人β-防禦素-2植物高效表達載體的製作方法

2023-07-17 16:06:11 1

專利名稱：人β-防禦素-2植物高效表達載體的製作方法
技術領域：
本發明涉及重組基因工程領域，尤其涉及人卩-防禦素基因重組植物高效表達載體。
背景技術：
防禦素最重要的生物學活性就是其廣譜高效的抗菌和抗病毒活性，並且未發現有耐藥菌 株產生，從進化角度看，動物應用這些分子來對抗微生物感染歷經千百萬年仍顯出強大的效 力，是一類天然有效的抗感染物質。因此，人們把防禦素看作了一個對付細菌耐藥的可能的 突破口對其投入了較大的關注，其中最引人注目的就是p-防禦素。
人P-防禦素-2(Human Beta-Defensin-2, hBD_2)在機體黏膜防禦中具有重要的作用，由 於來自人體本身，作為藥用不易引起過敏反應，因此hBD-2作為新型抗感染藥物資源的潛在開 發價值日益受到重視。但因其在機體細胞內表達甚微，難以通過直接分離純化大量獲得；人工 合成不僅價昂貴且空間結構難以與天然hBD-2完全一致；而且在原核細胞中表達往往會引起宿 主菌"自殺"性死亡， 一般原核生物不適為其生物反應器等原因導致hBD-2規模化生產的研究 進程緩慢。
轉基因植物生物發生器是利用分子生物學技術把重組的目的基因導入植物，並使植物能 夠大量表達重組蛋白的一類生物技術。越來越多證據表明應用轉基因植物或農作物作為生 物反應器規模化生產高附加值的藥用重組蛋白質，其技術可行、成本低廉、效益顯著，具有 廣闊的應用開發前景。本研究擬在前期工作的基礎上，應用植物轉基因技術，構建高效表達 hBD-2的植物生物反應器，以解決在體外規模化生產具有生物活性的hBD-2的新途徑。
目前蔡紹輝等2003年在《四川大學學報》34 (3) : 385 — 389上發表的重組人p-防禦素一 2的植物表達載體的建立是在pCAMBIA1304植物表達載體的基礎上構建，其構建的表達載體中 目的基因連接了六個組氨酸(His)作為報告基因，便於表達產物的檢測和分離，但該報告基
因影響了表達產物人p防禦素-2的一級結構和正確空間結構的形成，而人e防禦素-2必須形
成正確的空間結構才具有抗菌生物功能。
pCAMBIA1300是帶有的花椰菜花病毒(CaMV) 35S RNA啟動子的植物表達載體，可用於農 桿菌介導的轉化或直接轉化，載體中T-DNA左右邊界內帶有多克隆位點和篩選標記Hyg基 因,Hyg基因是植物轉化試驗中廣泛使用的標記基因，編碼潮黴素磷酸轉移酶，適於植物轉化 後用化學試劑潮黴素進行篩選轉化體、多克隆位點處可插入外源基因，在農桿菌介導的轉化中，植物表達載體T-DNA左右邊界內的序列，包括外源基因和篩選標記基因部分，發生轉移並 進入植物細胞內，用篩選試劑潮黴素可有效篩選出整合有外源基因的轉化體。

發明內容
本發明的目的之一是將人P—防禦素一2構建成植物表達載體質粒，再將該載體質粒導入 植物中，旨在植物體中生產空間結構與天然hBD—2完全一致、抗菌活性高的防禦素，然後 從轉基因植物中提取hBD—2，以降低hBD—2的生產成本。
本發明的目的之二是利用人hBD—2基因構建植物表達載體質粒，再將該載體質粒通過 轉化技術導入植物中，使植物具有抗細菌、病毒及(或)真菌的特點，從而培育出作#|、林 木、果蔬以及花卉等植物抗病新品種，為農林果木業生產以及減少農藥汙染作出貢獻。
本發明的技術方案為本發明是人e—防禦素-2植物高效表達質粒載體，含有啟動子、
人P—防禦素-2基因、終止子和兩個篩選基因卡那黴素抗性基因和潮黴素抗性基因，在 pCAMBIA1300植物表達載體的基礎上，用基因重組的方法連接Nos終止子和一個CaMV 35S啟 動子，並將人3 —防禦素-2基因插入CaMV 35S啟動子和Nos終止子之間，得到重組人P — 防禦素-2植物表達載體rp1300-hBD2，該基因表達載體含有兩個CaMV 35S啟動子。
rpl300-hBD2經序列測定連接是正確的。為該重組基因能有效地轉化根癌農桿菌，進而被 導入植物細胞並高效表達奠定了基礎。
本發明的重組人6-防禦素-2植物表達載體rpl300-hBD2含有兩個CaMV35S啟動子，能 高效表達目的基因，即高效地在各種類型的植物細胞中啟動基因的表達；載體中含有卡那黴 素抗性基因，可對轉化的農桿菌陽性克隆進行篩選；含有潮黴素抗性基因，適於植物轉化後 用化學試劑潮黴素進行陽性轉化體篩選。由於不含報告基因可表達具有正確空間結構和生物 活性的人P防禦素-2。
重組人e防禦素-2植物表達載體rp1300-hBD2的具體結構見圖1。 本發明將重組人e防禦素-2植物表達載體rp1300-hBD2轉入菸草後，經PCR、 RT-PCR以及
Northern-Blot檢測證實，人P防禦素-2基因已進入菸草，並在mRNA水平正確表達；經
Western-Blot檢測證實，轉化菸草能夠正確表達人P防禦素-2蛋白；轉化菸草葉的上清液對
金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌都具有較強的抗菌活性，說明轉化菸草不僅能表達人P防禦素-2
而且還具有較強抗菌生物活性，完全可用於具有生物活性的人e防禦素-2的規模化生產和純化，具有廣闊的應用前景。 本發明的有益效果為-
1、 重組人e—防禦素-2植物表達載體rpl300-hBD2含有兩個CaMV35S啟動子，能高效 地在各種類型的植物細胞中啟動基因的表達。
2、 不含報告基因可表達具有正確空間結構和生物活性的人e防禦素-2。
3、 rpl300-hBD2空間結構與天然hBD—2完全一致、抗菌活性高。
