3,4-二氯異香豆素在製備抗球蟲病藥物中的用途的製作方法
2023-08-13 05:02:46 2
專利名稱：3,4-二氯異香豆素在製備抗球蟲病藥物中的用途的製作方法
技術領域：
本發明公開了 3，4-二氯異香豆素在製備抗球蟲病藥物中的用途，可以抑制柔嫩艾美耳球蟲對宿主細胞的侵入，用於球蟲病的預防和治療，屬於醫學製藥技術領域。
背景技術：
球蟲病一直是養雞生產中主要控制和治療的疾病之一，尤其是集約化養雞方式的大面積推廣及應用之後，更成為常見多發性疾病，其中以柔嫩艾美耳球蟲最為嚴重。抗球蟲藥物可以說是飼料中必須添加的藥物之一，但是近年來由於抗藥性的問題，及藥物殘留等問題，使得抗球蟲藥物的研究進入了一個瓶頸的階段。頂器門寄生性原蟲生活史複雜，因此對其侵入機制的研究一直困擾著研究者。柔嫩艾美耳球蟲的細胞膜內含有一種絲氨酸蛋白酶，即Rhomboid蛋白，它的酶活性的發揮是蟲體侵入宿主細胞的關鍵。3，4- 二氯異香豆素是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，它是否能夠抑制柔嫩艾美耳球蟲Rhomboid蛋白活性，從而阻礙蟲體侵入宿主細胞並未見有報導。
發明內容
本發明提供了 3，4- 二氯異香豆素在製備抗球蟲病藥物中的用途，為一種新的醫用用途，用於球蟲疾病的預防和治療。本發明的技術方案是這樣實現的
體外分離雞腎細胞，對其進行原代細胞培養。同時將3，4-二氯異香豆素稀釋成不同終濃度的培養液。然後提取柔嫩艾美耳球蟲子孢子，將各濃度溶液平均分成兩部分，一部分在加入細胞培養板前與子孢子作用，然後洗去藥物後接入細胞；另一部分與子孢子一同接入細胞，培養一定時間後，用Hank』 s液洗去藥物，甲醇固定染色，在顯微鏡下計數。觀察不同濃度的3，4- 二氯異香豆素對子孢子的侵入、裂殖體和卵囊形成的影響。以下藥理實驗證明本發明的治療效果
體外進行雞腎細胞的原代培養；然後提取柔嫩艾美耳球蟲子孢子，將3，4- 二氯異香豆素通過DMSO (二甲基亞碸)溶解，配製成100 μ M的溶液，在向細胞培養板中加入3，4-二氯異香豆素時，分別稀釋成終濃度為1 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μ M的培養液。將各濃度溶液平均分成兩部分，一部分在加入細胞培養板前與子孢子作用，然後洗去藥物後接入雞腎細胞；另一部分與子孢子一同接入雞腎細胞。培養一定時間後，在顯微鏡下對子孢子形成的第一代裂殖體、第二代裂殖體以及子代卵囊進行計數，具體的判定標準如下抑制劑對細胞的毒性，以細胞脫落為標準。採用兼顧第一代裂殖體數量、第二代裂殖體數量和卵囊數量的原則，即以第一代裂殖體數量為第一指標，判斷3，4- 二氯異香豆素對子孢子侵入細胞的影響；
以第二代裂殖體數量 為第二指標；判斷3，4- 二氯異香豆素對五tenella的治療效果 (第二代裂殖階段是造成雞隻死亡的主要階段)；
以卵囊數量為第三指標，判斷3，4-二氯異香豆素對病原控制的效果(隨患雞糞便排出的卵囊是健康雞群的傳染源)。第一代裂殖體數子孢子接種後48 h，在100倍倒置顯微鏡下觀察並計算各組的第二代裂殖體數，每組計算20個視野；
第二代裂殖體數子孢子接種後108 h，在100倍倒置顯微鏡下觀察並計算各組的第二代裂殖體數，每組計算20個視野。卵囊形成數子孢子接種後8 d，同樣方法統計子代卵囊數量。1、第一代裂殖體數量
將五tenella子孢子接種於雞腎細胞48h後，通過倒置顯微鏡對第一代裂殖體數量進行統計，如圖1所示，隨著絲氨酸蛋白酶抑制劑3，4- 二氯異香豆素濃度的增加，共培養組的第一代裂殖體數量呈逐漸減少的趨勢，而提前處理的這一組則變化幅度不大，趨勢不明顯。與空白空白對照組相比，共培養組在3，4- 二氯異香豆素濃度20 μ M和30 μ M時差異極顯著(Ρ<0. 01)，40 μ M和50 μ M時差異顯著(Ρ<0. 05)，而前處理組則與空白空白對照組無明顯差異。當3，4- 二氯異香豆素濃度達到40 μ M和50 μ M時細胞出現一定的脫落現象，可見3，4- 二氯異香豆素在40 μ M時抑制了細胞的生長與代謝，從而導致了細胞的死亡。結果表明，20 μ M的3，4-二氯異香豆素濃度可以有效抑制體外球蟲對雞腎細胞的侵入。2、第二代裂殖體數量
