用於表達異二聚體糖蛋白激素的表達框、表達載體及製備方法

2023-08-12 18:16:11

專利名稱：用於表達異二聚體糖蛋白激素的表達框、表達載體及製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種用於表達雙亞基異二聚體重組糖蛋白激 素的表達框、表達載體及其製備方法。
背景技術：
利用生物技術表達生產有價值的重組蛋白一直是生物技術領域的熱點問題。而異 二聚體糖蛋白激素的高效表達一直是本領域的難題。糖蛋白激素(Glycoprotein hormones)是指由垂體產生的促甲狀腺素(TSH)、促 黃體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)和由胎盤產生的絨毛膜促性腺激素(CG)，這些激素在 性腺和甲狀腺功能上具有重要作用。這些糖蛋白激素都是由α亞基和β亞基構成的異二聚體。大多數高等脊椎動物 只有一種編碼α亞基的基因，同一種屬的所有糖蛋白激素的α亞基是相同的，而且不同種 屬之間α亞基的胺基酸序列也有很高的同源性。β亞基具有激素特異性，每一種激素的 β亞基是由不同基因編碼。在糖蛋白分子中，亞基的結合對激素的功能是相當重要的，單個 亞基不具有生物活性，實際上在哺乳動物細胞內α亞基和β亞基表達後再形成具有高激 素活性的異二聚體。糖蛋白激素在臨床上得到了廣泛的應用。TSH由垂體前葉促甲狀腺細胞合成並分 泌，其主要功能就是促進甲狀腺濾泡上皮細胞增生、甲狀腺激素合成和釋放的作用，臨床上 主要用於在分化良好型甲狀腺癌的甲狀腺切除治療。FSH、LH均在垂體前葉合成，二者合稱 為促性腺激素(gonadotropin)，臨床上主要用於治療不排卵婦女的不孕症和男性促性腺激 素分泌不足或精小管缺陷。絨毛膜促性腺激素在胎盤內合成，其主要功能就是刺激黃體，有 利於雌激素和黃體酮持續分泌，促進胎盤生長成熟。早期的激素藥物是從動物或人的屍體、體液、尿、內臟中提取的天然激素。由於激 素在體內的含量很低，生化提取耗費很大而且純度不高，所用原料也是易受病毒汙染。DNA 重組技術使激素類藥物的規模生產成為現實。目前，國際上上市的重組糖蛋白激素類藥物 有重組人促卵泡激素(rhFSH)，重組人絨毛膜促性素(rhCG)，重組人促黃體激素(rhLH)，重 組人促卵泡激素(rhFSH)，重組人促甲狀腺素(rhTSH)。目前重組異二聚體激素的生產主要採用如下策略分別將α亞基和β亞基構建 在不同的表達載體上，共轉染哺乳動物細胞，再經大量的篩選獲得工程細胞株，細胞株經培 養和純化得到高純度的重組產品。該方法的缺點是兩個亞基必須構建於不同的載體上，而 且各自帶有不同標誌基因，共同轉染後由於整合位點不同、表達合的丟失或失活，使其兩個亞 基的表達不同步或失衡，造成表達水平低，生產成本高和產品價格高，給患者帶來經濟負擔。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種用於表達異二聚體糖蛋白激素(由α亞基
3和β亞基組成)的表達框。該表達框的結構為在啟動子後可操作的連接有雙亞基重組蛋 白的各個亞基的編碼序列，各個亞基的編碼序列之間用內部核糖體進入位點序列IRES進 行連接。所述可操作的連接，是指將基因編碼序列連接於啟動子後並由啟動子控制其表達。其中上述用於表達雙亞基重組蛋白的表達框所表達的目標蛋白為人糖蛋白激素。其中，上述表達框的結構為啟動子-β亞基-IRES-α亞基模式或啟動子-α亞 基-IRES-β亞基模式。其中，上述表達框中α亞基的核苷酸序列為SEQ ID No. 1所示或為其簡併序列。其中，上述表達框中的β亞基的核苷酸序列為SEQ ID No. 2(hFSH_i3亞基)、SEQ ID No. 3 (hCG- β 亞基)、SEQ ID No. 4 (hLH- β 亞基)或 SEQ ID No. 5 (hTSH- β 亞基)中的 任一項所示或為其簡併序列。其中，上述表達框中的啟動子為CMV啟動子或其它真核表達啟動子。其中，上述表達框中的內部核糖體進入位點序列為SEQ ID No. 6所示或為其變體。