4、 由於原核細胞和真核細胞的結構，尤其是膜結構的差異，rpl300-hBD2隻會毒殺微生 物而不會毒殺植物本身。
4、生產成本低，可用於具有生物活性的人e防禦素-2的規模化生產和純化，具有廣闊的
應用前景。


圖1為本發明重組人P —防禦素-2植物表達載體rpl300-hBD2的結構示意圖 圖2為人P -防禦素-2基因的分子克隆策略示意圖 圖3為重組植物表達載體rpl300-hBD-2的構建策略示意圖 圖4為三個宮頸癌患者的新鮮腫瘤組織總RNA電泳檢測結果圖 圖5為RT-PCR產物電泳檢測結果圖
圖6為重組質粒pGEM-T Easy-hBD-2限制性酶切分析結果圖
圖7為人p-防禦素hBD-2 cDNA測序圖
圖8為重組質粒rp1300-hBD-2的限制性酶切分析結果圖
圖9為轉化人e -防禦素2 (hBD2)菸草的PCR產物電泳結果圖
圖10為轉化人P -防禦素2 (hBD2)菸草RT-PCR產物電泳結果圖 圖ll為Northern Blot檢測結果 圖12為Western-Blot檢測轉化植株hBD-2蛋白表達結果 圖13為人P _防禦素2 (hBD2)殺菌活性結果圖 圖14a為Kirby-Bauer紙片擴散法檢測抗金黃色葡萄球菌活性圖14b為Kirby-Bauer紙片擴散法檢測抗銅綠假單胞菌活性
具體實施方式
1.材料
1. 1植物材料
實驗材料選用菸草(NicotianatabacumL.),由蘭州大學細胞生物研究所提供。菸草無菌 苗生長在常規組織培養間，溫度20'C， 16小時光照以及8小時黑暗。轉化苗和對照苗移入土 後置於玻璃室溫，生長條件相同。 1.2質粒
A. pGEM-Teasy克隆質粒購自promega公司。
B. pWEN142質粒由蘭州大學細胞生物研究所提供。
C. pCAMBIA1300質粒由蘭州大學細胞生物研究所提供。 1.3菌株
A. 大腸桿菌DH5a由蘭州大學病理生理研究所提供。
B. LBA4404由蘭州大學細胞生物研究所提供。
C. 金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、綠膿桿菌(ATCC 27853)標準菌株由蘭州大學病理生理 研究所提供。
1.4人體組織宮頸癌患者新鮮腫瘤組織由蘭州大學第一醫院婦產科提供。
2. 方法
2.1人e-防禦素-2基因的分子克隆
克隆策略如下圖示見圖2。 2.1.1組織宮頸癌患者新鮮腫瘤組織由蘭州大學第一醫院婦產科提供。
2. 1. 2設計引物根據GeneBank中hBD2 cDNA核苷酸序列(登錄號NM-004942)設計特異
性引物Pl: 5' —3， TGAAGCTCCCAGCCATCAGCCAT P2: 5' —3， TGGACACCATAGTTTAATTTGG，
產物長311bp。引物由TaKaRa公司合成。
2.1.3宮頸癌組織總RNA提取
取人宮頸新鮮組織80mg，在DEPC處理的PBS緩衝液中衝洗三次，剪碎後分別置勻漿管 中，加入lml TRIZOL試劑(Gibco公司)，在冰浴中勻漿一分鐘，將勻漿液倒入1. 5ml離心 管，室溫放置10分鐘；加0.2ml氯仿，劇烈搖動15秒，室溫放置5分鐘，10400轉/分4'C 離心15分鐘；轉移上清液至另一新的1. 5ml離心管中，加入0. 5ml異丙醇，搖勻，室溫置 IO分鐘，4°C 10400轉/分離心10分鐘；棄上清加lml 75%乙醇，渦旋振蕩片刻，4'C 8000轉/分離心5分鐘；棄上清，乾燥10分鐘，加50^1經DEPC處理的雙蒸水溶解，取3pl在1. 5 %瓊脂糖凝膠上電泳，檢測所提取RNA，其餘貯存於-2(TC備用。
2.1.4 RT-PCR擴增
以所提取人宮頸組織總RNA為模板進行一步法RT-PCR擴增[TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)]。按下列組成配製RT-PCR反應體系
(1) RNase Free distilled H20 一l
(2) 25mMMgcl2 ，
(3) 10xone step RNA PCR Buffer 5^1
(4) 10mMdNTP 5pl
(5) RNase Inhibitor (40units/nl) 1^1
(6) P1、 P2各2^1
(7) AMV RT XL(5units4d) 1 nl
(8) AMV-optimized Taq(5units/pl) ljxl
(9) RNA樣品 2^1 反應液總體積為50jil
按以下條件進行RT-PCR反應5(TC保溫30min，使mRNA逆轉錄為cDNA: 94°C預變性 2min，然後進行30個PCR循環94。C30s、 56。C30s、 68°C45s;最後68。C繼續延伸7minL反 應結束後，每管各取6^1擴增反應液在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測擴增結果。
2.1.5 RT—PCR擴增產物的純化及擴增片段的克隆 2.1. 5.1 RT-PCR擴增產物的純化
重複上述RT-PCR反應過程，獲10(^1擴增產物，用PCR純化試劑盒將擴增產物純化(按 試劑盒操作說明進行)，各得5(^1純化擴增產物,取3pl樣品在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳鑑定 純化效果。
2.1.5.2擴增片段的連接
根據pGEM-T Easy載體系統產品說明書建立如下連接反應10xT4 DNA連接反應緩衝液 lpl， pGEM-T載體lnl (50ng)純化的RT-PCR擴增片段3|xl， T4 DNA連接酶lpl(3U),加雙 蒸水至總體積為l(Hil，於16'C連接2小時。 2.1.5.3製備大腸桿菌感受態細胞
