降解氯苯類化合物的細菌和方法

2023-07-18 01:43:56

專利名稱：降解氯苯類化合物的細菌和方法
技術領域：
本發明涉及廢水生物處理，具體屬於可降解氯苯類化合物的細菌以及利用該細菌降解水中氯苯類化合物的方法。
背景技術：
隨著工農業的發展，進入環境中的人工合成化合物越來越多，其中滷代芳香族化合物所佔的比例也日趨增大。滷代芳香族化合物是芳香族化合物分子或其衍生物分子中一個或幾個氫原子被滷素原子取代之後的產物。由於化學結構的改變使原化合物的性質發生了很大的變化，特別是生物降解性明顯地降低。環境中最常見的為氯代芳香化合物，如氯苯、氯酚、氯代苯氧酸、氯代聯苯等幾類。這些化合物廣泛用於工農業生產中，是一類汙染面廣、毒性較大、難生物降解、大多是具有「三致」作用的化合物。美國環保局(EPA)公布的129種優先控制汙染物中有25種是氯苯類化合物。如何有效地消除氯苯類化合物對環境的影響，是目前眾多研究者關注的問題，在利用微生物對其進行生物降解的研究方面，到目前為止，已經國外已有研究者從土壤、水體和底泥中分離獲得了能夠降解氯代芳香化合物的微生物，但這些微生物對氯苯類化合物的耐受濃度較低，只能處理水中較低濃度的氯苯類化合物，如Jechorek，M等用Methylocystis sp.GB 14 DSM 12955菌，在T＝20-30℃、pH＝6.8條件下厭氧降解氯苯的適宜濃度範圍為20-40mg/L(文獻參見Jechorek，M，Wendlandt K.-D，Beck M.Cometaabolicdegradation of chlorinated aromatic compounds.Journal of Biotechnology，2003，102(1)，93-98)。

發明內容
本發明的目的是提供一種能夠承受並能有效降解水中高濃度氯苯類化合物的微生物以及用這種微生物降解氯苯類化合物的方法。
本發明提供一種可降解氯苯類化合物的細菌，其特徵在於，它是光合細菌。所述的光合細菌是紅螺菌屬(Rhodospirillium)，如深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)；紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)，如沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、綠色紅假單胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、綠硫紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、海洋紅假單胞菌(Rhodopseudomonas marina)；紅細菌屬(Rhodobacter)，如球形紅細菌(Rhodobactersphaeroides)中的任意一株菌或它門的任意組合。
上述光合細菌由山西大學生命科學與技術學院光合細菌研究室分離、鑑定並保存。地址山西省太原市塢城路92號山西大學生命科學與技術學院。
這些光合細菌菌種的文獻出處張肇銘，鄧松錄，趙良啟等.紫色非硫光合細菌的研究A.球形紅假單胞菌的分離、鑑定和生理特性的研究.山西大學學報(自然科學版)，1984，(4)54-59；姚竹雲，張肇銘.幾株光合細菌的表型特徵及其DNA-DNA同源性分析.應用與環境生物學報，1996，2(1)84-89；張肇銘，楊素萍，趙春貴.沼澤紅假單胞菌的分離鑑定研究.山西大學學報(自然科學版)，1992，(4)379-385；楊素萍，張肇銘，趙春貴.綠色紅假單胞菌和綠硫紅假單胞菌的分離與鑑定.微生物學報，1995，35(2)91-96。
關於球形紅細菌的說明根據Bergey細菌鑑定手冊第八版(1975)，球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)名稱為球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)，但是1989年出版的Bergey系統細菌學手冊以及1992年出版的Bergey細菌鑑定手冊第九版將該光合細菌命名為球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)。
本發明提供一種降解氯苯類化合物的方法，包括如下步驟(1)在無菌條件下，將光合細菌培養基中加入氯苯類化合物，配成含有20-100mg/L氯苯類化合物的培養液；(2)在上述培養液中按體積比5％-50％接入光合細菌，在20-45℃、光照1000-3000Lx、厭氧條件下，馴化培養3-30天，作為馴化菌種；(3)在無菌條件下，將馴化菌種按體積比5％-30％接入含20-200mg/L氯苯類化合物的培養液中，在20-45℃、光照1000-3000Lx厭氧或微好氧條件下培養48-136h；或在20-45℃、自然光或黑暗、好氧條件下，培養4-120h；水中氯苯類化合物降解率可達96-100％。