子孢子接種雞腎細胞108h後，通過倒置顯微鏡對第二代裂殖體數量進行統計，如圖 2所示，共培養組的第二代裂殖體數量隨著絲氨酸蛋白酶抑制劑3，4- 二氯異香豆素濃度的增加而逐漸減少，而提前處理的這一組無明顯變化。與空白對照組相比，共培養組在 3，4-二氯異香豆素濃度20 μ M時差異顯著(Ρ<0. 05)，30μΜ、40μΜ、5μΜ時差異極顯著 (Ρ<0. 01)，而前處理組則與空白空白對照組數量相似。當細胞培養4天後，3，4-二氯異香豆素濃度在40 μ M和50 μ M時，細胞脫落現象明顯，細胞死亡的數量明顯增多。結果表明，30 μ M的3，4-二氯異香豆素濃度可以明顯控制球蟲的第二代裂殖生殖，對雞球蟲病有一定潛在的治療作用。3、卵囊數量
子孢子接種雞腎細胞8d後，通過倒置顯微鏡對子代卵囊數進行統計，如圖3所示，共培養組的子代卵囊數隨著絲氨酸蛋白酶抑制劑3，4- 二氯異香豆素濃度的增加呈現逐漸減少趨勢，而提前處理的這一組無明顯變化。與空白對照組相比，共培養組在3，4-二氯異香豆素濃度20 μ M時差異顯著(Ρ0. 05)，40 μ Μ、50 μ M時差異極顯著(Ρ<0. 01)，而前處理組則與空白對照組數量無明顯差異。當細胞培養8天後，3，4-二氯異香豆素濃度在40 μ M和50 μ M時，細胞已出現大片脫落現象，可見一定濃度3，4- 二氯異香豆素對於細胞有慢性抑制生長分裂的作用。結果表明，柔嫩艾美耳球 蟲子孢子在體外培養的雞腎細胞中完成了整個的生活史 (如圖4)，20μΜ的3，4-二氯異香豆素濃度就可以有效控制球蟲子代卵囊產出量，對於病原的傳播有潛在控制作用。綜合上述實驗結果，通過3，4- 二氯異香豆素體外對球蟲子孢子侵染細胞的抑制實驗說明20 μ M的3，4- 二氯異香豆素即可有效抑制子孢子體外對雞腎細胞的侵入，同時能夠控制球蟲子代卵囊的產出量，對球蟲病有一定的治療作用，可以成為抗球蟲藥物的主要成分。本發明的 積極效果在於利用3，4- 二氯異香豆素對子孢子侵入細胞的抑制作用， 將3，4-二氯異香豆素應用到寄生蟲病領域，控制球蟲子代卵囊的產出量，製備治療抗球蟲病的藥物，用於球蟲疾病的預防和治療。
圖1、柔嫩艾美耳球蟲第一代裂殖體的數量變化； 圖2、柔嫩艾美耳球蟲第二代裂殖體的數量變化；
圖3、柔嫩艾美耳球蟲子代未孢子化卵囊數量變化； 圖4、柔嫩艾美耳球蟲體外培養的鏡檢觀察圖片；
圖中帶*號者，表示與對照相比差異顯著，帶**表示與對照相比差異極顯著。
具體實施例方式通過以下實施例進一步舉例描述本發明，並不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求範圍之內。實施例1
以3，4- 二氯異香豆素作為有效成分可製成藥物學上的任何藥物劑型，包括顆粒齊U、散劑、片劑；也可以通過二甲基亞碸溶解，配製成100 μ M的溶液，使用時將溶液稀釋成 20 μ M即可。
權利要求
1.3，4-二氯異香豆素在製備抗球蟲病藥物中的用途。
2.權利要求1所述的3，4-二氯異香豆素作為有效成分可製成藥物學上的任何藥物劑型。
全文摘要
本發明公開了3,4-二氯異香豆素在製備抗球蟲病藥物中的用途，利用3,4-二氯異香豆素對子孢子侵入細胞的抑制作用，將3,4-二氯異香豆素應用到寄生蟲病領域，控制球蟲子代卵囊的產出量，製備治療抗球蟲病的藥物，用於球蟲疾病的預防和治療。
文檔編號A61P33/02GK102218057SQ20111010236
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月24日 優先權日2011年4月24日
發明者任文陟, 宮鵬濤, 張國才, 張楠, 張西臣, 李建華, 李淑紅, 李 赫, 楊舉, 鄭君 申請人:吉林大學