一種基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法

2023-07-17 22:25:21

專利名稱：一種基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法
技術領域：
本發明涉及食品安全領域，具體地涉及一種檢測副溶血弧菌的方法。
背景技術：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽桿菌,在海產品中的攜帶率高達45.7%，在我國部分沿海地區，由副溶血弧菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒事件中居首位。經加熱、冷凍、脫水等處理後，細菌或被殺死，或無損的存活下來，還有一些可能受到了亞致死性損傷。在適當條件下，受損細菌可以修復損傷並恢復包括毒力和繁殖能力在內的所有生理活性，仍具有致病性，嚴重威脅人類健康。因此，檢測副溶血弧菌及其亞致死損傷對於食品安全監控和人類健康都具有重要意義。對於細菌的鑑定，常規培養檢測方法包括增菌培養、選擇性培養、生化試驗和血清學反應等過程，耗時長、操作繁瑣、檢出率低，不適應實際檢驗工作的需要。以免疫學為基礎的檢測方法利用抗原抗體反應的顯著特異性，包括ELISA、免疫螢光法和放射免疫試驗等。基於核酸的檢測方法如PCR技術可以在很短時間內將幾個甚至一個目標序列擴增到幾百萬個拷貝，為致病菌檢測提供了一種快速、靈敏、特異的檢測方法，但對於食品樣品中的抑制物質非常敏感，有時會給出假陰性結果。目前已公開的副溶血弧菌檢測相關的兩個專利包括實用新型專利「用於檢測腸道感染的集合膠體金試紙」(中國專利申請號:201120375786.7)和發明專利「PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法」(中國專利申請號:201210272737.X)。對於亞致死損傷細菌的檢測，現有技術的缺點是:常規培養法工作量大，檢測周期長，且可能低估甚至給出假陰性結果；微生物表面形態觀察法，則對實驗者的操作技能要求較高，且儀器昂貴；基因晶片法價格昂貴，檢測時間長，需要專業人員操作等。目前已公開的損傷細菌檢測相關的專利僅有發明專利「螢光法快速測定活細菌總數」(中國專利申請號:200810140095.1)。紅外光譜技術具有操作簡單、分析速度快、成本低、應用範圍廣、靈敏度高等優點，顯微紅外光譜技術將光學顯微鏡與紅外光譜技術相結合，比普通紅外光譜技術更快、更靈敏、更簡便。但紅外譜圖提供的信息較複雜，樣品之間差異細微，一般需要結合化學計量學深入分析。紅外光譜技術在微生物檢測中的應用興起於上世紀九十年代，目前，國內外尚未見到利用紅外光譜技術研究副溶血弧菌亞致死損傷的報導，且大多採用普通紅外技術研究細菌。目前未見利用紅外光譜技術對副溶血弧菌進行鑑定和不同狀態檢測的專利。

發明內容
鑑於上述現有技術發展情況，本發明的目的就是提供一種快速、簡便的基於顯微紅外光譜技術檢測副溶血弧菌的方法。本發明的目的是這樣實現的:首先利用顯微紅外光譜儀，通過高級功能「Map view」自動採集不同類別細菌或不同狀態副溶血弧菌的多張紅外譜圖，進行二階導轉換等數據預處理。繼而對每個菌株的24個樣本，分別提取四個特徵中紅外波段(3000-2800011'1800-1500011'1500-1200011'UOO-SOOcnT1) 二階導數譜的波數和峰值，進行主成分分析(PCA)，建立每個波段的鑑別模型。最後同樣提取四個特徵波段二階導數譜的信息，從每個菌株的24個樣本中隨機選取14個加入訓練集，剩下10個加入預測集，進行類模擬軟獨立建模(SMCA)分析，預測未知樣本，驗證每個波段模型的可靠性。通過以上步驟既可以特異鑑定副溶血弧菌，也可以檢測正常和不同程度損傷狀態的副溶血弧菌。