用接種環從平板上挑取大腸桿菌DH5 a單個菌落接種於3ml不含抗生素的LB液體培養基 中，37'C振搖培養過夜，取對數生長期的菌液0.5ml轉種於50ml不含抗生素的LB液體培養 基中，繼續於37'C振搖4小時，然後將培養液轉入50ml離心管中，冰浴10分鐘，於4'C以4000轉/分離心5分鐘，棄培養液，用預冷CaCl2(0. lmol/L)溶液重懸菌體，冰浴20分鐘，於4 。C以4000轉/分離心20分鐘，去上清，加lml冰浴的CaCl2溶液(0. lmol/L)輕輕混勻，分裝 到1.5ml離心管中，冰浴2小時後，放4'C貯存備用。 2.1.5.4 轉化
取200pl DH5a感受態細胞菌液於L5ml離心管中，加入2 連接反應物，輕輕混勻， 冰浴20分鐘，放入42'C水浴中45秒，取出離心管迅速放入冰浴2分鐘，加不含抗生素的SOC 液體培養基800^1， 37'C振搖(150轉/分)l小時，取轉化後的菌液100 pl鋪於LB平板上(含 氨苄青黴素100嗎/ml，表層鋪有40nl 20mg/ml X-gal及4pl 200mg/ml IPTG) 37。C培養過 夜。
2.1.6重組質粒的篩選及鑑定 2.1.6.1 a-互補及顏色篩選
將轉化後37'C過夜培養的平板置於4'C4小時，使藍白色菌落充分顯現，根據質粒載體 pGEM-T Easy LacZ基因a-互補特性，白色菌落可能含陽性重組質粒。 2.1.6.2質粒DNA的提取及初步鑑定
從轉化平板隨機挑取白色菌落，接種於3ml含氨苄青黴素的LB液體培養基中，37'C振搖
14小時，根據質粒提取試劑盒(UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒，上海生工)操作指南提 取質粒DNA，得到50^1質粒DNA，取3^1於1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測質粒DNA。操作步驟 如下
(1) 提取一個白色菌落接種於一個裝有2ml含有Amp的LB液體培養基的試管中，37°C 振蕩培養過夜；
(2) 吸取培養好的菌液1.5ml加入Eppendorf管中，12000rmp離心15s，棄上清；
(3) 加入的Solution I ，用槍頭或振蕩器充分懸浮細菌；
(4) 加入20(M的SolutionII，立即上下顛倒5 10次，使細菌裂解，室溫放置2min;
(5) 加入350W的SolutionIII，立即上下顛倒5 10次，使之充分中和，室溫放置2min;
(6) 12000rmp離心5min;
(7) 將步驟(6)中上清轉移到套放於2. Oml收集管內的UNIQ-10柱中，以10000rmp室 溫離心15s;
(8) 棄收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一收集管中，吸取50(M的Wash Solution 到UNIQ-10柱，訓00rmp室溫離心30s;
(9) 重複步驟(8);
(10) 棄收集管中的廢液，將UNIQ-IO柱放入同一支收集管中，lOOOOrmp室溫離心30s
8以徹底去除Wash Solution;
(11) 將UNIQ-10柱放入新的潔淨1. 5mlEppendorf管中，加入50W的Elution Buffer, 室溫放置2min後，lOOOOrmp室溫離心lmin， Eppendorf管中的溶液即為所抽提的質粒DNA;
(12) 取3pl於1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測質粒DNA。
2.1.6.3重組質粒的酶切鑑定
將所得重組質粒DNA lOpl，加入離心管中，加10x反應緩衝液2nl， EcoRI lnl(10U/nl)， 加純水至2(^1， 37。C水浴3小時，取10pl酶切後的反應混合物於1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢 測酶切效果。
2.1.6.4重組質粒的PCR鑑定
以所提重組質粒DNA為模板，以P,、P2為引物，進行PCR擴增。PCR反應體系如下10xBuffer 2. 5^1， dNTP 2^1 (0.2mM/L), TaqDNA聚合酶2^1 (1U)，重組質粒DNA 1^1，引物各1^1,加 純水至25pl。於PCR擴增儀上進行擴增，反應條件如下94。C預變性5分鐘，然後94。C變 性30秒，56。C復性30秒，72。C延伸45秒，30個循環，72。C繼續延伸7分鐘。取6nl擴增 反應物於1. 5%瓊脂糖凝膠電泳中檢測結果。 2. 1. 6. 5 cDNA序列測定
DNA序列測定由大連TaKaRa生物技術公司應用ABI PRISM 3730 DNA自動測序儀完成。 2. 2重組植物表達載體rpl300-hBD-2的構建
表達載體構建策略見圖3。
由於所得質粒pCAMBIA1300 (圖B)沒有Nos terminaeor序列，需要增加該序列，將質 粒pWEN142 (圖A)用Pst I和EcoR I雙酶切得到Nos terminaeor片段和CaMV 35S啟動子， 同時也用Pst I和EcoR I雙酶切質粒pCAMBIA1300(圖C)，用T4-DNA連接酶將Nos terminaeor 片段和CaMV 35S啟動子插入質粒pCAMBIA1300，得到含有Nos terminaeor的質粒pl300-Nos, 並鑑定重組質粒p1300-Nos (圖D)。
