一株短小芽孢桿菌及其在防病促生中的應用的製作方法

2023-07-17 22:13:46

專利名稱：一株短小芽孢桿菌及其在防病促生中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株短小芽孢桿菌，及其在防治菸草真菌、細菌病害以及促生中的應用。
背景技術：
菸草從育苗到收穫，往往會遭受多重真菌病害的危害，國內有記載的菸草真菌、細菌病害60餘種，其中危害重的近10種，主要包括菸草黑脛病、菸草青枯病、赤星病、炭疽病、 低頭黑病及白粉病等。有些病原可在菸草的各個生育期危害，有些病原只在菸草的某個生育期危害某些器官；除此之外，有些菸草病害如菸草白粉病等有一定的區域性，另外一些病害如菸草黑脛病、菸草赤星病和菸草炭疽病幾乎沒有區域限制，常隨著不同年份的氣候而發生流行。隨著菸草專業化生產的不斷發展，對品質產量的要求越來越高，加強研究和防治菸草真菌病害是保證菸草優質、高產的主要措施。近年來，菸草真菌和細菌病害的危害呈上升趨勢，造成煙田嚴重減產。據全國菸草病蟲害預測預報及綜合防治網統計，2007和2008年16個烤菸主產省真菌、細菌病害發生面積均累計800萬畝以上，產量損失3000萬千克以上，產值損失3億元以上，菸草病害的危害已成為制約我國菸草產業發展的一個重要瓶頸。菸草主要真菌和細菌病害的症狀及危害如下(1)菸草黑脛病病原菌主要從莖基部侵染並產生黑斑，很快向莖上擴展，病株葉片自上而下依次變黃，縱剖病株莖部，髓部變黑褐色，幹縮成碟片狀，碟片間可見白色菌絲。病原菌為菸草疫黴菌。目前，菸草黑脛病除東北煙區零星發生外，全國其它煙區均普遍發生，我國烤菸平均每年因菸草黑脛病造成的經濟損失達1億元以上，僅次於菸草病毒病。( 菸草青枯病該病在我國俗稱為「煙瘟」、 「半邊瘋」，是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種細菌性維管束病害， 發病煙株葉片萎蔫下垂直至枯死。對菸草產量和質量影響極大，是威脅世界菸草生產的毀滅性病害之一，在中國南方煙區普遍發生，目前該病造成的損失已各類侵染性病害第4位， 必須重視該病的防治工作；(3)菸草赤星病又稱「火炮斑」，一般從下部葉片開始發生，以後逐漸向上部葉片發展，最初葉片上出現黃褐色斑點，以後變成褐色，病斑產生明顯的同心輪紋，質脆，易破，病斑邊緣明顯，外圍有淡黃色暈環，病斑中央有黑色的黴狀物；是烤菸生產上主要病害之一，多發生於生長中後期，對烤菸生產影響很大。(4)菸草炭疽病多發生於苗期，發病初期，在葉片上產生暗綠色水浸狀斑點，l-2d內可擴展成直徑2-5mm的圓斑， 中央為灰白色或黃褐色，稍凹陷，邊緣明顯，稍隆起呈赤褐色，俗稱「水點子」，天氣多雨時葉片柔嫩，病斑多呈褐色，有時有輪紋或產生小黑點即病原菌的分子孢子盤。莖上病斑較大， 呈網狀縱裂條斑、凹陷。病原為菸草刺盤孢菌。鑑於化學防治對環境的汙染和生態平衡的破壞，因此菸草病害的生物防治越來越被重視。利用有益微生物防治植物病害，已成為一個十分活躍並開始顯示良好應用前景的令頁域。i午多論著報導(Cook, K. J. and Baker K. F. The nature and practice of biological control of plant pathogens. 1984，APS press USA)認為生物防治在未來農業中具有重
