來自白錐花(Gomphostemaniveum)的生物活性水級分的製作方法

2023-07-18 01:03:56

專利名稱：：來自白錐花(Gomphostemaniveum)的生物活性水級分的製作方法
技術領域：
：本發明涉及從印度東北部常見的名為白錐花(Gww/^仍teiMflw/ve"附)的草藥的葉中獲得的新的生物活性水級分，其可用於抑制痴疾寄生蟲惡'性疾原蟲(/VflWWMwZ/w附/fl/ci》flfW/M)的生長。本發明還涉及提取這種生物活性級分的方法。本發明還涉及使用所述生物活性水級分治療疾疾的方法，以及這種生物活性水級分在治療痴疾中的用途。
背景技術：
：瘧疾是蟲媒疾病中最流行的，其造成每年報導的由惡性瘧原蟲導致(Depoteetal.7Ve"rfs,Vi/mrawto/o^(20)，4,165-198,(2004))的4億病例中超過兩百萬死亡(Greenwoodet.al.,7Va似^9415)，670(2002))。超過半數的世界人口生活在仍然具有感染瘧疾風險的地區(Sachsetal.，7V"似re，(^5人686(2002))。重要抗痗^:合物的衍生開始於1820年金雞納樹皮粉(奎寧)的發現(Brooking,GB106430,(1917))。接著，第一次世界大戰後是在保存民族植物記錄上進行了大量工作的階段，其中奎寧仍然是用於治療瘧疾的藥物的選擇。在1940年，合成了另一種抗痴藥物氯會(Ringwaldetal,o/^enw似Ae"/幼wgflmX/o",77(7人34，(1999)),直到最近，它還是唯一用於治療痴疾的藥物。令人遺憾的是，在早期的成功之後，瘧原蟲尤其是惡性痴原蟲對氯喹產生抗藥性。對氯喹抗性的痴疾的治療(Whiteetal.Delayinganti-malarialdrugresistancewithcombinationchemotherapy屍"ms/to/wVi，(41)，301-308，(1999))是由相當昂貴且有時具有毒性的替代藥物或藥物組合(Tulpet.al，Z)r"gW^wwj似^j^"450,(2004))來完成的。另外，由於對大多數抗痴藥物作用的代謝和作用機制了解不足，這些組合併不總是依據藥物動力學原理。在過去數年中，從中國植物黃花蒿(爿W/附/wVi,Vi(Klayman,腸膨(22》，1049,(1985)，Bhareletal.F/她m//fl，(67),387-399，(1996))中分離的基於植物的抗痴疾藥物證明具有很高的抗惡性痴原蟲活性。但是，由於其相對高的成本、符合GMP標準的生產有限以;5Uit毒性的報導，青蒿素(Artemisinin)(—種內過氧化物倍半萜內酯)的應用多少受到了限制(Haynesetal.C"mO/wVi./w/e"."&，(14)，719-726，(2001))。目前青蒿素的全合成途徑(US6,710，074(2004))對商業化生產來說過於複雜(Schmidetal/j附.C7^附.(105),624-625，(1983))。目前，通過大M^從黃花蒿(sweetwarwood)中提取來製備青蒿素，其衍生物例如蒿甲醚(artemether)、青蒿酉旨(artesunate)、蒿乙醚(arteether)和雙氫青蒿素(dihydroartemisinin)系從純化的提取物中半合成製備的。另夕卜，在高質量材料的生產中也遇到了困難(Haynesetal.O/ir.0/;/"./"/edZ)/s"(14),719-726,(2001))。