用Xho I和Sac I酶切已測定含有hBD2正確序列的克隆載體pGEM-T-hBD2 (圖F)得到 hBD2基因片段。同時用Xho I和Sac I酶切重組質粒pl300-Nos (圖E)，用T4-DNA連接酶將 hBD2基因片段插入質粒pl300-Nos，得到重組產物p1300-hBD2，鑑定重組產物p1300-hBD2， 命名為rpl300-hBD2 (圖G)。 2.3農桿菌感受態的製備以及重組質粒的轉化
2. 3.1從28'C培養48小時的新鮮平板中挑取LBA4404單菌落，轉到20mlLB液體培養基
(rifl00mg/L)中，於28°C 250rpm振蕩培養過夜。 2. 3. 2冰浴20min，將菌液5ml離心管中，再冰浴10min。2. 3. 3 4000rpm4。C離心10min。
2. 3. 4每管加入1 ml預冷的20mMCaCl2重懸菌體。
2. 3.5 4000rpm4。C離心10min，棄上清。
2. 3. 6每管加入300^1的20mMCaCl2，重懸菌體並分裝於1.5ml離心管中。 2. 3. 7每管加入6^1重組質粒，輕輕混勻，冰浴5min，再放入液氮5min。 2. 3. 8 37'C5min，每管加入400^1 YEB培養基於28。C溫育2小時使得細菌復甦，並表達卡那 黴素抗性基因。
2. 3. 9取200^1轉化的農桿菌均勻塗於含卡那黴素和利福平的YEB固體選擇培養基平板上，
室溫下靜置半小時後，於28'C培養。 2.3.10設負對照，只有感受態細胞沒有外源DNA，抗性平板上不生長，無抗性平板上生長。 2.4菸草的遺傳轉化
2. 4. 1無菌培養的菸草在1/2MS培養基上快繁。
2. 4. 2 YEB+Kan50mg/L+Rifl00mg/L+Stre50mg/L的液體培養基中28。C振蕩培養含有hBD2 表達載體的LBA4404。
2.4.3取新長出的約1-2咖2大小菸草葉子，切成0.4-0.7ci^大小，切除大的葉脈，中間用尖 頭鑷子打孔。
2.4.4將切好的葉片置於用MSO(MS+30g/Lsucrose)稀釋的農桿菌培養物中3-5分鐘，中間振 搖幾次。
2.4.5夾出葉片在無菌濾紙上吸乾多餘菌液，置於MSl(MS+30g/L sucrose+lmg/L 6BA)培養 基上，共培養兩天。
2. 4. 6將共培養兩天後的葉片轉至MS2(MS+30g/L sucrose+lmg/L 6BA+500mg/L CB+15mg/L
Hyg)上，培養20天誘導芽的生長。 2.4.7轉移至MS3(MS+30g/Lsucrose+lmg/L6BA+250mg/LCB+15mg/LHyg)上繼續誘芽，
待芽長至lcm大小，切下幼芽轉移至MS4(MS+30g/L sucrose+250mg/L CB+15mg/L Hyg)
上生根。
2.4.8將轉基因菸草幼苗兩天後轉入土中，繼續生長。 2. 5轉化植株的鑑定 2. 5. 1 PCR鑑定
2. 5.1. 1菸草的DNA提取方法如下
①取材(三株轉化、三株野生)置於液氮中充分研磨，加入lysis buffer 0.6ml， lysis buffer的組成為50mMtris-Cl,pH8.0;42gUrea;10ml 20% Sarkosyl(十二烷基肌氨酸鈉)；10ml 0.5MEDTA。 42。C水浴10min。
② 37。C搖10min，加入酚氯仿異戊醇(100: 100: 1)混勻30sec， 37。C搖10min。
③ 10000Xg離心10min，取上清，每500W上清液中加入50 plNaAc(pH5.0)和600 nl異丙醇。
④ 混勻，離心lmin，棄上清，加入500^170%乙醇。
⑤ 離心30sec，棄上清，加入30nlTE重懸沉澱，儲存於-20。C。
2.5.1.2 PCR鑑定用引物為Pl: 5， 一3， TGAAGCTCCCAGCCATCAGCCATP2: 5， 一3' TGGACACCATAGTTTAATTTGG;按以下條件進行PCR反應94。C預變 性2min，然後進行30個PCR循環，94。C變性30sec， 56。C退火30sec， 72。C延伸45sec， 最後72。C延伸5min。 2. 5. 2轉化植株的mRNA表達檢測 2. 5. 2. 1菸草總RNA的提取
取轉化菸草葉片50mg，在DEPC處理的PBS緩衝液中衝洗三次，剪碎後置勻漿管中，加 入lml TRIZOL試劑，在冰浴中勻槳一分鐘，將勻漿液倒入1. 5ml離心管，室溫放置10分鐘； 加0. 2ml氯仿，劇烈搖動15秒，室溫放置5分鐘，10400轉/分4'C離心15分鐘；轉移上 清液至另一新的1.5ml離心管中，加入0.5ml異丙醇，搖勻，室溫置10分鐘，4'C 10400轉 /分離心10分鐘；棄上清加lml 75%乙醇，渦旋振蕩片刻，4°C 8000轉/分離心5分鐘；棄 上清，乾燥10分鐘，加50 pl經DEPC處理的去離子水溶解，貯存於-20。C備用。 2. 5. 2. 2 RT-PCR擴增
以上述所提取組織總RNA為模板進行一步法RT-PCR擴增。按下列組成配製RT-PCR反應
液
(1 )RNase Free distilled H20 16^1
(2) 25mM Mgcl2 15^1
(3) 10x。ne step RNA PCR Buffer 5pl
(4) 10mM dNTP 5^1
(5) RNase Inhibitor (40units/pl) 1^1
(6) 上遊引物、下遊引物各2nl
(7) AMV RT XL(5units4U) 1^1