所述的馴化菌種也可進行固定化。所述固定方法可採用包埋法。
所述的氯苯類化合物可以是氯苯、二氯苯、三氯苯、四氯苯、五氯苯、六氯苯。
所述的光合細菌培養基的主要成分及配比範圍為MgSO40.2-0.5g，CaSO40.05-0.1g，NH4SO40.1-1.0g，蘋果酸0.5-2.0g，KH2PO40.5-1.0g，K2HPO40.5-1.5g，酵母膏0.5-1.5g，蒸餾水1000mL，pH6.5-7.5。優選配比為MgSO40.2g，CaSO40.076g，NH4SO40.1g，蘋果酸1.0g， KH2PO40.6g，K2HPO40.9g，酵母膏1g，蒸餾水1000mL，pH7.0。該培養基適合光合細菌生長並能有效降解氯苯類化合物。所述的培養基也可以採用普通的其它光合細菌培養基。
本發明所述的細菌可用於含有氯苯類化合物廢水的處理。
本發明降解完氯苯後的菌體，經收集可用作有機肥料或飼料添加劑。
本發明具有以下優點和效果1.本發明採用光合細菌對氯苯類化合物進行降解，它不僅能在厭氧、微好氧光照的條件下以低級脂肪酸、多種二羧酸、醇類、糖類、芳香族化合物等低分子有機物作為光合作用的電子供體，氯苯類化合物作為電子受體以共代謝方式進行降解，而且能在好氧黑暗及自然光的條件下，利用二加氧酶的作用，對氯苯類化合物進行好氧降解。因此，利用光合細菌能在多種環境條件下降解氯苯類化合物，利於實際應用。
2.利用光合細菌降解氯苯類化合物，處理效率高，處理效率可達90％以上，成本低，操作簡便，易於工業化實施。
3.光合細菌對氯苯類化合物耐受濃度高，可承受並處理氯苯類化合物濃度為200mg/L的廢水。
4.光合細菌降解完氯苯類化合物後的菌體，可直接用作有機肥料和飼料添加劑，沒有二次汙染產生。


圖1光合細菌球形紅細菌厭氧降解氯苯0h的GC-MS分析2光合細菌球形紅細菌厭氧降解氯苯64h的GC-MS分析3光合細菌球形紅細菌厭氧降解氯苯136h的GC-MS分析4固定化深紅紅螺菌降解氯苯動態實驗裝置5不同好氧條件下固定化深紅紅螺菌降解氯苯曲線圖
具體實施例方式實施例1培養基MgSO40.2g，CaSO40.076g，NH4SO40.1g，蘋果酸1.0g，KH2PO40.6g，K2HPO40.9g，酵母膏1g，蒸餾水1000mL，pH7.0。
降解步驟培養基經高壓滅菌，將光合細菌培養基中加入氯苯類化合物，製備成含有40mg/L氯苯類化合物的培養液；在上述培養液中按體積比10％接入球形紅細菌，在30℃、2000Lx光照培養箱中厭氧馴化培養3天，作為馴化菌種；在無菌條件下，將25mL馴化菌種的懸液以10000r/min離心10min，棄上清液，菌體用磷酸緩衝液洗滌2次後加入250mL含100mg/L氯苯的培養液中，在30℃、2000Lx光照培養箱中厭氧培養，每隔一定時間取樣，樣品經10000r/min離心10min後，取上清液測氯苯濃度和降解產物。
氯苯濃度採用高效液相色譜法(SHIMADZU LC-10ATVP)測定.分離柱為Nova2Pak C18，4Lm，3.9mm×150mm；紫外檢測器，檢測波長254nm；流動相為甲醇/水(體積比為75∶25)；流速1.0mL/min，進樣量10μL。
降解產物用美國Agilent公司HP 6890 GC-5973 N MSDGC-MS聯用儀分析.氣相條件，以高純氦氣(99.999％)為載氣，恆流10mL/min；分流進樣，分流比1∶20；進樣口溫度230℃；柱溫起始為60℃，以5℃/min至160℃，色譜質譜傳輸溫度250℃.質譜條件，離子源溫度230℃；倍增電壓1200V；發射電子能70eV；全掃描範圍為50-350amu。吹掃捕集條件，高純氦氣，吹掃流速40mL/min，吹掃時間10min，解吸溫度225℃，解吸時間8min，烘烤時間10min，烘烤溫度225℃。
實驗結果表明球形紅細菌在厭氧條件下處理136h，氯苯去除率可達96.4％；GC-MS分析球形紅細菌降解氯苯在處理時間0h、64h、和136h時的產物(圖1、圖2、圖3)可知，降解產物主要為CHCl3、CHCl2和CH2ClCH2Cl。
實施例2無菌條件下，將沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)馴化菌種接種量10％、含氯苯濃度為100mg/L的培養液在30℃、140r/m的恆溫振蕩培養箱中好氧培養，其它實驗條件和步驟同實施例1。結果表明沼澤紅假單胞菌在好氧條件下當培養時間僅2h時，氯苯去除率就達77％，6h氯苯完全被降解，去除率為100％；GC-MS分析沼澤紅假單胞菌好氧降解氯苯在處理時間0h、6h、和108h時的產物可知，降解中間產物主要為CHCl3。
實施例3無菌條件下，在含100mg/L的鄰二氯苯培養液中加入接種量10％的球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)馴化菌種，進行厭氧降解鄰二氯苯的實驗，其它實驗條件和步驟同實施例1。實驗結果表明球形紅細菌在厭氧條件下104h內能完全降解鄰二氯苯，GC-MS分析球形紅細菌降解鄰二氯苯在處理時間0h、54h、和104h時的產物可知，主要降解過程為二氯苯首先脫氯生成氯苯，然後進一步被降解成CHCl3。