本發明的另一個目的是提供一種用於表達雙亞基重組蛋白的的表達載體。該載體 上連接有上述的表達框。其中，上述表達載體為真核表達載體。其中，上述表達載體為質粒表達載體或病毒表達載體。其中，上述表達載體中有DHFR基因、或穀氨醯胺合成酶基因GS或抗生素抗性基因 作為篩選標誌基因。進一步的，上述載體的核苷酸序列為SEQ ID No. 7所示。本發明的第三個目的是提供一種含有上述表達載體的宿主細胞。其中，上述宿主細胞為CH0(中國倉鼠卵巢細胞)細胞系、骨髓瘤細胞系、 HEK293 (human embryonic kidney293)細胞系或和PER. C6 (人胚胎成視網膜細胞)細胞系 中的至少一種。本發明的第四個目的是提供製備上述的表達框的方法。該方法包括以下步驟 從基因庫中獲得人β亞基和α亞基的序列以及IRES基因序列，在基因水平上按β亞 基-IRES-α亞基或α亞基-ΙΚΕδ-β亞基模式進行拼接，並在5端和3端設計與目標載體 連結的內切酶位點，進行全基因合成或用重疊PCR(0verlap PCR)進行並接得到。製備本發明上述表達框還可以採用另外的方法，即從基因庫中獲得β亞基和α 亞基的序列以及IRES基因序列，進行優化和基因合成，用重疊PCR(0verlap PCR)進行並接 即得。以上基因也可從相應的組織、器官和培養物中經RT-PCR擴增獲得。本發明為表達異二聚體糖蛋白激素提供了一種新的有效思路和工具。本發明所述的異二聚體糖蛋白激素主要包括人促卵泡激素hFSH、絨毛膜促性素 hCG、人促黃體激素hLH、人促甲狀腺素hTSH，。本發明是利用IRES序列將糖蛋白激素的 β亞基和α亞基連接形成表達框，實現亞基的同步和高效表達，其表達框結構模式為 啟動子-B亞基-IRES-A亞基模式或啟動子-A亞基-IRES-B亞基模式和啟動子- β亞 基-IRES-α亞基模式或啟動子-α亞基-IRES-β亞基模式。本發明還提供了含有這些表 達框的真核表達載體，以及該真核表達載體轉染哺乳動物細胞、篩選和建立的穩定的基因工程細胞株的方法。本發明還提供了一種工程細胞株的無血清培養技術，從而避免在最終 產品中動物源性蛋白和病毒的汙染。本發明的有益效果在於利用內部核糖體進入位點序列(IRES)將糖蛋白激素不 同的亞基在基因水平連接使其緊密連鎖，構建於同一表達載體並受同一啟動子控制。轉染 哺乳動物細胞後，表達框的完整性得到較高的保持，從而提高陽性克隆的比例和篩選效率。 另由於兩個亞基整合於染色體的同一位點，從而實現在同一宿主細胞內β亞基和α亞基 的同步和高效表達，使其更經濟和更有效。本發明的另一優點是在同一表達載體中構建有 DHFR表達框，能在篩選壓力下實現高表達。同時，採用無血清培養，避免動物源性蛋白質和 外源病毒對產品的汙染，使產品更具安全性。總的說來，本發明表達載體尤為適合糖蛋白激 素的表達，為本領域提供了一種新的有效選擇，解決困擾本領域的難以有效提高糖蛋白激 素生產量的難題


圖1為人FSH表達框示意圖。圖2為人FSH全基因拼接示意圖，S分別為人FSHβ亞基和α亞基的信號肽.圖3是FSH全基因PCR拼接的電泳結果，第一道為DNA分子標準。圖4是表達載體經酶切鑑定結果，第一道為DNA分子標準，第二道為質粒，第三道 是經BamHl和Xhol進行雙酶切釋放的片段。圖5是構建的表達載體的結構圖，命名為pFSHi3 / α。圖6重組人FSH工程細胞在搖瓶中的生長曲線(每ml培養基)，時間為天。圖7重組人FSH在搖瓶中的表達曲線，時間為天。圖8重組人FSH純化產品電泳圖，非還原。