因此，痴原蟲對大多數藥物的普遍抗性使得需要開發新的藥物(Wiesneretal.Jrt^w.C7^附./"t五A(42),5274-5293，(2003))，其結構應該不同於傳統化合物，其具有新的作用機制以克服抗性問題。最近，Ihara等公開了具有抗痴活性的由合成而來的化合物(US6,710，074(2002))。最近，還報導了不同類型的具有抗痴活性的化合物，例如取代的1，2，4三喁烷(US6,737,438(2002))、類黃酮(WO2004000306(2003))、^^基異會啉(US6，627,641(2003))、丐l咮並奮唑(US6，531,487(2003))、三氧戊環類(trioxolanes)(US6,486，199(2002))、P-啼啉生物鹼(US6,143，756(2000))、vocamine(WO9948501(1999))、乙醯葡萄糖胺衍生物(DE3220426(1983))等。最近i午多專利例如US6，710，074、WO2004000319、US5，264，726、US2003212098、WO2004000306、EP1076057、WO9948501、US5，2卯，553、US6，143，756和US6，627，641公開了具有抗惡性瘧原蟲活性的來自天然來源(主要是植物)的化合物。因此，已證明用於尋找新抗痴藥的民族藥理學方法是更加可預測的。作為正在進行的生物資源研究項目的一部分，我們篩選了來自東北部地區的大量植物以進行抗痴抑制研究。植物的選擇主要基於多個標準，例如化學分類學數據、現場觀察和隨機採集。瘧疾是由瘧原蟲屬(iVfls附W/ww)的原生動物所引起的。因為其流行性、致病性和抗藥性，所以它是人類所遇到的最為嚴重和廣泛傳播的寄生蟲病。廣泛用於治療疾病的藥物供應不充分以及缺乏負擔得起的新藥是抵抗瘧疾中的限制性因素，其增強了對開發新藥的研究的持續需要。因此，需要開發新的活性化合物作為氯喹的替代物，尤其是青蒿素的替代物，所述青蒿素是分離自中國植物黃花蒿的基於植物的抗瘧藥。迫切需要使用新的民族藥理學方法研究天然來源以尋找新的抗痗藥，尤其是來自印度東北部的迄今為止尚未被篩選過的天然來源。另外需要開發從具有抗瘧特性的植物提取物中提取、分離和鑑定生物活性成分的合適方法。最近開發的新的分離和表徵技術以及新藥理學檢測方法的發展已經引起了對作為新藥來源的植物的興趣。但是，需要一種有前景的方法，以使用這些藥劑作為模板以設計具有改進特性的新的衍生物。發明目的本發明的一個主要目的是從天然來源開發新的抗瘧劑，其抑制氯會抗性和氯會敏感性痴原蟲的生長。本發明的另一個目的是研究印度東北部地區印度藥用植物的抗痴特性，以治療痦疾(所述植物的選擇基於化學分類數據)。更具體的一個目的是開發從印度藥用植物中提取、分離和鑑定活性成分的簡單有效的方法。另一個目的是對粗提取物進行抗瘧原蟲生長的體外生物測定。本發明的另一個目的是開發用於常規監測粗提取物的可重複的指紋HPLC方法。本發明的另一個目的是提供適於鑑定、評價和監測體外抗瘧活性的技術。本發明的另一個目的是進行不同粗提取物的溫度穩定性研究，這將有助於生物活性級分的保存。另一個目的是評價多種施用途徑，以及在體內分析中確定它們在體液中的穩定性、毒性和以足夠濃度到達感染組織的能力。
