一種牛初乳生長因子粗提物及其製備方法和應用的製作方法
2023-08-13 04:27:11 1
一種牛初乳生長因子粗提物及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種牛初乳生長因子粗提物及其製備方法和應用，製備方法包括：(1)將牛初乳通過離心機離心，除去脂肪獲得脫脂牛初乳；(2)酸法沉澱脫脂牛初乳中的酪蛋白，獲得乳清液體；(3)採用陶瓷膜超濾儀進行兩次超濾，除去乳清中殘留的大分子蛋白質，獲得超濾滲透液；(4)利用透析袋透析，脫鹽；(5)冷凍乾燥，即得。本發明超濾分離過程都在室溫附近的溫度下進行，不易使活性蛋白變性，低能耗，無相變；整個過程都是在液體中進行，增強了多肽穩定性，且都是在無機相中進行，無有機相參與，使製備的牛初乳生長因子粗提物更加安全可靠。本發明製得的牛初乳生長因子粗提物含有多種生長因子，且濃度高，可用於製備防治腸炎保健品。
【專利說明】一種牛初乳生長因子粗提物及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種粗提物及其製備方法，特別涉及一種牛初乳生長因子粗提物及其 製備方法和在製備防治腸炎保健品中的應用，屬於生物工程領域。
【背景技術】
[0002] 現代生活節奏的加快，飲食不規律，胃腸病發生率越來越高，日常生活中人們幾乎 都會患有不同程度地發生急性或慢性胃腸病。數據顯示我國有近30%的人患有各種胃炎， 目前全國胃病患者的總人數粗略估計就有近4億人，而且其中40%病情嚴重。胃腸炎發展 會導致細胞損傷、壞死脫落，機械屏障破壞，通透性增加，加上伴隨的腸內菌群失調，細菌與 內毒素移位，腸黏膜及繫膜內免疫組織產生炎性反應，進一步損傷腸黏膜。嚴重的黏膜損傷 不僅有大出血的潛在威脅，而且介導腸源性感染，引發全身性的病理、生理、及內臟功能紊 亂。因此，如何減輕黏膜損傷，促進損傷後再修復，保持腸黏膜結構完整成為當前醫學領域 研宄的一個重要課題。
[0003] 牛初乳是自然界中唯一含有兩類主要生長因子（類胰島素生長因子（IGF-I，II) 和轉化生長因子（TGF-β 1，β 2)的天然產物，而且IGF-I和TGF-β 2也是初乳中含量最高 的兩種生長因子，EGF在分泌初期含量較多。初乳還含有其他生長因子，如血小板生長因子 (TOGF)、上皮生長因子（EGF)、成纖維生長因子（FGF)等。牛初乳生長因子能刺激表皮、上皮 和胚胎細胞的增殖，抑制胃酸分泌，促進傷口癒合和骨吸收，在胚胎發生、組織修復、骨和結 締組織形成中起重要作用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在於提供一種牛初乳生長因子粗提物的製備方法以及由該製備方 法製備得到的牛初乳生長因子粗提物。
[0005] 為了實現本發明的目的，本發明提供了如下技術方案：
[0006] 一種牛初乳生長因子粗提物的製備方法，包括以下步驟：
[0007] (1)將牛初乳通過離心機離心，除去脂肪獲得脫脂牛初乳；
[0008] (2)酸法沉澱脫脂牛初乳中的酪蛋白，獲得乳清液體；
[0009] (3)採用陶瓷膜超濾儀進行兩次超濾，除去乳清中殘留的大分子蛋白質，獲得超濾 滲透液；
[0010] ⑷利用透析袋透析，脫鹽；
[0011] (5)冷凍乾燥，即得牛初乳生長因子粗提物。
[0012] 本發明中，優選的，步驟（1)所述牛初乳為健康母牛分娩後2天內的乳汁；所述離 心的條件為：4°C下，7000r/min離心15min。
[0013] 本發明中，優選的，步驟（2)所述酸法沉澱脫脂牛初乳中的酪蛋白的具體步驟： 10111〇1/1!1(：1調節脫脂牛初乳？!1至2.5，常溫下保存1811後，再用10111〇1/1似0!1調節到？!1 4. 6,之後4°C下，10000r/min離心30min，收集乳清。
