一種293細胞的大規模懸浮培養方法
2023-07-18 02:03:26 2
一種293細胞的大規模懸浮培養方法
【專利摘要】本發明提供一種293細胞的大規模懸浮培養方法，該方法先在T形組織培養瓶中對293細胞種子進行傳代擴增，再轉移到攪拌式細胞培養瓶中進一步傳代擴增，而後轉移到5L容積生物反應器中進行培養，而後將培養得到的細胞轉移接種至250L容積生物反應器中進行培養，過程中定期補加新鮮培養基用於維持培養環境適宜細胞生長。本發明提供的技術方案填補了293細胞懸浮培養技術的技術空白，所選培養條件適於293細胞生長，實現了細胞培養密度的最大化，減少了細胞培養的體積，減少了後續的勞動強度，質量均一穩定，生產過程銜接緊密，易操控。本發明在細胞培養和病毒增殖過程中進行補液，保證了細胞增殖所需的營養物質，又提高了營養液的利用率，節約成本。
【專利說明】一種293細胞的大規模懸浮培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及細胞培養【技術領域】，具體涉及一種293細胞的大規模懸浮培養方法。【背景技術】
[0002]293細胞是用5型腺病毒75株系轉化，含有Ad5El區的人胚腎亞三倍體細胞系，是一種El區缺陷互補細胞系。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley於1976年用DNA轉染技術構建而成。293細胞是貼壁依賴型呈上皮樣細胞，表現出典型的腺病毒轉化細胞的表型，細胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293細胞屬於貼壁細胞系，在無Ca2+或含Ca2+培養基中可同樣生長，也可生長在血清濃度降低的培養基中，
[0003]現有技術中，實驗證實細胞傳代次數過多對293細胞單層培養方式下細胞的生長以及腺病毒載體的表達量產生了明顯的影響，但是對於懸浮培養方式下293細胞的生長以及腺病毒載體的表達量確沒有影響，但是現有技術針對293細胞懸浮培養工藝鮮有報導。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是克服現有技術缺陷，提供一種利用生物反應器大規模懸浮培養293細胞的方法。
[0005]為實現以上技術目的，本發明採用以下技術方案:
[0006]一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於包括以下步驟:
[0007]I)取出293細胞，先在T形組織培養瓶中傳代擴增，再轉移到攪拌式細胞培養瓶中進一步傳代擴增，而後轉移到小規模反應器中進行培養，而後將培養得到的細胞用於下級培養的種子細胞；
[0008]2)將步驟I)得到的用於下級培養的種子細胞的用胰蛋白酶消化液消化，用無血清293SFM II培養基懸浮培養製成細胞懸液，按一定的細胞密度接種到生物反應器調整培養條件為:培養溫度在36-38°C ；pH維持在7.0-7.4之間；溶氧濃度在40%_50%之間；攪拌速度在100-135rpm之間，在培養的第1_3天攪拌速度設置為100_120rpm，自培養第4天開始在110-135rpm的範圍內逐步提高攪拌速度持續培養；
[0009]3)培養過程中每24小時補充步驟2)中無血清293SFM II培養基總量20% (v/v)的新鮮無血清293SFM II培養基。
[0010]上述技術方案中，步驟I)所述293細胞種子在接種到T形組織培養瓶中之前先進行馴化培養；所述生物反應器為自動控溫攪拌罐式反應器；步驟2)所述的細胞接種密度分別優選為0.5X IO6-L 5X IO6個/ml和0.6X IO6個/ml ;步驟2)所述的培養溫度優選為370C ;步驟2)所述的pH值優選為7.2 ;步驟2)所述的溶氧濃度優選為45% ;步驟2)所述的第1-3天攪拌速度設置為llOrpm。
[0011]本發明提供的技術方案填補了 293細胞懸浮培養技術的技術空白，所選培養條件適於293細胞生長，實現了細胞培養密度的最大化，減少了細胞培養的體積，減少了後續的勞動強度，質量均一穩定，生產過程銜接緊密，易操控。本發明在細胞培養和病毒增殖過程中進行補液，保證了細胞增殖所需的營養物質，又提高了營養液的利用率，節約成本。