具體實施方案以下結合附圖對本發明進行詳細說明，本發明並不限於下述實例。本發明下面以腦心肌炎病毒的IRES (EMCV-IRES)連接FSH β亞基和α亞基生產 重組人FSH的生產方法為例對本發明進行詳細的說明。實例一人FSH全基因表達載體的製備從基因庫中獲得人FSH β亞基和α亞基的序列以及IRES基因序列，在基因水平 上按β亞基——IRES——α亞基或α亞基一IRES——β亞基模式進行拼接，並在5端 和3端分別設計BamHl和Xhol內切酶位點，進行優化和全基因合成。或者進行PCR拼接從基因庫中獲得人FSH β亞基和α亞基的序列以及IRES 基因序列，分別進行基因合成，並用下列引物用重疊PCR進行並接(見圖2)。具體的，先以 IRES為模板，用引物Pl和Ρ2進行PCR反應，反應體積為50ul，反應條件為94°C變性3min， 再94°C變性30sec，55°C復性30sec，72°C延伸45sec，共30個循環，最後72°C延伸5min。 凝膠電泳並回收DNA片段。再將回收片段按一定量與β亞基和α亞基片段混合進行PCR 反應，反應體積為50 ul，反應條件為94°C變性3min，再94°C變性30seC，55°C復性30sec， 72°C延伸45sec，共10個循環。再補加引物P3和P4後繼續進行PCR反應，反應條件為94°C 變性3min，再94°C變性30sec，55°C復性30sec，72°C延伸45sec，共30個循環，最後72°C延伸5min。凝膠電泳回收DNA片段，並克隆於TA克隆載體，進行酶解分析(見圖3)和測序分 析。PCR拼接所使用的引物為Pl(SEQ ID No. 8) :5，TGAAATGAAA GAATAAGCGG CCGCCC 3，；P2(SEQ ID No. 9) :5，TTCTGTAGTA ATCCATGGTT GTGGCA 3』 ；P3(SEQ ID No. 10) :5，TGGATCCAGGATGAAGACACTCCAGT 3，；P4(SEQ ID No. 11) :5，GGCTCGAGTT AAGATTTGTG AT 3，；帶下劃線的鹼基分別為BamHl和Xhol酶切位點。實例二真核表達載體的構建將實例1得到的FSH全基因用BamHl和Xhol進行雙酶切，凝膠電泳分離，試劑盒 回收。將回收的基因片段與真核表達載體PcDNA5/dhfr(PcDNA5/dhfr是用INVITROGEN的 pcDAN5/frt/to質粒構建的，用二氫葉酸還原酶基因取代原質粒中的潮黴素抗性基因)連 接。轉化大腸桿菌DH-5a感受態細胞，挑選陽性菌落。過夜培養，提取質粒後進行雙酶切分 析和DNA測序鑑定。結果表明，插入片段序列與FSH-α和FSH-β的基因序列一致(SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2)，電泳圖見圖4，將構建得到的表達載體命名為pFHS β / α (序列為SEQ ID No. 7)，其結構示意圖見圖5。實例三真核細胞的轉染使用兩種方法進行真核細胞的轉染。1、電轉染法DHFR( 二氫葉酸還原酶)陰性CHO細胞經無血清懸浮培養至對數 生長期，無血清培養基為HYQ-SFM4CH0培養基(HyClone公產品)，離心收集細胞，配製成 200ul含2 X IO6細胞的細胞懸液，加入電轉杯中，再加入上述實例2構建的表達質粒2ug，輕 搖混勻，電壓220V，電擊一次(BTX公司產品，型號ECM630)，靜止10分鐘。將細胞轉入T75 方瓶，補足新鮮無血清培養基(含HT，Sigma)，於37°C靜置培養48h。2、脂質體轉染法DHFR陰性CHO細胞提前一天以無抗生素培養基HYQSFM4CH0_5% FBS-HT培養於6孔細胞板，2ml/Well，待細胞生長至90%。取上述實例2構建的表達質 粒0. 5ug和真核細胞脂質體轉染試劑2ul (Lipofectamine2000, Invitrogen)於IOOul上 述無抗生素培養基中輕輕混勻，靜置5分鐘，再將上述表達質粒和脂質體轉染試劑混合物 加於細胞孔中，前後左右輕輕搖勻，於37°C靜置培養6h。6h後更換新鮮培養基，培養基為 HyClone 無血清培養基(SFM4CH0)力卩2% FBS和HT，37°C繼續培養24h。實例四工程細胞株的篩選和建立收集上述實例三的轉染細胞，離心後重懸於新鮮的無血清培養基中(不含HT)，將 細胞分散種於10塊96孔細胞培養板中，每孔200ul。於CO2培養箱內培養，根據細胞生長 情況大約每3-4天定時更換新鮮培養液，直至克隆出現。然後用ELISA法檢測上清中FSH 的含量。本發明培養上清中重組FSH含量測定使用Microwell公司的FSH EIA試劑盒，用 其標準方法進行。該試劑盒採用雙抗體夾心法測定FSH活性。FSH由α亞基和β亞基組 成。試劑盒中將抗-α亞基的單抗包被於微孔板上，製備成固相抗體，用辣根過氧化物酶標 記抗-β亞基的單抗檢測。在分別標明標號的反應微孔中依次加入50 μ 1標準品，質控 血清，待測樣品。每空加入100μ 1酶結合物，輕輕振蕩微孔支架，充分混勻，在37°C水浴箱