本發明所述的基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，包括如下步驟:(I)製備待檢樣品培養待測菌株，收集菌體，將菌體懸浮於生理鹽水中，取菌懸液滴在BaF2鹽片上，乾燥；(2)光譜採集利用顯微紅外光譜儀採集細菌的微區域吸收信號，獲得原始譜圖(map)文件；(3)數據預處理將原始譜圖(map)文件轉換成紅外譜圖，並將紅外譜圖進行二階導轉換；(4)主成分分析(Principle Component Analysis, PCA)提取特徵波段二階導數譜的信息，進行主成分分析(Principle ComponentAnalysis，PCA)建立不同類別或不同狀態細菌的鑑別模型；(5)模型驗證利用類模擬軟獨立建模(SoftIndependent Modeling of Class Analogy, SIMCA)預測不同類別或不同狀態的細菌，驗證模型可靠性。優選地，所述利用類模擬軟獨立建模(Soft Independent Modeling of ClassAnalogy, SIMCA)預測，是指提取所述特徵波段二階導數譜的信息，將每個菌株的樣本隨機分為訓練集和預測集，對訓練集中每一類樣本測量數據矩陣，建立主成分回歸模型，計算未知樣本到各類模型的SIMCA距離，以確定未知樣本類別，根據SIMCA結果統計每類樣本在每個波段的預測率和拒絕率，驗證模型可靠性具體操作如下:(I)製備待檢樣品將5 μ L溶於生理鹽水的菌懸液滴在BaF2鹽片(Φ 10 X 2mm)上，均勻鋪開，乾燥器中放置30min，晾乾後上機檢測。每塊鹽片上同時滴5個樣品，3孔透射支架同時放置3塊鹽片，一次可完成15個樣品的測試。(2)光譜採集利用高級功能「Map view」 一次自動採集8個微區域的吸收信號，光闌為100 μ mX 100 μ m,步長為100 μ mX 100 μ m,對每個類別或狀態的菌株均準備3份平行樣品，共獲得3個map文件。採集參數為:掃描範圍ΜΟΟΟ-ΘΟΟαιΓ1 ;採集時間:3s，即16張幹涉圖加和；解析度AcnT1。 (3)數據預處理將每個原始map文件轉換成8張紅外譜圖，選取4000-800(^1波段進行大氣背景抑制、自動基線校正、歸一化(使醯胺譜帶I1655CHT1的吸收強度等於1)，採用Savitzky-Golay模式，平滑點數為7，多項式次數為3，將譜圖進行二階導轉換。(4) PCA 分析提取以下四個中紅外特徵波段二階導數譜的波數和峰值，分別進行後續的PCA分析和 SMCA 分析:3000-2800cm_1U800-1500cm_1U500-1200cm_1U200-800cm_1o 對每個菌株的24個樣本，分別提取上述四個特徵波段二階導數譜的信息，進行PCA分析。PCA屬於無監督的分類方法，可將多維的數據壓縮成幾個主要、獨立的潛在變量(主成分，PC)，這些主成分保存了最相關和最具代表性的信息。PCl表示能描述目標多維數據矩陣中最顯著的特性，PC2表示除PCl之外的所能描述目標多維數據矩陣中最顯著的特性。二維PCA示意圖可直觀區分不同類別或不同狀態的細菌，從而建立每一個波段的鑑別模型。(5) SIMCA 分析驗證對每個菌株的24個樣本，分別提取步驟(4)中四個特徵波段二階導數譜的信息，從每個菌株的24個樣本中隨機選取14個加入訓練集，剩下10個加入預測集；對訓練集中每一類樣本測量·數據矩陣，建立主成分回歸模型；計算未知樣本到各類模型的SMCA距離，以確定未知樣本類別；根據SIMCA結果統計每類樣本在每個波段的預測率和拒絕率，考察模型可靠性。本發明利用顯微紅外光譜儀採集不同類別或狀態的細菌譜圖(均為純培養物)，對原始數據進行一系列預處理後，結合化學計量學中的PCA和SMCA，可特異鑑定副溶血弧菌，也可以檢測正常和不同程度損傷狀態的副溶血弧菌。本發明的優點是:檢測快速，操作簡便，靈敏度高，特異性強，結果可靠；1、結果可靠，對於亞致死損傷副溶血弧菌的檢測，紅外光譜的結果得到了傳統經典的培養法的驗證。2、特異性強，可特異性鑑定副溶血弧菌。3、快速，顯微紅外光譜儀I小時可採集大於120張譜圖，從樣品前處理到完成數據處理的整個檢測過程不超過一天。4、簡單，前處理只需簡單離心，儀器操作簡單，「Map view」可自動採集多個微區域的紅外譜圖。5、靈敏度高，只需5 μ L濃縮菌液就可獲得很強的紅外信號。6、普及性強，操作者容易學習和掌握。7、適用範圍廣，不僅可用於副溶血弧菌的檢測，也可推廣用於其他食源性致病菌和細菌的檢測。8、應用領域多，即可應用於副溶血弧菌的鑑定，也可應用於副溶血弧菌存活和亞致死等各種不同狀態的檢測。