【具體實施方式】
[0012]實施例1
[0013]5L生物反應器:Biostat公司生產,低剪切槳式攪拌器,旋轉濾器(Spinfilter)和無氣泡通氣系統，以及中空纖維培養系統(強化元件);溫度、PH、攪拌、溶氧PID全自動控制，四氣混合控制供氣系統，融氧雙參數關聯、回收液流速。
[0014]250L生物反應器:Biostat公司生產，低剪切槳式攪拌器，旋轉濾器(Spinfilter)和無氣泡通氣系統，以及中空纖維培養系統(強化元件);溫度、PH、攪拌、溶氧PID全自動控制，四氣混合控制供氣系統，融氧雙參數關聯、回收液流速。
[0015]細胞系:HEK-293sus細胞，購自中科院上海細胞所；293SFM II培養基自市面購得。
[0016]1.1 HEK-293細胞的馴化培養
[0017]1.1.1 HEK-293細胞的全懸浮馴化培養
[0018]I)接種HEK-293細胞於含IOml DMEM完全培養基的IOcm培養皿中，放於37°C，5%C02的培養箱中培養2天達到100%匯合狀態；
[0019]2)棄除培養基並加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293細胞消化脫離培養皿表面，然後加入3ml DMEM完全培養基終止胰酶消化；
[0020]3)將上述消化後的 細胞用移液管吸取，並轉移到15ml的尖底離心管中，IOOOrpm離心lmin，沉降收集HEK-293細胞，並用IOml DMEM完全培養基重懸收集的細胞，再將全部細胞接種於培養皿中，放於37°C，5%C02的培養箱中；
[0021]4)步驟3)中放入培養箱中的細胞每培養2天重複步驟2)和3)，重複7_11次，直至培養皿中同時出現貼壁細胞和懸浮生長的細胞團；吸取及轉移過程中注意勿打散細胞團；
[0022]5)將最後一次培養的全部細胞消化後轉移至搖瓶中培養，每兩天按照0.5X IO6/ml傳代一次，每次傳代均用0.25%胰酶EDTA消化細胞團至分散狀態，直至培養兩天後能達到1.2X 107ml細胞，活力95%以上，即得可連續傳代95-105代，並可達到最高密度
1.3 X 107/ml的，適應10%FBS DMEM培養基懸浮培養的HEK-293細胞，命名該懸浮培養細胞為HEK-293sus細胞，以4X 106/ml密度凍存即可。
[0023]1.1.2對上述馴化後的HEK-293sus懸浮細胞的無血清馴化
[0024]I)用含10%FBS的DMEM培養基於培養皿中培養細胞至密度為L 2X106/ml，活力95%以上，收集細胞於離心管中，於IOOOrpm離心2min沉降，留沉澱；
[0025]2)用0.25%胰酶EDTA消化沉澱的細胞團，並在此過程中震蕩離心管，使細胞均勻分布；
[0026]3)加入5ml含10%FBS的DMEM培養基終止胰酶消化作用，並重懸步驟2)得到的HEK-293s 細胞，按照 0.5 XlOVml 傳代；
[0027]4)每兩天重複步驟I)至步驟3)—次，直至培養兩天後能達到1.2XlOVml細胞，活力95%以上；
[0028]5)分步將DMEM培養基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%、1%，重複步驟I)至步驟3)，每兩天傳代一次，直至培養兩天後能達到1.2XlOVml細胞，活力95%以上，即得適應1%FBS DMEM培養基懸浮培養的HEK-293細胞；
[0029]6)將適應1%FBS DMEM培養基懸浮培養的HEK-293S細胞每兩天按照0.5X 106/ml傳代一次，擴大培養到50ml培養體積，至兩天後能達到1.2 XlOVml細胞，活力95%以上；[0030]7)對適應1%FBS DMEM培養基懸浮培養的HEK_293s細胞進行70 μ m細胞篩過濾處理，觀察並記錄過濾後的HEK-293S細胞團數量及大小；