6或溫箱中溫育30分鐘。將各孔液體棄盡，用洗液衝洗5次，每次衝洗後將水分棄盡，最後一 次衝洗後在乾淨的吸水紙上扣盡參與水分，切勿擦拭反應微孔內壁。每孔加50 μ 1顯色液 Α，再加50 μ 1顯色液B，充分混勻，在室溫(20-28°C )下避光反應15分鐘。顯色反應15分 鍾後，每空加50μ 1終止液，並混勻。30分鐘內，用酶標儀在450nm波長讀記吸光度。根據 標準品所測值計算樣品的活性單位。經電轉染後，960孔中共出現279個細胞克隆，經ELISA法檢測共有225孔出現陽 性信號，克隆陽轉率為80. 65%。在這225孔陽性信號孔克隆細胞中，根據檢測值高低及克 隆細胞情況，挑出46孔克隆於細胞瓶繼續篩選。經培養、MTX加壓和克隆篩選最後確定一 株細胞生長好表達高的細胞株(標號16E12D5)為候選工程細胞株，並進行了產物的表達分 析，見表1。表1 工程細胞株篩選和建立情況
權利要求
1.用於表達異二聚體糖蛋白激素的表達框，其特徵在於其結構為在啟動子後可操作的 連接有雙亞基糖蛋白激素的α亞基和β亞基的編碼序列，各個亞基的編碼序列之間用內 部核糖體進入位點序列IRES進行連接。
2.根據權利要求1所述的用於表達異二聚體糖蛋白激素的表達框，其特徵在於所述 的α亞基的核苷酸序列為SEQ ID No. 1所示或為其簡併序列。
3.根據權利要求2所述的用於表達異二聚體糖蛋白激素的表達框，其特徵在於所述 的β亞基的核苷酸序列為SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 5中的 任一項所示或為其簡併序列。
4.根據權利要求1所述的用於表達異二聚體糖蛋白激素的表達框，其特徵在於所述 的啟動子為巨細胞病毒啟動子。
5.根據權利要求1所述的用於表達異二聚體糖蛋白激素的表達框，其特徵在於所述 的內部核糖體進入位點序列為SEQ ID No. 6所示。
6.一種用於表達異二聚體糖蛋白激素的的表達載體，其特徵在於所述載體上具有權 利要求1 6任一項所述的表達框。
7.根據權利要求6所述表達載體，其特徵在於所述載體為pcDNA5。
8.根據權利要求7所述表達載體，其特徵在於該載體的核苷酸序列為SEQID No. 7所示。
9.含有權利要求6或7或8所述的表達載體的宿主細胞。
10.製備權利要求1 5任一項所述的表達異二聚體糖蛋白激素的表達框的方法，其 特徵在於包括以下步驟從基因庫中獲得人β亞基和α亞基的序列以及IRES基因序列， 在基因水平上按β亞基-IRES-α亞基或α亞基-IRES-β亞基模式對人糖蛋白激素的β 亞基和α亞基的序列以及IRES基因序列進行拼接，並在5端和3端設計與目標載體結合 的內切酶位點，進行PCR方法並接得到或全基因合成得到。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種用於表達異二聚體糖蛋白激素的表達框、表達載體及其製備方法。本發明要解決的技術問題是為高效表達異二聚體重組蛋白提供新的選擇。本發明解決技術問題的技術方案是提供一種用於表達雙亞基重組蛋白的表達框，其結構為在啟動子後可操作的連接有雙亞基重組蛋白的各個亞基的編碼序列，各個亞基的編碼序列之間用內部核糖體進入位點序列IRES進行連接。本發明表達框能實現在同一宿主細胞內各亞基的同步和高效表達，使其更經濟和更有效。
文檔編號C12N15/63GK102002495SQ20101026673
公開日2011年4月6日 申請日期2010年8月30日 優先權日2009年8月31日
發明者何太平, 宋春雷, 楊波, 糖箐燕, 聶豔桃, 葛永紅, 譚曉晶, 雷韜 申請人:成都蓉生藥業有限責任公司