發明內容因此，本發明提供得自白錐花的葉的新的生物活性水級分。本發明還提供用於製備來自白錐花的新的生物活性級分的方法，其包括風乾所述植物的葉，使所述風乾的葉粉末化，以及用水提取所述粉末，過濾所述提取物並在減壓下濃縮至幹以獲得所述生物活性水4^取物。在本發明的一個實施方案中，進行3次水提取。在本發明的另一個實施方案中，通過索氏提取方法(Soxhletextractionmethod)在回流溫度下提取8個小時。在本發明的另一個實施方案中，使用三次蒸餾水進行提取。在本發明的另一個實施方案中，在約461C下使用旋轉蒸發器在約86psi的減壓下將所述過濾後提取物濃縮至幹。在本發明的另一個實施方案中，通過液-液萃取法，根據極性的增加，使用選自己烷、乙醚、氯仿和乙醇的溶劑將所得的水4C取物進一步分級分離，然後將所述4lL取物在約301C的溫度下和約150psi的減壓下濃縮至幹。本發明還提供治療瘧疾的藥用組合物，其包含白錐花的生物活性水提取物和一種或多種可藥用添加劑。在本發明的一個實施方案中，所述可藥用添加劑選自載體、稀釋劑、穩定劑、溶劑、調味劑等。圖1是本發明粗提取物的HPLC鐠。圖2是進一步分級分離後的所^a提取物的總離子色鐠圖。具體實施方式惡性痴原蟲對目前可用藥物(例如氯喹)的日益增加的抗藥性帶來了對痴疾治療的挑戰，所述可用藥物仍然是一種對痗疾的治療，瘧疾仍然是世界上的主要死亡原因之一。因此，迫切需要新的藥劑用於治療所述生物。本發明提供了名為GN-W的生物活性水級分，其得自植物白錐花的葉，具有對氯喹抗性和氯查敏感性瘧原蟲的抑制活性。根據本發明的另一個實施方案，提供了從曬乾/風乾的白錐花的葉中提取、分離和鑑定生物活性化合物的簡單有效的方法。根據本發明的另一個實施方案，還開發了用於常規監測粗提取物的指紋高效液相色譜(HPLC)方法。另夕卜，本發明提供用於體外和體內生物評價粗提取物的合適技術。本發明的另一個實施方案中，還研究了所述粗提取物在體外和體內抗痴生物測定情況下的協同效應。本發明還給出了所述生物活性級分與溶解性和溫度相關的穩定性研究。本發明還描述了在體外生物測定中對多種施用途徑、其在體液中的穩定性、毒性、以足夠濃度到達感染組織的能力的評價。因此，本發明提供了名為GN-W的藥物製劑，其顯示出優異的抗痴活性。儘管參考優選實施方案，已對本發明進行了詳細描述，但是應理解本發明的以上描述可由本領域技術人員進行相當大的修改、變化和改動，這些應視為在本發明的範圍和精神以內。本發明的詳細描述提供了得自植物白錐花的名為GN-W的生物活性水級分，其具有對氯會抗性和氯壹敏感性痴原蟲的抑制活性。下面通過實施例顯示生物活性水級分的製備工藝，其是舉例性的，不作為對本發明範圍的任何限制。所述工藝包括以下步驟歩驟l為了分離和鑑定更有效的具有抗氯喹抗性瘧原蟲活性的天然化合物，我們對從印度藥用植物白錐花的葉製備的^4I:取物進行系統的生物導引的分級分離。在DefenceResearchLaboratory,Texpur的幫助下，在6月和9月從印度東北部的DhemajiAssam採集植物材料(葉)。在陰處將葉乾燥48小時並磨成細粉末。步驟2使用索氏提取方法，在回流溫度(100匸)用500ml三次蒸餾水提取100克的幹葉8小時。分別使用500ml三次蒸鐳水重複提取三次。然後過濾所述提取物，合併在一起，使用旋轉蒸發器在減壓下(86psi和46"C)濃縮至幹。濃縮的級分稱為GN-W(25克)。步驟3根據增加的極性使用不同溶劑如己烷(200ml)、乙醚(200ml)、氯仿(200ml)和乙醇(200ml)，通過液-液萃取將所述水提取物GN-W(25克)進一步分級分離。將各提取物分別合併，並在減壓下(150psi，30*C)濃縮至幹，並命名為GN-E(10克)、GN-C(2克)和GN-ET(6克)。測試所有這些級分對痦原蟲的抑制作用。結果顯示1氯仿級分顯示出最大的抗痴原蟲生物活性。S^/氯仿級分的抑制百分數是86-卯％。可觀察到有趣的特性，即乙醇級分不抑制瘧原蟲的生長。