[0031]8)傳代步驟7)中過濾後的HEK-293S細胞於含25%293SFM II及75%DMEM的混合培養基中，該DMEM中含1.0%FBS,每兩天傳代一次，直至培養兩天後能達到1.2X 106/ml細胞，活力90%以上；
[0032]9)按照50%、75%和100%的比例增加混合培養基中293SFM II的比率，增加293SFMII比率的同時按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培養基中DMEM中的FBS含量，用此混合培養基依次傳代培養步驟8)所得的HEK-293sus細胞，直至所述的HEK_293sus細胞於含100%293SFM II且無FBS存在的培養基中培養兩天後能達到1.2X106/ml細胞密度，活力90%以上，且細胞無結團現象；
[0033]10)以4X 107ml密度凍存步驟9)得到的適應100%293SFM II懸浮培養生長條件的HEK-293SUS於_80°C醫用低溫冰箱中，次日轉移凍存管至液氮罐中保存。
[0034]1.2 HEK-293細胞的大規模懸浮培養
[0035]I)取以上步驟得到的處於凍存狀態的HEK-293SUS細胞作為293細胞種子，將冷凍管直接投入37°C溫水，不時搖動令其儘快融化，解凍I分鐘；取出冷凍管，用酒精消毒後打開管蓋，吸出細胞懸液，注入離心管並滴加10倍以上培養液，混合後低速離心，除去上清液，再用培養液重複洗一次；用培養液10倍稀釋後，接種T形組織培養瓶中，細胞密度為
0.2X106cells/ml。置於37°C、5%C02條件下培養，觀察細胞生長狀態。
[0036]24h後按照1:2的比例轉移至攪拌式細胞培養瓶擴大培養，每個方瓶培養體積為15ml ;待組織培養瓶培養體積達到200ml時，接種至IL搖瓶中；將200ml方瓶培養中的HEK-293S細胞經0.25%胰酶消化後，用293F Freestyle SFM培養基分散並調整細胞密度為
0.6X 106cells/ml,第I~2天攪拌速度40r/min,自培養第3天起攪拌速度為60r/min,置於37°C、5%C02條件下擴大培養。
[0037]按照規程完成生物反應器的安裝、校準和滅菌消毒，連接攪拌電極、pH電極導線、融氧電極導線、溫度探頭、收液瓶、取樣管等，檢查無誤後，開機；
[0038]按照標準操作規程補充灌流培養基約2L進入5L生物反應器內，開機運行48小時，觀察溫度、攪拌速度、pH、融氧等各項參數穩定狀況；
[0039]接種細胞，待細胞轉瓶體積至800ml，細胞密度達到0.6X 106Cells/ml時，接種到5L生物反應器中，起始培養體積約3.5L。
[0040]設置起始培養條件:溫度37°C ；pH7.2 ;融氧控制40% ;攪拌速度lOOrpm。培養72小時，至細胞密度達到1.2X106cells/ml。
[0041]2)用0.25%胰酶消化罐內細胞，製得細胞懸液，接種至250L生物反應器，起始培養體積75L。
[0042]設置起始培養條件:溫度37°C ；pH7.2 ;融氧控制40% ;攪拌速度llOrpm，培養72小時，至細胞密度達到2.lX106cells/ml。[0043]3)自培養第4天起灌流培養補液加入24L的無血清培養基，提高攪拌速度至115rpm,培養24小時，再此補充培養基19.5L，提高攪拌速度至120rpm，培養48小時至細胞密度達到3.3X106cells/ml，收穫細胞懸液。
[0044]實施例2
[0045]5L生物反應器:Biostat公司生產,低剪切槳式攪拌器,旋轉濾器(Spinfilter)和無氣泡通氣系統，以及中空纖維培養系統(強化元件);溫度、PH、攪拌、溶氧PID全自動控制，四氣混合控制供氣系統，融氧雙參數關聯、回收液流速。
[0046]250L生物反應器:Biostat公司生產，低剪切槳式攪拌器，旋轉濾器(Spinfilter)和無氣泡通氣系統，以及中空纖維培養系統(強化元件);溫度、PH、攪拌、溶氧PID全自動控制，四氣混合控制供氣系統，融氧雙參數關聯、回收液流速。
[0047]細胞系:HEK-293sus細胞，購自中科院上海細胞所；293SFM II培養基自市面購得。