3要地位。大量的研究表明，無論是自然發生的生物防治現象還是人們用於生物防治的生物類型中，生防細菌的作用是非常明顯的。其主要優勢在於1)細菌的種類和數量眾多，在植物根際和地上部大量存在；幻細菌對病原菌的作用方式較廣，可以通過競爭、拮抗和誘導植物產生抗性等方式對病原菌產生影響；幻具有驚人的繁殖速度；4)許多細菌存在於植物根際和地上部，對植物的生態比較適宜；5)細菌大多可以人工培養，便於控制，在實踐中易於操作；6)有些細菌不僅能防治病害而且可以增加作物產量。因此本發明將從生物防治方面進行探索，篩選防效促生效果好的拮抗細菌菌株， 並對其防病促生效果進行研究，為將來通過常規和分子生物學途徑，利用這些拮抗細菌及其抗菌物質防治菸草真菌和細菌病害提供研究基礎和實驗材料。在植物的根圍、葉圍及其它微生態區系中，拮抗細菌廣泛存在，且由於培養方便、 生長周期短、作為新拮抗菌來源具有很大的開發潛力。菸草真菌病害是危害菸草生產中最嚴重的病害，每年都造成菸葉產量的嚴重損失和品質下降，是菸草生產中一個很重要的制約因素。如何有效地防治和減輕菸草真菌病害的危害一直是許多科研工作者的目標。不合理的化學防治不僅提高了防治成本導致菸葉農藥殘留量增加，且抗藥性不斷增強，影響菸葉質量；選育抗病品種很難，且抗性容易喪失。因此不斷尋找新的菸草真菌、細菌病害防治方法是一項長期的任務。國內對菸草真菌、細菌病害的生物防治已有報導，但多數生防菌株僅針對於某一種病害有良好的防治效果，對多種真菌、細菌病害病原菌均具有生防作用的芽孢桿菌菌株國內鮮有研究和報導。

發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一株防病促生生防短小芽孢桿菌菌株，其可用於菸草真菌、細菌病害的生物防治，為真菌、細菌病害的防治提供了新的微生物資源。本試驗將從生物防治方面進行探索，篩選防效促生效果好的拮抗細菌菌株，並對其防病促生效果進行研究，為將來通過常規和分子生物學途徑，利用這些拮抗細菌及其抗菌物質防治菸草真菌和細菌病害提供研究基礎和實驗材料。本發明是通過以下技術方案實現的一株短小芽孢桿菌，命名為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus,已於2010年08月 23日由中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為CGMCC No. 4117。本發明的菌株菌株具有蛋白酶活性，室內拮抗試驗顯示該菌株對菸草黑脛 |if (Phytophthora parasitica var. nicotianaer)、 胃胄 δ _ lif (Ralstonia
solanacearum)、赤星病菌(Alternaria alternata(Fries)Keissler)及炭疽病菌 (Colletotrichum micotianae verna)均有較好的抑制作用；其發酵液抑制黑脛病菌和赤星病菌菌絲的生長並致菌絲畸形、膨大。本發明針對菸草主要真菌和細菌病害病原菌菸草黑脛病菌(Wiytophthora parasitica var. nicotianaer)、菸草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、赤星病菌 (Alternaria alternata (Fries)Keissler)及炭疽病菌(Colletotrichum micotianae verna)，通過室內平板對峙法和活體溫室防效測定，篩選出在溫室條件下對具有良好防病作用的拮抗菌株AR03，測定其16srDNA全序列，應用其中的BLAST軟體和DNAMAN軟體進行分析，AR03菌株的序列與短小芽孢桿菌16s rDNA部分序列相同，同源性100%，因此鑑定AR03菌株為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。該菌株的培養條件為30°C，普通牛肉汁蛋白腖培養基，PH7.0。該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus)、短小芽孢桿菌種；經鑑定，關於該菌株的信息包括能形成芽孢；含菌發酵液對上述三種真菌的抑制作用顯著，而除菌發酵液對病原真菌無抑制作用(見圖2)。