因此，我們猜想所述醚提取物可能含有一些能夠抑制痴原蟲生長的活性成分。因此，針對S^/氯仿級分(GN-E)使用柱色鐠法分離生物活性成分。所製備的提取物和實驗室過程在表1中列出。表ltableseeoriginaldocumentpage8步驟4為了從St/氯仿提取物中純化活性成分，進行了皿柱色鐠法。任何本領域技術人員可操作此技術。將約10g的醚級分加載到皿(100克，200-400目)柱上，然後分析級分對惡性痴原蟲的體外抑制活性。結果表明，使用乙酸乙酯中50-60%的己烷洗脫的柱級分能抑制痴原蟲並因此具有治療痗疾的能力。用於從醚部分洗脫不同成分的溶劑的量如下己烷100-500ml(級分1-8)、在己烷中的10-20%乙酸乙酯25-50ml(l-21it)、在己烷中的40-50%乙酸乙酯25-50ml(l-21it)、在己烷中的50-60%乙酸乙酯25-50ml(1.5-2.5lit)。步驟5還進行了平行提取取50-60克葉，使用己烷(100-200ml)、乙S^/氯仿(100-200ml)、氯仿(100-200ml)和乙醇(100-200ml)在回流溫度下並且也在室溫下提取8-10小時。然後過濾提取物，合併，使用旋轉蒸發器在減壓下(150-200psi,30r)濃縮至幹。比較濃縮級分的HPLC鐠，還進行體外評價。步驟6使用UV檢測器，在WatersHPLC儀器上進行所述提取物中成分的分離。還開發了用於所述粗提取物常規監測的指紋方法。HPLC條件如下150x3.9MM，5MICRONUV檢測器Water's486檢測波長254NM步驟7生物活性醚級分(GN-E)的液相色鐠法和質鐠分析。精確稱量樣品的等分試樣，稀釋到100照/ml的最終分析濃度。但是在某些情況下，必須將未指定量的全部成分重新溶解於1ml合適溶劑(如樣品提交詳細說明中所規定的)中，並進行100:1稀釋以用於分析。LC條件(等度)柱WatersSymmetryC182.1x100mm流動相入=水8=乙腈梯度等度60/40A:B流速400jil/分，4:1分流進樣注入體積20filU.V.檢測器二極體陣列220-300nm(提取254nm)LC4Hf(梯度)柱WatersSymmetryC182.1x100mm流動相入=水+0.1%甲酸8=乙腈+0.1°/。甲酸梯度在15分鐘內5%到95%B，保持到20分鐘，然後在30分鐘重新平衡到5%B流速400nl/分，4:l分流ii才羊注入體積20jil柱NOVAPAKC-18，泵Water'sLC-600流動相乙腈水(60:40)反相等度系統$組1MI/分U.V.檢測器二極體陣列220-300nm(拔^取254nm)離子模式電噴霧+ve採集80-800Da，1鐠/秒，在35微秒時手動推進器(manualpusher)實時準確質量中心模式鎖定噴射(Lockspray):參考質量(磺胺二甲氧嘧啶311.0814Da)解析度6000FWHM採樣錐40V碰撞氣體氬氣碰撞能量MSSurvey=5ev(無碎片)MSMS^Hf離子模式電噴霧+ve採集80-800Da，li脊/秒，在35微秒時手動推進器實時準確質量中心模式鎖定噴射參考質量(磺胺二甲氧嘧啶311.0814Da)解析度6000FWHM採樣錐40V碰撞氣體碰撞能量10eV到40eV(針對單個成分進行優化)步驟8抗痴活性的體外評價將兩林氯喚敏感林和一林分離自Jagadalpur地區患者的惡性瘧原蟲分離林適應並在體外維持。按照以前所述標準培養方法培養所述培養物。瘧原蟲生長在加入了添加10。/。Air清的RPMI1640培養基的O+ve人RBC中。