-16中任意一項的方法可獲得的VHH單重鏈抗體，其中，由VHH外顯子編碼的抗體部分是由來源於駱駝的外顯子編碼的，而恆定重鏈區是由一個或多個來源於兔的區域編碼的。
19.通過權利要求1、2和5-16中任意一項的方法可獲得的VHH單重鏈抗體，其中，由VHH外顯子編碼的抗體部分是由來源於駱駝的外顯子編碼的，而恆定重鏈區是由一個或多個來源於小鼠的區域編碼的。
20.一種用權利要求3，4和5-16中任意一項的方法可獲得的駱駝化VH單重鏈抗體。
21.如權利要求20的駱駝化VH單重鏈抗體，其中，整個抗體是由一個或多個來源於人的區域編碼的。
22.如權利要求20的駱駝化VH單重鏈抗體，其中，編碼恆定重鏈區的所述抗體部分是由一個或多個來源於兔的區域編碼的。
23.如權利要求20的駱駝化VH單重鏈抗體，其中，編碼恆定重鏈區的所述抗體部分是由一個或多個來源於小鼠的區域編碼的。
24.如權利要求20-23中任意一項的駱駝化VH單重鏈抗體，它是單克隆抗體。
25.一種載體，包括權利要求1，2和5-16中任意一項所述的VHH重鏈基因座。
26.一種載體，包括權利要求3，4和5-16中任意一項所述的駱駝化VH重鏈基因座。
27.一種用權利要求25和26中任意一項的載體轉化過的宿主細胞。
28.一種表達如權利要求2和5-16中任意一項所述的異源VHH重鏈基因座的轉基因哺乳動物。
29.一種表達如權利要求4和5-16中任意一項所述的駱駝化VH重鏈基因座的轉基因哺乳動物。
30.如權利要求28或29的轉基因哺乳動物，它是小鼠。
31.一種通過用一種抗原免疫權利要求28-30中任意一項的轉基因哺乳動物而生產單鏈抗體的方法。
32.權利要求17-24中任意一項的單重鏈抗體在製備用於預防和/或治療疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發明涉及一種在哺乳動物中生產單鏈免疫球蛋白的方法。具體地講，本發明涉及一種用於在哺乳動物中生產單鏈駱駝VHH抗體的方法，它會經歷出現在抗體生產B細胞內的類轉換和親和力成熟的過程。還披露了用本發明方法製備的單鏈抗體及其用途。
文檔編號A61P29/00GK1520424SQ02812658
公開日2004年8月11日 申請日期2002年4月24日 優先權日2001年4月24日
發明者F·格羅斯維爾德, F 格羅斯維爾德 申請人:鹿特丹伊拉茲馬斯大學