(8) AMV陽optimized Taq(5units/pl) 1jj1(9)RNA樣品2^1 反應液總體積為
按以下條件進行RT-PCR反應50'C保溫30min，使mRNA逆轉錄為cDNA: 94°C預變性 2min，然後進行30個PCR循環94。C30s， 68。C45s;最後68。C繼續延伸7min.反應結束後， 每管各取6" 1擴增反應液在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測擴增結果。 2. 5. 2. 3 Northern Blot 2.5.2.3.1甲醛-瓊脂糖凝膠電泳
(1) 用36ml DEPC處理H20溶解0. 75克瓊脂糖，冷卻至60 °C，加5ml 10x MOPS電泳 緩衝液(O. 4mol/L MOPS, pH7. 4， 0. 5mol/L NaAc, 0. 01 mol/L EDTA)和9ml 12. 3mol/L甲醛。
(2) 鋪制凝膠，加入足夠的lx MOPS電泳緩衝液使能淹沒凝膠面lmm左右。
(3) 在3個EP管中各加入5|til 10x MOPS電泳緩衝液，9pl 12. 3M甲醛，25^1甲醯胺； 第一管、第二管分別加入所提取轉化菸草RNAllpl，第三管加入野生株菸草RNAllpl。混勻， 短暫離心，在55'C保溫15分鐘。
(4) 加入10^1甲醛加樣緩衝液[lmmol/L EDTA, p朋.0， 0. 25% (w/v)溴酚藍，0. 25% (w/v) 二甲苯青，50% (v /v)甘油]。
(5) 每孔加樣60pl，在5V/cm電壓下電泳2小時。
(6) 取出凝膠用20xSSC(3 mol/L NaCl, 0.3 mol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)洗兩次，每次 15分鐘。
(7) 取大小合適的尼龍膜，用DEPC處理的水浸泡5分鐘。
(8) 用真空轉移儀轉移RNA:於真空轉移儀上依次放置濾紙、尼龍膜、凝膠，排除氣泡， 加20xSSC，轉移3小時(真空負壓10 cmHg)。
(9) 將膜取出，置12(TC烤箱中烤30分鐘後，4X:保存。 2. 5. 2. 3. 2 cDNA探針標記
(1) 模板cDNA的純化取RT-PCR擴增產物100^1用PCR純化試劑盒將擴增產物純化(按 試劑盒操作說明進行)，各得50^1純化產物，取3pl樣品在1. 5%瓊脂糖凝膠中電泳鑑定純化 效果，並估計cDNA濃度。
(2) cDNA探針標記取純化cDNA 15pl (含DNA約3pg)煮沸變性10分鐘，立即置冰上； 力口入以下試齊U: 2^1 hexanucleotide mix, 2pl d, Mixture, l^il Klenow enzyme;混勻稍 離心，置37。C60分鐘；加2jil 0. 2M EDTA (PH8. 0)終止反應；加2. 5pl 4M LiCl和75pl預 冷乙醇，混勻沉澱標記DNA;置-20 °C2小時；10000轉/分離心15分鐘，棄上清，用50|il預冷乙醇洗滌、乾燥，溶於50pl TE中備用。
2.5.2.3.3預雜交將尼龍膜放入雜交袋，加入5ml雜交液(7%SDS， 50%甲醯胺，5xSSC， 50mM Sodium phosphate, PH7. 0， 0. l%(w/v) N-Lauroylsarcosine, 2 %blocking reagent (試劑盒提供))，置5(TC預雜交4小時。
2.5.2.3.4雜交在3ml雜交液中加入探針25^1，排出雜交袋中氣泡，雜交16小時。 2. 5. 2. 3. 5洗膜檢測取出尼龍膜，置用DEPC處理過的容器中，用洗液I (2xSSC， 0. 1%SDS) 室溫洗滌兩次，每次5分鐘，用洗液II (0. lxSSC，O. 1%SDS) 68。C洗滌兩次，每次15分鐘， 用衝洗緩衝液[馬來酸緩衝液，O. 3% Tween 20(v/v)]洗滌2分鐘；置尼龍膜於100ml Blocking solution [1% (w/v) Blocking試劑溶解於馬來酸緩衝液(0. 1M馬來酸，0. 15MNaCl， pH7. 5)] 中30分鐘；取anti-DIG-AP到Blocking溶液中使其濃度達150mU/ml，將膜放在50ml含抗 體的Blocking溶液中30分鐘；用衝洗緩衝液洗兩次，每次15分鐘；置膜於檢測緩衝液(O. 1M Tris-HC1, 0.1M NaCl, 50mM MgCl2， pH9. 5)中兩分鐘；將膜置於10 ml顯色溶液中(10 ml檢測 緩衝液，200^1 NBT/BCIP)，密封塑膠袋置暗處；充分顯色，取出浸入水中漂洗10分鐘，幹 燥照像。
2.6.轉化植株hBD2蛋白表達檢測 2.6.1植物蛋白樣品製備
(1) 將500mg菸草組織置於2ml勻漿器中球狀部位，用乾淨的剪刀將組織塊儘量剪碎。
(2) 加400nl單去汙劑裂解液(50mmol/LTris 'HClpH8.0， 150mmol/LNaCl， l%TritonX —100， 100pg/mlPMSF)於勻漿器中，進行勻漿，然後置於冰上。
(3) 幾分鐘後再碾一會兒再置於冰上，重複碾幾次使組織儘量碾碎。
(4) 裂解30 min後，用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然後在4'C下12000rpm 離心5min，取上清分裝於0.5ml離心管中並置於一20'C保存。
2. 6. 2 Trjs—Tricine電泳
由於目的蛋白大小只有4.5kDa，用SDS—PAGE電泳得不到很好的分離效果，因此採用 一種修改的緩衝系統的Tris—Tricine方法，可使SDS和多肽得到分離，從而改善分離度。