將所述細胞培養在37"C、5%C02氣氛中，24小時後檢查寄生蟲血，更換培養基。當寄生蟲血超過10%感染有寄生蟲的細胞時，向培養物中加入新鮮RBC。通過山梨醇裂解法使所述寄生蟲的生長同步化，將同步化的環狀體期寄生蟲用於測試。體外測試在每孔添加了具有2%環狀期寄生蟲的10fil紅細胞的100fil完全培養基中進行。所有測試以一式兩份在96孔平底組織培養板中進行，將每種測試化合物製成倍比稀釋液，單個對照孔中僅含有RPMI1640和人血清添加物。通過檢測孵育24小時後製成的姬姆薩(giemsa)染色血塗片，監測在各種測試化合物、氯奎存在下以及對照孔中的寄生蟲生長。對200個無性生殖寄生蟲中存在的成熟裂殖體進行計數，通過公式(1-Nt/Ne)x100計算裂殖體成熟抑制平均值，其中Nt和Nc分別代表測試和對照中存在的裂殖體的數目。通過使用商業統計軟體包Sigmastat計算IC50、IC90和IC99值。體外抗痗抑制研究化合物rc鄰IC卯GN-W153.23ng/ml752.29嗎/mlGN-E103.53嗎/ml388.24ng/ml氯喹0.025nM0.046|iM1權利要求1.一種得自白錐花(Gomphostemaniveum)葉的新的生物活性水級分。2.—種用於製備來自白錐花的新的生物活性級分的方法，其包括風乾所述植物的葉，使所述風乾的葉粉末化，以及用tK^取所述粉末，過濾所述提取物並在減壓下濃縮至幹以獲得所述生物活性7j^^取物。3.根據權利要求2的方法，其中進行三次所述水提取。4.根據權利要求2或3的方法，其中所述每次提取通過索氏提取方法在回流溫度下進行8個小時。5.根據權利要求2或3的方法，其中使用三次蒸餾7jC進行每次提取。6.根據權利要求2到5的方法，其中使用旋轉蒸發器在約46TC的溫度下、在約86psi的減壓下將所述過濾後提取物濃縮至幹。7.根據權利要求6的方法，其中根據極性的增加使用選自己烷、乙醚、氯仿和乙醇的溶劑，通過液-液萃取將所得7jC提取物進一步分級分離，然後將所述提取物在約30X:的溫度下和約150psi的減壓下濃縮至幹。8.—種用於治療瘧疾的藥物組合物，其包含白錐花的生物活性^取物和一種或多種可藥用添加劑。9.根據權利要求8的組合物，其中所述可藥用添加劑選自載體、稀釋劑、穩定劑、溶劑、調味劑、粘合劑、潤滑劑等。10.根據權利要求8或9的藥物組合物，其中所述組合物優選通過將其成分*於蜂蜜中而與蜂蜜相混合。11.一種得自白錐花的新的生物活性級分，其基本上如前文所述並參考前述實施例和附圖。12.—種制^^得自白錐花的新的生物活性級分的方法，其基本上如前文所述並參考前述實施例和附圖。13.—種含有得自白錐花的新的生物活性級分的藥物組合物，其基本上如前文所述並參考前述實施例和附圖。全文摘要本發明涉及從印度東北部常見的名為白錐花(Gomphostemaniveum)的草藥的葉中獲得的新的生物活性水級分，其可用於抑制瘧疾寄生蟲惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)的生長。本發明還涉及提取所述生物活性級分的方法。本發明還涉及使用這種生物活性水級分治療瘧疾的方法，以及這種生物活性水級分在治療瘧疾中的用途。文檔編號A61P33/06GK101277711SQ200680036892公開日2008年10月1日申請日期2006年8月30日優先權日2005年10月4日發明者克裡希納穆爾蒂·塞卡爾,德巴·科克,杜賴潘迪恩·他瓦塞爾萬,桑賈伊·庫馬爾,赫曼特·庫馬爾·戈戈伊,馬哈比爾·普拉沙德·考希克,馬尼沙·尼夫薩卡爾申請人:防衛研究與發展組織總幹事