[0048]2.1 HEK-293細胞的馴化培養
[0049]2.1.1 HEK-293細胞的全懸浮馴化培養
[0050]I)接種HEK-293細胞於含IOml DMEM完全培養基的IOcm培養皿中，放於37°C，5%C02的培養箱中培養2天達到100%匯合狀態；
[0051]2)棄除培養基並加入0.25%胰酶EDTA使HEK-293細胞消化脫離培養皿表面，然後加入3ml DMEM完全培養基終止胰酶消化；
[0052]3)將上述消化後的細胞用移液管吸取，並轉移到15ml的尖底離心管中，IOOOrpm離心lmin，沉降收集HEK-293細胞，並用IOml DMEM完全培養基重懸收集的細胞，再將全部細胞接種於培養皿中，放於37°C，5%C02的培養箱中；
[0053]4)步驟3)中放入培養箱中的細胞每培養2天重複步驟2)和3)，重複7_11次，直至培養皿中同時出現貼壁細胞和懸浮生長的細胞團；吸取及轉移過程中注意勿打散細胞團；
[0054]5)將最後一次培養的全部細胞消化後轉移至搖瓶中培養，每兩天按照0.5X IO6/ml傳代一次，每次傳代均用0.25%胰酶EDTA消化細胞團至分散狀態，直至培養兩天後能達到1.2X 107ml細胞，活力95%以上，即得可連續傳代95-105代，並可達到最高密度
1.3 X 107/ml的，適應10%FBS DMEM培養基懸浮培養的HEK-293細胞，命名該懸浮培養細胞為HEK-293sus細胞，以4X 106/ml密度凍存即可。
[0055] 2.1.2對上述馴化後的HEK-293sus懸浮細胞的無血清馴化
[0056]I)用含10%FBS的DMEM培養基於培養皿中培養細胞至密度為L 2X106/ml，活力95%以上，收集細胞於離心管中，於IOOOrpm離心2min沉降，留沉澱；
[0057]2)用0.25%胰酶EDTA消化沉澱的細胞團，並在此過程中震蕩離心管，使細胞均勻分布；
[0058]3)加入5ml含10%FBS的DMEM培養基終止胰酶消化作用，並重懸步驟2)得到的HEK-293s 細胞，按照 0.5 XlOVml 傳代；
[0059]4)每兩天重複步驟I)至步驟3)—次，直至培養兩天後能達到1.2XlOVml細胞，活力95%以上；
[0060]5)分步將DMEM培養基中的FBS降至10%、5%、2.5%、1.5%、1%，重複步驟I)至步驟3)，每兩天傳代一次，直至培養兩天後能達到1.2XlOVml細胞，活力95%以上，即得適應1%FBS DMEM培養基懸浮培養的HEK-293細胞；
[0061]6)將適應1%FBS DMEM培養基懸浮培養的HEK-293S細胞每兩天按照0.5X 106/ml傳代一次，擴大培養到50ml培養體積，至兩天後能達到1.2 XlOVml細胞，活力95%以上；
[0062]7)對適應1%FBS DMEM培養基懸浮培養的HEK_293s細胞進行70 μ m細胞篩過濾處理，觀察並記錄過濾後的HEK-293S細胞團數量及大小；
[0063]8)傳代步驟7)中過濾後的HEK-293S細胞於含25%293SFM II及75%DMEM的混合培養基中，該DMEM中含1.0%FBS,每兩天傳代一次，直至培養兩天後能達到1.2X 106/ml細胞，活力90%以上；
[0064]9)按照50%、75%和100%的比例增加混合培養基中293SFM II的比率，增加293SFM
II比率的同時按照1.0%、0.5%、0的比例降低混合培養基中DMEM中的FBS含量，用此混合培養基依次傳代培養步驟8)所得的HEK-293sus細胞，直至所述的HEK_293sus細胞於含100%293SFM II且無FBS存在的培養基中培養兩天後能達到1.2X106/ml細胞密度，活力90%以上，且細胞無結團現象；
[0065]10)以4X 107ml密度凍存步驟9)得到的適應100%293SFM II懸浮培養生長條件的HEK-293SUS於_80°C醫用低溫冰箱中，次日轉移凍存管至液氮罐中保存。
[0066]2.2 HEK-293細胞的大規模懸浮培養