生物學測定表明，AR03菌體及發酵液在牛肉汁平板上能夠抑制黑脛病菌、菸草赤星病菌及炭疽病菌及青枯雷爾氏菌的生長；AR03菌體對黑脛病菌菌絲的抑制表現為處理後的菌絲細胞質聚集為球狀，與細胞膜脫離，不能正常生長；AR03菌體對赤星病菌菌絲的抑制表現為分隔菌絲嚴重變形、膨大，頂端生長畸形。另外，AR03菌株尚具有蛋白酶活性(見圖9)。防病試驗顯示，AR03菌株發酵液對菸草黑脛病的防治效果理想，不但能推遲菸草黑脛病的發病時間；在接種後第30d時，AR03 發酵液處理的防效達到68. 4%，高於對照藥劑58%甲霜 錳鋅處理的防效。對青枯病的防治試驗顯示，AR03發酵液對菸草青枯病的防效為70. 2%。促生試驗結果顯示，在自然菌土中，經AR03處理後煙苗的各指標均比對照高， 平均株高、整株鮮重、整株乾重和根乾重的增長率分別是42. 5 ^^39.0%, 109. 4%和 130. 2%，促生作用明顯。由上可見，本發明的短小芽孢桿菌可以用於製備生物防治菸草或蔬菜真菌病害的菌劑，也可以用於製備促進菸草或蔬菜生長的生長劑，能夠促進作物生長，尤其是菸草，蔬菜可以是黃瓜、辣椒、茄子、番茄等。本發明通過優化菌株AR03的發酵條件，建立了 AR03最佳發酵條件為0. 9%牛肉膏+1.5%蛋白腖+1%葡萄糖+0. 5% NaCl ；發酵起始pH值為7. 3、300ml的三角瓶裝瓶量為 60ml、接種量為8%、溫度為31°C、轉速為140r/min，發酵時間為36h。利用AR03固體發酵菌劑防治菸草黑脛病的田間試驗結果顯示，AR03與72%甲霜靈錳鋅聯合使用的防效和促生作用最佳，單獨施用AR03效果次之，均好於單獨施用化學藥劑。該菌株熱穩定性好，抗逆性強，促生效果俱佳，是優質的微生物農藥，是優質的微生物農藥資源。可以預見，本發明的菌株將有著廣闊的應用前景。


本發明的短小芽孢桿菌命名為Bacillus pumilus，已於2010年08月23日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為CGMCCN0. 4117，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，郵編100101。圖1為實施例1中AR03對菸草黑脛病菌的拮抗活性示意圖，其中，左為AR03，右為空白對照。圖2為AR03發酵液對菸草黑脛病菌的拮抗活性。其中，上面兩皿為AR03除菌發酵液處理，下面皿為無菌水處理。圖3為AR03對黑脛病菌菌絲生長的抑制作用示意圖，其中，左為黑脛病菌正常菌絲，右為AR03處理後畸形菌絲。圖4為AR03對菸草赤星病菌的拮抗活性示意圖，其中，左為AR03，右為空白對照。圖5為AR03發酵液對菸草赤星病菌的拮抗活性示意圖，其中，左為AR03發酵液， 右為無菌水。
圖6為AR03對赤星病菌菌絲生長的抑制作用示意圖，其中，左為黑脛病菌正常菌絲，右為AR03處理後畸形菌絲。圖7為AR03對菸草炭疽病菌的拮抗活性示意圖。圖8為AR03對青枯雷爾氏菌的拮抗活性示意圖。圖9為AR03蛋白酶活性示意圖。圖10為AR03菌株對菸草青枯病盆栽防治效果示意圖，其中，右為AR03發酵液灌根處理，右為CK。圖11為AR03菌株促生作用示意圖，其中，左為AR03處理，右為對照。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例1 AR03及其發酵液對菸草主要真菌、細菌病害病原菌的拮抗作用接種AR03於NA平板上30°C培養48h，然後採用平板對峙法，即在燕麥平板上接種黑脛病菌、赤星病菌、炭疽病菌菌餅(直徑為3mm)，用接種環挑取AR03並以菌餅為中心等距離劃線，置於30°C培養5d，對青枯雷爾氏菌的抑制採用平板擴散法；觀察AR03對上述各致病菌的抑制情況。從室內平板抑菌效果看，AR03菌體對菸草黑脛病菌、赤星病菌、炭疽病菌及青枯雷爾氏菌均具有很好的抑制作用(見圖1、4、7和8)。