圖1 為不同菌株區分的 PCA 示意圖，A:1200-800(^1 ；B:1500-1200(^1 ；C:1800-1500cm_1 ；D:3000-2800cm_1 ；I:Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 ；II:Listeriamonocytogenes EDGe0圖2為未受損與不同程度受損副溶血弧菌ATCC17802區分的PCA示意圖，A:1200-8000^1 ；B:1500-1200cm_1 ；C: 1800-1500cm_1 ；D:3000-2800cm_1 ；1:未受損；I1:加熱2min ；II1:加熱 4min ；IV:加熱 6min ；V:加熱 8min。本發明中，所用試劑、儀器以及菌株均可從市售獲得。所用菌株副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus ATCC17802和單增李斯特菌Listeria monocytogenes EDGe購自中國微生物菌種網。不同菌株類型，並不影響本發明的鑑定效果。
具體實施例方式以下結合附圖和附表通過實施例對本發明做進一步說明。實施例1:基於顯微紅外光譜技術快速鑑定副溶血弧菌

菌液製備:將供試菌株Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 從 _80°C超低溫冰箱中取出，在TCBS培養基上37°C劃線培養16h，挑取典型單菌落，接種於200mL含3%NaCl的胰蛋白腖大豆肉湯中，37°C下175rpm過夜振蕩培養至穩定期；將供試菌株Listeriamonocytogenes EDGe從_80°C超低溫冰箱中取出，在TSA-YE培養基上37°C劃線培養18 24h，挑取典型單菌落，接種於200mL胰蛋白腖大豆肉湯中，37°C下250rpm振蕩培養24h至穩定期。取IOmL菌液加入50mL離心管中，4000r/min離心4min收集細胞。為消除代謝產物和培養基對細菌紅外譜圖的影響，將細胞用IOmL無菌生理鹽水洗滌兩次後，倒掉生理鹽水收集菌體，重新懸浮於200 μ L生理鹽水中，供光譜分析。每個菌株各做3次平行試驗，獲得3個平行樣品。光譜採集:取5 μ L菌液直接滴在BaF2片上，乾燥器中放置半小時，待水分蒸乾後，上顯微紅外光譜儀進行測試。每塊鹽片上同時滴3個樣品，3孔透射支架同時放置2塊鹽片，在短時間內完成了 6個樣品的測試。掃描範圍:4000-600(31^1 ;採集時間:3s ;解析度:ScnT1 ;通過面掃描(Map View)模式,每個樣品採集8張圖譜,獲得I個map文件,步長為100 μ mX 100 μ m，光闌為ΙΟΟμπιΧΙΟΟμπι。每個菌株共有24張圖譜。數據預處理:將原始map文件轉換成8張紅外譜圖，選取4000-8000^1波段進行大氣背景抑制、自動基線校正、歸一化(使醯胺譜帶I1655CHT1的吸收強度等於1)，採用Savitzky-Golay模式(平滑點數為7，多項式次數為3)將譜圖進行二階導轉換。提取以下四個特徵波段二階導數譜的波數和峰值，分別進行後續的PCA分析和SIMCA分析:3000-2800cm_1U800-1500cm_1U500-1200cm_1U200-800cm_1oPCA分析:對每個菌株的24個樣本，分別提取四個特徵波段二階導數譜的信息，進行PCA分析。從二維PCA示意圖(圖1)可以看出，在四個光譜波段中，單核細胞增生李斯特菌與副溶血弧菌能夠各自聚成一組，彼此區分開。PCA結果表明，紅外光譜法能夠特異地鑑定副溶血弧菌與單核細胞增生李斯特菌，從而建立了副溶血弧菌的特異鑑定模型。SIMCA分析:首先對每個菌株的24個樣本，分別提取四個特徵波段二階導數譜的信息，從每個菌株中隨機抽取14個樣本加入訓練集(共28個樣本)，剩餘的10個樣本加入預測集(共20個樣本)；然後分別計算各類的主成分回歸模型；最後根據未知樣本到各類模型的距離進行模式判別。根據SIMCA結果統計每類樣本在每個波段的預測率和拒絕率，驗證模型可靠性。預測率考察某類樣品有多少落在該類模型的區域內，而拒絕率是考察某類樣品模型對於其它不屬於該類的未知樣品的拒絕程度，當兩個值都為100%時，表明某類樣品與其他類樣品之間沒有重疊，可以較好地將其聚類分開。