(1) 檢査電泳裝置，清洗玻璃板。
(2) 灌膠與上樣
① 玻璃板對齊後放入夾中卡緊。然後垂直卡在架子上準備灌膠。
② 按以下方法配Tricine分離膠，加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10ml 槍吸取5ml膠沿玻璃放出，待膠面升到所需高度時即可，然後膠上加一層水。Tricine多肽分離凝膠配方貯液分離膠濃縮膠
30%丙烯醯胺/0.8%亞甲雙丙烯醯9.80ml1.62ml
Tris Cl,pH8.4510.00ml3.10ml
H207.03ml7.78ml
甘油3.17ml—
10% (w/v)過硫酸銨25^1
TEMED10pl5pl
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③ 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上 層水並用吸水紙將水吸乾。
④ 按上面的方法配Tricine濃縮膠，加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。將剩餘空間灌滿濃 縮膠然後將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固後，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕 將其拔出。
⑤ 用水衝洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。
⑥ 取製備好的樣品至0.5ml離心管中，加入2XTricine上樣緩衝液(0.1mol/L Tris， 24% 甘油，8%SDS， 0.2mol/LDTT， 0.02%考馬斯亮藍G-250)，沸水中煮5min使蛋白變性。
⑦ 加足夠的電泳液後上樣。 陽極緩衝液的配製
121.1gTris鹼 500ml H20
用濃鹽酸調校至pH8.9 用H20稀釋至5L ，於4'C保存備用。 陰極緩衝液的配製 12.11gTris鹼 17.92g Tricine lgSDS
用H20稀釋至1L，於4'C保存備用。 (3)電泳
電壓為40V，電泳5h，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。2. 6. 3轉膜
切1張6.0x8.0cm大小的硝酸纖維素膜置於水上浸2 h，另準備6張和分離膠大小相同 的濾紙。安裝轉移電泳槽，並加入轉移緩衝液。待電泳完畢，根據電泳槽使用指南，將濾紙、 分離膠和準備好的硝酸纖維素膜正確放置。在冷卻條件下60V，轉膜2h。轉膜完畢，拆卸轉 膜裝置，取出轉印膜，並在膜上剪一小角作為定位標記，準備免疫檢測。 轉移緩衝液的配製-
甘氨酸(MW75.07) 2.9g
Tris (MW121.14) 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸餾水至 1000ml
溶解後室溫保存 2. 6. 4免疫檢測 . 2. 6. 4. 1免疫反應
(1) 將膜用TBS (100mmol/LTris'HClpH7.5， 150mmol/LNaCl)從下向上浸溼後，移至含 有封閉液(含0.2%酪蛋白的丁丁85緩衝液)的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉lh。
(2) 將一抗用TTBS[含0.1X (v/v) Tween20的TBS緩衝液]稀釋至1: 500;撕下適當大小 的一塊兒保鮮膜鋪於實驗檯面上，四角用水浸溼以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮 膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液後，將膜蛋白面朝下放於抗體液面上，掀動膜 四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育2h後，用TTBS在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min; 再用TBS洗一次，10min。
(3) 同上方法準備二抗稀釋液(1: 5000)並與膜接觸，室溫下孵育2h後，用TTBS在 室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min;再用TBS洗一次，10min，進行化學發光反應。
一抗(羊抗人P-defensin2， sc-10854，為Santa Cruz產品) 二抗(抗羊IgG-HRP， sc-2020，為Santa Cruz產品) 2.6.4.2化學發光，顯影，定影
(1 )將A和B兩種試劑(購自北京中山公司，為Santa Cruz產品)在保鮮膜上等體積混合； lmin後，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；lmin後，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液， 包好，放入X-光片夾中。
(2)在暗室中，將1X顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X—光片，用