AR03菌株發酵液的拮抗活性是將活化的AR03接種於NB培養基中30°C振蕩培養 4 得到發酵液，分別取其含菌發酵液和去菌體後的上清液按照濾紙條法測定其對黑脛病菌的拮抗活性，具體方法如下分別在無菌濾紙條(7mmX3mm)均勻滴入50μ 1，按照十字交叉方向小心將濾紙條置於培養皿中，然後將黑脛病菌和赤星病菌菌餅等距離接種在濾紙條的空當中，30°C培養5d，觀察菸草黑脛病菌的拮抗活性，從結果可以看出，AR03含菌發酵液對菸草黑脛病菌、赤星病菌均有很強的拮抗作用，而除菌上清液無抑制作用(見圖2、5)。實施例2 AR03發酵液對菸草黑脛病的盆栽防治效果AR03發酵液對菸草黑脛病和青枯病的盆栽防治效果採用AR03發酵液灌根的方法處理煙苗，具體方法如下將活化的AR03菌株接入NB培養基中，搖床振蕩培養4 後，稀釋100倍(培養液濃度為l*108cfu/ml)，備用。黑脛病菌菌谷的製備黑脛病菌活化後，接入裝有穀子培養基的三角瓶中，恆溫08)培養8d，即黑脛病菌長滿穀子培養基後從三角瓶中取出，碾碎即得到菌谷。供試菸草品種為小黃金1025，取3-4片葉煙苗，移栽到花盆中，用 AR03培養液灌根，每株50ml，間隔7天連續灌根2次。第一次灌根後5天接種黑脛病菌菌谷，方法是在煙苗的莖基部挖穴，施入2克/株，然後封穴。共處理12株煙苗復，對照藥劑為 58%甲霜靈 錳鋅可溼性粉劑，600倍稀釋，每株灌根50ml，間隔7天連續灌根2次；設空白 CK0調查結果顯示(見表1)，第1次調查，即接種後15d，拮抗細菌AR03培養液(IXlO8Cfu/ ml)對菸草黑脛病的的田間防治效果為79.3%，而對照藥劑58%甲霜.錳鋅WP的防效僅為64. 8%，差異顯著；第2次調查，即接種後30d，AR03菌株對菸草黑脛病的防治效果下降為68. 4%，而對照藥劑的防效為60. 6 %，差異不顯著。表1拮抗細菌AR03培養液防治菸草黑脛病試驗*
權利要求
1.一株短小芽孢桿菌，其特徵在於該菌株命名為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus, 已於2010年08月23日由中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為 CGMCC No. 4117。
2.權利要求1所述的短小芽孢桿菌在防治菸草真菌、細菌病害中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述菸草真菌、細菌病害包括菸草黑脛病菌、菸草青枯病菌、赤星病菌及炭疽病菌。
4.權利要求1所述的短小芽孢桿菌在防治蔬菜真菌、細菌病害中的應用。
5.權利要求1所述的短小草芽孢桿菌在促進菸草或蔬菜生長中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於所述蔬菜包括黃瓜，辣椒，茄子，番茄。
全文摘要
本發明公開了一株短小芽孢桿菌，命名為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus，已於2010年08月23日由中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為CGMCC No.4117。本發明的短小芽孢桿菌可以用於製備生物防治菸草或蔬菜真菌病害的菌劑，也可以用於製備促進菸草或蔬菜生長的生長劑，能夠促進作物生長，尤其是菸草。該菌株熱穩定性好，抗逆性強，促生效果俱佳，是優質的微生物農藥，是優質的微生物農藥資源。可以預見，本發明的菌株將有著廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/07GK102296036SQ20111014668
公開日2011年12月28日 申請日期2011年6月1日 優先權日2011年6月1日
發明者孔凡玉, 張成省, 王靜 申請人:中國農業科學院菸草研究所