從表I可見，兩個菌株都在四個光譜區域都取得了 100%的預測率和100%的拒絕率，即在每一個波段中，每一個菌株的10個未知樣本都被正確歸類，都能將非本組的10個細菌樣本全部排斥在外。SIMCA結果表明，PCA模型可靠度高，能夠有效地預測未知樣本的歸屬。實施例2:基於顯微紅外光譜技術快速檢測熱激亞致死損傷的副溶血弧菌熱激試驗:供試菌株Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 從 _80°C超低溫冰箱中取出，在TCBS培養基上37°C劃線培養16h，挑取典型單菌落，接種於200mL含3%NaCl的胰蛋白腖大豆肉湯中，37°C下175rpm過夜振蕩培養至穩定期。取IOmL菌液加入50mL離心管中，4000r/min離心4mi n收集細胞。為消除代謝產物和培養基對細菌紅外譜圖的影響，將細胞用IOmL無菌生理鹽水洗滌兩次後，重新懸浮於5mL生理鹽水中，製得熱處理培養液。每個處理皆準備3個平行樣品。將I個熱處理培養液作為空白對照，另外4個裝有5mL熱處理培養液的離心管同時浸入55°C水浴,彼此保有一定空間以利於熱傳導,分別於2、4、6、Smin後取出並立即置於冰浴上冷卻至少5min。每熱激試驗重複3次。光譜採集:將菌液離心，倒掉生理鹽水收集菌體，重新懸浮於200 μ L生理鹽水中。取5 μ L菌液直接滴在BaF2片上，乾燥器中放置半小時，待水分蒸乾後，上顯微紅外光譜儀進行測試。每塊鹽片上同時滴5個樣品，3孔透射支架同時放置3塊鹽片，在短時間內完成了15個樣品的測試。掃描範圍:4000-600(^1 ;採集時間:3s ;解析度:8(^1 ;通過面掃描(MapView)模式，每個樣品採集8張圖譜，步長為100 μ mX 100 μ m，光闌為ΙΟΟμπιΧΙΟΟμπι。每個菌株共有24張圖譜。數據預處理:將原始map文件轉換成8張紅外譜圖，選取4000-8000^1波段進行大氣背景抑制、自動基線校正、歸一化(使醯胺譜帶I1655CHT1的吸收強度等於1)，採用 Savitzky-Golay 模式(7-point, polynomial degree3)將譜圖進行二階導轉換。提取以下四個特徵波段二階導數譜的波數和峰值，分別進行後續的PCA分析和SIMCA分析:3000-2800cm_1U800-1500cm_1U500-1200cm_1U200-800cm_1oPCA分析:對每個菌株的24個樣本，分別提取四個特徵波段二階導數譜的信息，進行PCA分析。從二維PCA示意圖(圖2)可以看出，在四個光譜波段中，正常細菌與受損傷細菌能夠清楚、完全地區分開，而受損傷程度不同的細菌也能基本分離，從而建立了正常和不同程度亞致死損傷副溶血弧菌的鑑別模型。SIMCA分析:首先對每個菌株的24個樣本，分別提取四個特徵波段二階導數譜的信息，從每個菌株中隨機抽取14個樣本加入訓練集(共70個樣本)，剩餘的10個樣本加入預測集(共50個樣本)；然後分別計算各類的主成分回歸模型；最後根據未知樣本到各類模型的距離進行模式判別。根據SIMCA結果統計每類樣本在每個波段的預測率和拒絕率，驗證模型可靠性。從表2可見，除3個例外，不同程度熱損傷(包括未受損)的副溶血弧菌的預測準確程度均大於80% ;拒絕率均大於90%。SIMCA結果表明，四個光譜區域模型的預測程度都較好。以上所述僅為本發明的優選實施例，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、改進等，均應包括在本發明的保護範圍之內。
表I不同菌株的SIMCA判別結果
權利要求
1.一種基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，包括以下步驟: (1)製備待檢樣品 培養待測菌株，收集菌體，將菌體懸浮於生理鹽水中，取菌懸液滴在BaF2鹽片上，乾燥； (2)光譜採集 利用顯微紅外光譜儀採集菌株的微區域吸收信號，獲得原始圖譜文件； (3)數據預處理 將原始圖譜文件轉換成紅外譜圖，並將紅外譜圖進行二階導轉換； (4)主成分分析 提取特徵波段二階導數譜的信息，進行主成分分析建立不同類別或不同狀態細菌的鑑別豐旲型; (5)模型驗證 利用類模擬軟獨立建模預測不同類別或不同狀態的細菌，驗證模型可靠性。