[0067]I)取以上步驟得到的處於凍存狀態的HEK-293SUS細胞作為293細胞種子，先在T形組織培養瓶中傳代擴增，再轉移到攪拌式細胞培養瓶中進一步傳代擴增，而後轉移到5L容積生物反應器中進行培養，而後挑選 形態健康、生長良好的細胞用於下級培養的種子細胞；
[0068]2)用0.25%胰酶消化上述下級培養的種子細胞，製得細胞懸液，接種至250L生物反應器，起始培養體積75L ；
[0069]設置起始培養條件:溫度36°C ；pH7.1 ;溶氧控制45% ;攪拌速度115rpm，培養72小時，至細胞密度達到2.lX106cells/ml。
[0070]3)自培養第4天起灌流培養補液加入24L的無血清培養基，提高攪拌速度至115rpm,培養24小時，再此補充培養基19.5L，提高攪拌速度至120rpm，培養48小時至細胞密度達到3.3X106cells/ml，收穫細胞懸液。
[0071]以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明。凡在本發明的申請範圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)取293細胞種子，先在T形組織培養瓶中傳代擴增，再轉移到攪拌式細胞培養瓶中進一步傳代擴增，而後轉移到5L容積生物反應器中進行培養，而後將培養得到的細胞用於下級培養的種子細胞； 2)將步驟I)得到的用於下級培養的種子細胞的用胰蛋白酶消化液消化，用無血清293SFM II培養基懸浮培養製成細胞懸液，按一定的細胞密度接種到生物反應器調整培養條件為:培養溫度在36-38°C ；pH維持在7.0-7.4之間；溶氧濃度在40%_50%之間；攪拌速度在100-135rpm之間，在培養的第1_3天攪拌速度設置為100_120rpm，自培養第4天開始在110-135rpm的範圍內逐步提高攪拌速度持續培養； 3)培養過程中每24小時補充步驟2)中無血清293SFMII培養基總量20% (v/v)的新鮮無血清293SFM II培養基，直至培養結束。
2.根據權利要求1所述的一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於步驟I)所述293細胞種子在接種到T形組織培養瓶中之前先進行馴化培養。
3.根據權利要求1所述的一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於所述生物反應器為自動控溫攪拌罐式反應器。
4.根據權利要求1所述的一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於步驟2)所述的細胞接種密度為0.5X IO6-L 5X IO6個/ml。
5.根據權利要求1所述的一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於步驟2)所述的培養溫度為37°C。
6.根據權利要求1所述的一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於步驟2)所述的pH值為7.2。
7.根據權利要求1所述的一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於步驟2)所述的溶氧濃度為45%。
8.根據權利要求1所述的一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於步驟2)所述的第1-3天攪拌速度設置為llOrpm。
9.根據權利要求4所述的一種293細胞的大規模懸浮培養方法，其特徵在於步驟2)所述的細胞接種密度為0.6 X IO6個/ml。
【文檔編號】C12N5/073GK103468638SQ201310439028
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月23日 優先權日:2013年9月23日
【發明者】夏廣欣, 呂茂傑, 何召慶, 王壽山, 吳全忠, 楊保收, 梁武, 李守軍 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司