[0014] 本發明中，優選的，步驟（3)第一次超濾所用陶瓷膜的截留分子量為300Ku，第二 次超濾所用陶瓷膜的截留分子量為l〇〇Ku，超濾時操作壓力0. 15MPa，流量5L/h，溫度25°C。
[0015] 本發明中，優選的，步驟（4)所述透析袋的截留分子量為3500U ;所述透析的條件 為：在蒸餾水中4°C過夜平衡。
[0016] 超濾（Ultrafiltration)技術是一種膜過濾法，也有錯流過濾（Cross Filtration)之稱。連接並清洗濾膜和系統，蒸餾水排空，清洗3遍循環清洗lOmin，排空後 重新倒入IL蒸餾水。將牛初乳生長因子粗提液按比例用蒸餾水稀釋，準備好原液瓶和超濾 液瓶。關閉膜殼滲透側出口閥（隔膜閥），打開進料泵前的管底閥（全開啟），緩慢打開膜 濾器濃液調節閥（全開啟）、回流閥（半開），確定泵內已充滿料液，關小或關閉回流閥後， 方可開啟進料泵。調整膜濾器濃液調節閥開度，確認進料泵出口壓力在〇. 28- 0. 35MPa之 間。觀察濃液回流管出口的出液情況，穩定流量後，同時觀察膜組件入口壓力值，略關小濃 液回流控制閥，使之符合壓力要求。打開滲透側出液隔膜閥，從出液管觀察濾液出液情況。 緩慢關小濃液回流控制閥，使膜組件入口壓力值緩慢升高到0.28-0. 40MPa之間。調節閥濃 液回流調節閥及滲透側出液隔膜閥，觀察滲透側背壓，使膜操作壓力符合0. 25MPa。超濾方 式為2倍稀釋，超濾到1倍體積，再次稀釋2倍，超濾至1倍體積，共5次。當系統內乳清濃 縮至原體積1/4時應停止超濾，打開排空閥，將濃縮液排出。清洗系統和濾膜，先用0. 3mol/ L NaOH溶液循環清洗3遍至沒有泡沫，換蒸餾水清洗至水通量達到初始值，最後0. 3mol/L NaOH溶液循環清洗2遍，最後一遍鹼液留在系統內，卸下濾膜，4°C保存。
[0017] 進一步的，本發明還提供了由所述的製備方法製備得到的牛初乳生長因子粗提 物，其特徵在於，所述牛初乳生長因子粗提物含有IGF-I 200?250ng/mL，EGF 30?40ng/ mL，TGF-β 21?5ng/mL，濃度分別較初乳升高139?174、89?120、67?342倍。
[0018] 本發明中，優選的，所述牛初乳生長因子粗提物分子量在6-90KU之間
[0019] 本發明通過研宄牛初乳生長因子粗提物對CaC0-2細胞的增殖和迀移作用發現： 本發明牛初乳生長因子粗提物以1 μ g/mL作用體外CaC0-2細胞時，細胞數量在12、24、36h 分別比正常組增加20. 6 %、30. 8 %、40 % ;本發明牛初乳生長因子粗提物以10 μ g/mL作用 體外CaC0-2細胞時，細胞迀移量在36、48h分別比正常組增加44%、217%;本發明牛初乳生 長因子粗提物能顯著促進CaC0-2細胞總蛋白質含量的增加，且隨著濃度的增加，細胞總蛋 白質含量呈現劑量依賴性，且IOngAiL牛初乳生長因子粗提物能顯著增加細胞蛋白含量。 本發明通過研宄牛初乳生長因子粗提物對MTX引起動物腸炎的修復作用發現：本發明牛初 乳生長因子粗提物以32mg/kg/d作用於大鼠時，能降低由氨甲喋呤（MTX)引起的腸道黏膜 損傷。
[0020] 因此，更進一步的，本發明還提供了所述的牛初乳生長因子粗提物在製備防治腸 炎保健品中的應用。
[0021] 本發明中，優選的，所述牛初乳生長因子粗提物通過促進細胞增殖和迀移、增加細 胞蛋白質含量和修復腸黏膜而達到防治腸炎的目的。