2.根據權利要求1所述的基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，其特徵在於:所述的副溶血弧菌為純培養物。
3.根據權利要求1所述的 基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，其特徵在於:所述步驟(2)中，利用顯微紅外光譜儀採集菌株的紅外譜圖，是指利用顯微紅外光譜儀自動採集微區域的吸收信號，光闌為100 μ mX 100 μ m，步長為100 μ mX 100 μ m，採集參數為:掃描範圍，4000-6000^1 ;採集時間，3s ;解析度，8CHT1。
4.根據權利要求3所述的基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，其特徵在於:所述步驟(2)中一次自動採集8個微區域的吸收信號，對每個待測菌株均準備3份平行樣品，進行檢測。
5.根據權利要求1所述的基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，其特徵在於:所述步驟(3)中， 所述將原始圖譜文件轉換成紅外譜圖，條件為選取^OO-SOOcnT1波段進行大氣背景抑制、自動基線校正、歸一化，使醯胺譜帶I1655CHT1的吸收強度等於I。
6.根據權利要求1所述的基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，其特徵在於:所述步驟(4)中所述特徵波段是指3000-2800011^1800-1500011^1500-12000^1和1200-800cm_1 波段。
7.根據權利要求1所述的基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，其特徵在於:所述步驟(4)中 所述二階導數譜的信息是指二階導數譜的波數和峰值； 所述主成分分析是指二維主成分分析。
8.根據權利要求1所述的基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，其特徵在於:所述步驟(5)中， 所述利用類模擬軟獨立建模預測，是指提取所述特徵波段二階導數譜的信息，將每個菌株的樣本隨機分為訓練集和預測集，對訓練集中每一類樣本測量數據矩陣，建立主成分回歸模型，計算未知樣本到各類模型的類模擬軟獨立建模距離，以確定未知樣本類別，根據類模擬軟獨立建模結果統計每類樣本在每個波段的預測率和拒絕率，驗證模型可靠性。
9.根據權利要求5所述的基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，其特徵在於:所述步驟(3)中，採用Savitzky-Golay模式，設置平滑點數為7，多項式次數為3。
10.根據上述任一項權利要求所述的基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法，其特徵在於:所述方法能夠特異鑑定副溶血弧菌，也能夠檢測正常和不同程度損傷狀態的副溶血 弧菌。
全文摘要
本發明涉及食品安全領域，建立了一種基於顯微紅外光譜技術快速檢測副溶血弧菌的方法。本發明方法為利用顯微紅外光譜儀採集細菌的紅外譜圖，進行數據預處理後提取特徵中紅外波段(3000-2800cm-1、1800-1500cm-1、1500-1200cm-1、1200-800cm-1)的信息，進行主成分分析(Principle Component Analysis,PCA)以建立鑑別模型，進行類模擬軟獨立建模分析(Soft Independent Modeling of Class Analogy,SIMCA)以驗證模型可靠性。本發明的優點是結果可靠，特異性強，檢測快速，操作簡便，靈敏度高，普及性強，應用範圍廣；可特異鑑定副溶血弧菌；可檢測正常和不同程度損傷狀態的副溶血弧菌。
文檔編號G01N21/35GK103149173SQ201310072019
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者史賢明, 喻文娟, 施春雷, 侯靜文, 王瑞斌, 朱邦尚, 王大鵬 申請人:上海交通大學