實施例4菌種的馴化將10％深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)原始菌液接入氯苯含量為40mg/L的馴化培養基，在30℃、2000Lx光照培養箱中厭氧馴化培養3天，作為馴化菌種。
將經離心脫水後的深紅紅螺菌菌體30g加入到1000mL40℃已完全溶解的10％聚乙烯醇溶液中均勻混合，通過注射器針頭將上述混合液滴入10％過飽和硼酸溶液中，形成3mm左右的小球，18h後取出固定化微生物小球，用生理鹽水衝洗乾淨，在無菌條件下放入培養基中活化24h備用。
固定化深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)降解氯苯實驗在反應器中加入含200mg/L氯苯的模擬廢水(氯苯模擬廢水成分為實施例1所述培養基按200mg/L加入氯苯)1500mL、固定化深紅紅螺菌小球14g/L、水力停留時間24h、pH＝7.0、T＝30℃、自然光在廢水的DO分別為7.3、5.49、4.87、1.26mg/L條件下，進行固定化深紅紅螺菌降解氯苯的動態實驗，實驗裝置見圖4。每隔一定時間取上清液測氯苯濃度。
實驗結果如圖5所示。圖5表明，氯苯的去除率不僅隨廢水的DO增加而增加，而且隨著廢水的DO的增加，達到氯苯的最高去除率的時間逐漸縮短。當廢水的DO為7.3、5.49、4.87、1.26mg/L時，達到氯苯最高去除率的時間依次為48h、96h、96h、120h。當DO為7.3mg/L時，氯苯去除率最高為90.0％。
實施例5首先將海洋紅假單胞菌(Rhodopseudomonas marina)和球形紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)1∶1(體積比)混合併按實施例1步驟進行馴化培養；然後將馴化培養好的混合菌種以12％接種量接入含1，2，4，5-四氯苯80mg/L的培養基中，在30℃、2000Lx光照培養箱中進行厭氧降解四氯苯的實驗，反應時間72h，去除率達88％。
權利要求
1.種可降解氯苯類化合物的細菌，其特徵在於，它是光合細菌。
2.按照權利要求1所述的可降解氯苯類化合物的細菌，其特徵在於，所述的光合細菌是紅螺菌屬(Rhodospirillium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、紅細菌(Rhodobacter)屬中的任意一株菌或它門的任意組合。
3.一種用權利要求1所述的細菌降解氯苯類化合物的方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)在無菌條件下，將光合細菌培養基中加入氯苯類化合物，配成含有20-100mg/L氯苯類化合物的培養液；(2)在上述培養液中按體積比5％-50％接入光合細菌，在20-45℃、光照1000-3000Lx、厭氧條件下，馴化培養3-30天，作為馴化菌種；(3)在無菌條件下，將馴化菌種按體積比5％-30％接入含20-200mg/L氯苯類化合物的培養液中，在20-45℃、光照1000-3000Lx厭氧或微好氧條件下培養48-136h；或在20-45℃、自然光或黑暗、好氧條件下，培養4-120h。
4.按照權利要求3所述的降解氯苯類化合物的方法，其特徵在於，所述的馴化菌種也可進行固定化。
5.按照權利要求3所述的降解氯苯類化合物的方法，其特徵在於，所述的氯苯類化合物是氯苯、二氯苯、三氯苯、四氯苯、五氯苯或六氯苯。
6.按照權利要求3所述的降解氯苯類化合物的方法，其特徵在於，所述的光合細菌培養基的主要成分及配比為MgSO40.2-0.5g，CaSO40.05-0.1g，NH4SO40.1-1g，蘋果酸0.5-2g，KH2PO40.5-1g，K2HPO40.5-1.5g，酵母膏0.5-1.5g，蒸餾水1000mL，pH6.5-7.5。
7.按照權利要求1所述細菌的用途，用於含有氯苯類化合物廢水的處理。
全文摘要
一種可降解氯苯類化合物的細菌，它是光合細菌。利用該細菌在水中降解氯苯類化合物的方法，步驟包括在含氯苯類化合物的光合細菌培養液中馴化菌種；將馴化菌種接入含20－200mg/L氯苯類化合物的光合細菌培養液中，在20－45℃、光照1000－3000Lx厭氧或微好氧條件下培養48－136h；或在20－45℃、自然光或黑暗、好氧條件下，培養4－120h，均可有效降解氯苯類化合物。該細菌可用於含有氯苯類化合物廢水的處理。
文檔編號A62D3/00GK1970739SQ20061010211
公開日2007年5月30日 申請日期2006年10月31日 優先權日2006年10月31日
發明者王玉芬, 張肇銘, 貢俊, 楊官娥 申請人:山西大學