[0022] 本發明中，優選的，所述牛初乳生長因子粗提物促進細胞增殖的最低有效濃度為 Ing/mL ;所述牛初乳生長因子粗提物促進細胞迀移的最低有效濃度為Ing/mL ;所述牛初乳 生長因子粗提物增加細胞蛋白質含量的最低有效濃度為lOng/mL ;所述牛初乳生長因子粗 提物修復腸黏膜的最低有效濃度為32mg/kg/d。
[0023] 與現有技術相比，本發明的有益效果體現在：
[0024] 本發明的牛初乳生長因子粗提物含有多種生長因子，本發明檢測了其中三種含量 高，且能夠顯著刺激上皮細胞增殖和分化的生長因子，還有其他含量較低，作用效果強的生 長因子。超濾分離過程都在室溫附近的溫度下進行，不易使活性蛋白變性，低能耗，無相變， 整個過程都是在液體中進行，增強了多肽穩定性，且整個過程都是在無機相中進行，無有機 相參與，使製備的牛初乳生長因子粗提物更加安全可靠。超濾過程的規模和處理能力適應 範圍廣，設備結構緊湊，易於其他分離單元集成，實現自動控制。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 圖1為不同濃度牛初乳生長因子粗提物對CaCO-2細胞迀移的影響圖；
[0026] 圖2為不同濃度生長因子粗提物對細胞迀移的影響圖；
[0027] 圖3為不同濃度生長因子粗提物對CaCO-2總蛋白質含量的影響圖；
[0028] 圖4為大鼠腸道組織學變化圖（HE染色法，X 100);
[0029] 圖5為牛初乳生長因子粗提物對空腸及其黏膜的影響圖（*:P〈0. 05vs對照組； #:P〈0.05vs 模型組）；
[0030] 圖6為牛初乳生長因子粗提物對迴腸及其黏膜的影響（*:P〈0.05vS對照組； #:P〈0.05vs 模型組）；
[0031] 圖7為牛初乳生長因子粗提物對大鼠血漿DAO活性的影響（*:P〈0. 05vs對照組； #:P〈0.05vs 模型組）；
[0032] 圖8為牛初乳生長因子粗提物對大鼠血漿D-乳酸含量的影響（*:P〈0. 05vs對照 組；#:P〈0. 05vs 模型組）。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員 應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0034] 牛初乳：由黑龍江完達山松北牧場提供。
[0035] 主要試劑：10mol/L Na0H，10mol/L HC1，所有試劑均為分析純。
[0036] 主要儀器：Delta320精密pH計：Mettler Toledo公司；DU-800紫外分光光度計： Beckman公司；GL-21M高速冷凍離心機；HIRAYAMA HVE-50形高壓滅菌器；300Ku、IOOKu陶 瓷膜超濾儀：北京華創源泉環境技術有限公司；AE-30型倒置生物顯微鏡：麥克奧迪實業 集團有限公司；Model 680型酶標儀：美國Beckman公司。
[0037] 實施例1
[0038] 將8L牛初乳置於製備型離心機內4°C、7000r/min離心15min，除去脂肪獲得脫脂 牛初乳6L。採用酸法沉澱脫脂牛初乳中的酪蛋白，具體操作方法為：採用lOmol/L HCl調節 脫脂牛初乳口!1至2.5，常溫下保存1811後，再用1〇111〇1/1似0!1調節到？!14.6，之後4°〇下， lOOOOr/min離心30min，收集乳清。分別採用截留分子量為300Ku和IOOKu的陶瓷膜進行 第一次超濾和第二次超濾，除去乳清中殘留的大分子蛋白質，獲得超濾滲透液，超濾時操作 壓力0. 15MPa，流量5L/h，溫度25°C。將所得的超濾滲透液用截留分子量為3500u的透析袋 透析，脫鹽，吸水劑為蒸餾水，4°C過夜。冷凍乾燥，即得牛初乳生長因子粗提物。
[0039] 實施例2牛初乳生長因子粗提物含量的基本測定