15切紙刀剪裁適當大小(比膜的長和寬均需大lcm);打開X-光片夾，把X—光片放在膜的蛋 白面上，關上X-光片夾，開始計時；曝光時間為15min;曝光完成後，打開X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶後，即刻終止顯影。顯影時間為2min(20 25'C);顯影結束後，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間為5 10min，以膠片透明為止； 用自來水衝去殘留的定影液後，室溫下晾乾。 2.6.4.3將膠片掃描照相。 2. 7生物活性檢測 2. 7.1樣品提取
取轉染hBD2和野生新鮮菸草的葉片，在研缽中研磨後，4°C， 5000rpm離心10min，取 上清於4'C保存備用。 2. 7. 2殺菌活性檢測 2. 7. 2. 1瓊脂糖彌散法測定殺菌活性
將細菌(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌)於37。C大豆胰蛋白腖肉湯培養基(TSB)中培養過夜， 取50 nl該菌液接種到50ml新鮮TSB中，37。C培養3h，以獲得中度對數期生長的細菌。將該 菌液於4。C， 900Xg離心10min，然後用預冷的磷酸鹽緩衝液(NAPB)清洗後，再重懸於該 緩衝液中，使細菌濃度達到107個/加1。取該菌液100^1於10ml含10mM NAPB的己滅菌並 42t:溫浴的TSB培養基液中，混勻，使菌濃度為1S個/ml 。倒該培養基於培養皿中(膠厚 為l，25mm)，待凝固後，在培養基上打直徑為3mm的孔，分別加野生菸草上清液、轉化菸草 上清液、兩倍濃縮轉化菸草上清液各50^11於含有金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌培養基的三個孔 中。37'C孵育3h後，倒入頂層培養基(含6。/。TBS， 1%瓊脂糖，消毒並42。C孵育)，待膠凝 固後置37'C培養18小時。測量加樣孔周圍細菌清除環的直徑，清除環的直徑以單位表示 (O.lmm為1個單位)。 2. 7. 2. 2 Kirby-Bauer紙片擴散法檢測抗菌活性
分別取野生菸草上清液、轉化菸草上清液、兩倍濃縮轉化菸草上清液，將滅菌6mm濾紙 片放入上述液體中浸泡12h備用。採用Kirby-Bauer紙片擴散法檢測重組hBD-3的抗菌活性， 操作過程簡述如下將金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)標準菌株 室溫解凍後塗布於LB平板上，37 'C孵育過夜。次日，分別挑取LB平板上的單菌落1個，接 種於LB液體培養基的試管中，37'C振蕩培養10h。然後用PBS洗滌細菌,並使其濃度達到 105/ml ,均勻塗布到LB平板。放置lOmin待平板表面稍幹後放置上述細胞培養上清液浸泡過 的濾紙。37'C過夜孵育，次日觀察和記錄抑菌環大小。3.實驗結果
3.1組織總RNA的提取
提取的三個宮頸癌患者新鮮腫瘤組織(A、 B、 C)總RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測有三個明 顯條帶(28s、 18s和5.8s)，基本無降解，無DNA殘留(圖4)。 3.2 6-防禦素基因的RT-PCR擴增
以提取RNA為模板用設計的特異引物進行RT-PCR擴增，所獲得的RT-PCR產物，經1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳出現約310bp大小的條帶，與預計擴增片段大小相符，表明引物設計合乎 要求，可擴增出相應hBD-2 cDNA片段(圖5)。圖中A: hBD-2、 B: DL-2000 DNA標記。 3. 3重組質粒的篩選及鑑定
PGEM-T Easy與hBD2cDNA的連接產物轉化感受態細胞DH5a後，在氨卞青黴素和IPTG 及X-gal的選擇平板上培養過夜，出現16個白色菌落，挑選白色菌落，於LB液體培養基(含 氨卞青黴素)培養過夜，提取質粒。經限制性內切酶EcoRl酶切圖譜分析證實，含有插入的 目的片段(圖6)。以重組質粒為模板行PCR擴增，結果顯示得到的基因片段與目的片段大小 相符(圖6)。圖中A:pGEM-TEasy-rBD-l的hBD-2 PCR擴增產物、B:EcoRI酶切後的pGEM-T Easy-hBD-2、 C: pGEM-T Easy-hBD-2、 M: DL-2000 DNA標記。 3.4 DNA序列測定
所提質粒送大連TaKaRa公司做DNA序列測定,測序結果顯示，所獲得的克隆重組體中含 有hBD-2cDNA序列，與Genebank中報導的結果完全一致，序列覆蓋hBD-2 cDNA全長，能夠 用於構建植物表達載體(圖7)。 3. 5重組植物表達載體的篩選與鑑定
重組植物表達載體rpl300-hBD-2經限制性內切酶Sac I和xho I酶切圖譜分析證實，含有 插入的目的片段(圖8)。以重組質粒為模板行PCR擴增，結果顯示得到的基因片段與目的片 段大小相符(圖8)。圖中A: rpl300-hBD-2的PCR擴增產物、B: Sac I和xho I酶切後的 rpl300-hBD-2、 C: pl300-hBD-2、 M: PCR標記。 3. 6轉化hBD-2菸草的PCR鑑定