[0040] 分別檢測提取過程中各個步驟（包括初乳、脫脂乳、乳清、300Ku、IOOKu)含量較高 的IGF-I、TGF-β 2、EGF以及總蛋白的含量，檢測結果見下表。
[0041] 表1牛初乳超濾過程中蛋白質含量
[0042]
【權利要求】
1. 一種牛初乳生長因子粗提物的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 將牛初乳通過離心機離心，除去脂肪獲得脫脂牛初乳； (2) 酸法沉澱脫脂牛初乳中的酪蛋白，獲得乳清液體； (3) 採用陶瓷膜超濾儀進行兩次超濾，除去乳清中殘留的大分子蛋白質，獲得超濾滲透 液； (4) 利用透析袋透析，脫鹽； (5) 冷凍乾燥，即得牛初乳生長因子粗提物。
2. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟（1)所述牛初乳為健康母牛分娩 後2天內的乳汁；所述離心的條件為：4°C下，7000r/min離心15min。
3. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟（2)所述酸法沉澱脫脂牛初乳 中的酪蛋白的具體步驟：10m〇l/L HC1調節脫脂牛初乳pH至2. 5,常溫下保存18h後，再用 10mol/L NaOH 調節到 pH 4.6,之後 4°C下，10000r/min 離心 30min，收集乳清。
4. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟（3)第一次超濾所用陶瓷膜 的截留分子量為300Ku，第二次超濾所用陶瓷膜的截留分子量為lOOKu，超濾時操作壓力 0. 15MPa，流量 5L/h，溫度 25°C。
5. 根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟（4)所述透析袋的截留分子量為 3500u ;所述透析的條件為：在蒸餾水中4°C過夜平衡。
6. 按照權利要求1-5任一項所述的製備方法製備得到的牛初乳生長因子粗提物，其 特徵在於，所述牛初乳生長因子粗提物含有IGF-I 200?250ng/mL，EGF 30?40ng/mL， TGF-0 2 1?5ng/mL，濃度分別較初乳升高139?174、89?120、67?342倍。
7. 根據權利要求6所述的牛初乳生長因子粗提物，其特徵在於，所述牛初乳生長因子 粗提物分子量在6_90Ku之間。
8. 權利要求6或7所述的牛初乳生長因子粗提物在製備防治腸炎保健品中的應用。
9. 根據權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述牛初乳生長因子粗提物通過促進細 胞增殖和迀移、增加細胞蛋白質含量和修復腸黏膜而達到防治腸炎的目的。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特徵在於，所述牛初乳生長因子粗提物促進細胞 增殖的最低有效濃度為Ing/mL ;所述牛初乳生長因子粗提物促進細胞迀移的最低有效濃 度為Ing/mL ;所述牛初乳生長因子粗提物增加細胞蛋白質含量的最低有效濃度為10ng/ mL ;所述牛初乳生長因子粗提物修復腸黏膜的最低有效濃度為32mg/kg/d。
【文檔編號】A23L1/29GK104434974SQ201410752159
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月9日 優先權日:2014年12月9日
【發明者】楊麗傑, 劉賓, 霍貴成, 曹鳳波, 王曉明, 李媛媛, 周晶 申請人:東北農業大學