提取3株轉化rpl300-hBD-2菸草的DNA和3株未轉化rpl300-hBD-2菸草的DNA，分別 以這六種DNA為模板，Pl、 P2為引物進行PCR擴增，結果顯示，3株轉化rpl300-hBD-2的煙 草DAN都擴增出大小約310bp的片段，而3株未轉化rpl300-hBD-2的菸草DNA則未見特異條 帶出現。前三株轉rP1300-hBD-2的菸草都含hBD2基因，說明根癌農桿菌己把hBD_2基因導 入菸草細胞(圖9)。圖中A、 C、 E:轉化hBD-2菸草；B、 D、 F:未轉化hBD-2菸草；M:PCR標記。
3.7轉化植株的mRNA表達檢測
提取PCR鑑定陽性的三株菸草總RNA (A、 B、 C)，分別為模板，以Pl、 P2為引物進 行PT-PCR，結果顯示，三個模板都擴增出大小相符的條帶，並且亮度較強(圖IO)。說明三 株轉化了 hBD-2的菸草都能在較高水平進行hBD-2基因的mRNA表達。圖中M為DL—2000 DNA 標記。
3. 8轉化植株的Northern-Blot檢測
將兩株轉化菸草(A、 B)和一株未轉化菸草(C)的總RNA進行Northern-Blot檢測， 結果顯示，兩株轉化的菸草RNA呈陽性，而未轉化菸草RNA為陰性(圖ll)。進一步肯定 了轉化的菸草不僅將hBD-2基因導入細胞，而且都有hBD-2基因在mRNA水平的較強表達。 3.9轉化菸草的hBD-2蛋白表達檢測
將兩株轉化菸草(A、 B)和一株未轉化菸草(C)的蛋白提取物進行Western-Blot檢測， 結果顯示，兩株轉化菸草的蛋白提取物呈陽性反應，而未轉化菸草的蛋白提取物呈陰性，說 明轉化菸草蛋白提取物中含有hBD-2，證實該轉化hBD-2基因的菸草能夠表達表達hBD-2。 因此該hBD-2植物表達系統rpl300-hBD-2的構建是成功的(圖12)。 3.10瓊脂糖彌散法測定hBD-2殺菌活性
將野生菸草上清液(1)、轉化菸草上清液(2)、兩倍濃縮轉化菸草上清液(3)各50pl 分別加入含有金黃色葡萄球菌(A)、綠膿桿菌(B)培養基的三個孔中，18小時培養後，加 入轉化菸草上清液、兩倍濃縮轉化菸草上清液的兩個孔都出現了明顯的殺菌環，而加入野生 菸草上清液的孔則無殺菌環出現(圖13)。經測量在含有金黃色葡萄球菌的平板上加入轉化 菸草上清液的殺菌環為60單位、加入兩倍濃縮轉化菸草上清液的殺菌環為100單位，在含有 綠膿桿菌的平板上加入轉化菸草上清液的殺菌環為70單位、加入兩倍濃縮轉化菸草上清液的 殺菌環為120單位。說明該轉化hBD-2基因的菸草不僅能表達hBD-2，而且表達的產物具有 較強的抗菌活性。
3.11 Kirby-Bauer紙片擴散法檢測抗菌活性
檢測結果顯示轉化hBD-2的菸草上清液對金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、銅綠假單胞菌 (ATCC 27853)均可形成抑菌環，直徑平均值分別為19、 17mm，而未轉化hBD-2的菸草上清液並 無陽性抑菌環形成(〈10mm均認定為陰性)(圖14)。結果顯示該轉化hBD-2基因的菸草不僅 能表達hBD-2，而且表達的產物具有較強的抗菌活性。說明我們構建的該hBD-2生物反應器不 僅能高效表達hBD-2，而且能很好地完成翻譯後的修飾加工，使其表達產物具有天然hBD-2的空間結構，發揮其較強抗菌活性的生物特性。
本試驗結果表明重組hBD-2基因的植物表達載體rp1300-hBD-2已構建成功並誘導根癌農 桿菌LBA 4404遺傳轉化，而且通過根癌農桿菌介導已將此組hBD-2基因的植物表達載體進入 了菸草幼胚愈傷組織。該轉化hBD-2基因的菸草不僅能表達hBD-2，而且表達的產物具有較強 的抗菌活性。說明我們構建的該hBD-2生物反應器不僅能高效表達hBD-2，而且能很好地完成 翻譯後的修飾加工，使其表達產物具有天然hBD-2的特性，並能發揮其較強抗菌作用的生物 活性。這為建立高效穩定hBD-2植物表達系統奠定了基礎，並為進一步解決在體外規模化生產 具有生物活性的人防禦素提供新途徑。
權利要求
1、人β—防禦素-2植物高效表達質粒載體，含有啟動子、人β—防禦素-2基因、終止子和兩個篩選基因卡那黴素抗性基因和潮黴素抗性基因，其特徵在於在pCAMBIA1300植物表達載體的基礎上，用基因重組的方法連接Nos終止子和一個CaMV 35S啟動子，並將人β—防禦素-2基因插入CaMV 35S啟動子和Nos終止子之間，得到重組人β—防禦素-2植物表達載體rp1300-hBD2，該基因表達載體含有兩個CaMV 35S啟動子。
全文摘要
本發明為人β-防禦素-2基因重組植物高效表達載體，涉及基因重組領域，蔡紹輝等在《四川大學學報》上發表重組hBD2植物表達載體含有報告基因，影響hBD2的一級結構和正確空間結構的形成。為此本發明提供了一種人β-防禦素-2基因重組植物高效表達質粒載體，含有啟動子、人β-防禦素-2基因、終止子和篩選標記基因，在pCAMBIA1300植物表達載體的基礎上，用基因重組的方法連接Nos終止子和一個CaMV 35S啟動子，並將人β-防禦素-2基因插入CaMV 35S啟動子和Nos終止子之間，得到重組人β-防禦素-2植物表達載體rp1300-hBD2，該基因表達載體含有兩個CaMV 35S啟動子，兩個篩選基因卡那黴素抗性基因和潮黴素抗性基因。具有空間結構與天然hBD-2完全一致、抗菌活性高的有益效果。
文檔編號C12N15/82GK101469334SQ20071030698
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月29日 優先權日2007年12月29日
發明者令亞琴, 恆 劉, 昕 劉, 勇 張, 濤 景, 娟 李, 青 李, 李培強, 潘興斌, 牟長軍, 虹 王, 王晶宇, 鄭國錩, 陳新年, 彧 雒, 儉 韓 申請人:蘭州大學