基於異丁醇的安莎黴素p-3生產優化方法
2023-08-12 18:11:36 1
專利名稱：基於異丁醇的安莎黴素p-3生產優化方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物工程與技術領域的方法，具體是一種基於異丁醇的安莎 黴素P-3生產優化方法。
背景技術：
Ansamitocin是珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)來源的美登素 衍生物，其母核為19-C的大環內醯胺環，C-3連接不同長度的碳鏈，主要活性成份安莎黴素 P-3(AP-3)的側鏈為異丁醯基，在低濃度下可抑制非白血性白血病細胞系及人類固體腫瘤。 由於腸胃副效應及神經毒性，其研究還停留在臨床二階段。然而，由於Ansamitocin可在臨 床一期中作為抗體毒素結合物及免疫結合物，各方面的研究仍在進行中，並且其在2009年 被世界衛生組織列為非常重要的抗菌藥物。次級代謝產物的產量受不同環境條件影響，如培養基中組成、氧供應及發酵溫度 等。而優化培養基的組成是傳統也是重要的一步用於提高代謝物產量。目前，已報導的野 生型珍貴橙色束絲放線菌產Ansamitocin主要為液體發酵，儘管有報導利用培養基優化的 方法及高表達調節基因的方法提高AP-3產量，但得到的產率仍只在50mg/L[6，7]左右；因 此，利用各種方法提高AP-3產率是其應用的一個關鍵步驟。異丁醇是一種重要的化工原 料，同時也有報導其可作為能源燃料，在發酵生物質產乙醇的過程中作為副產物積累；由於 異丁醇是一種分支醇，可作為分支鏈脂肪酸的前體，這就為其在需要以分支鏈脂肪酸為底 物的生物培養過程的利用提供可能；然而，對於醇(特別是異丁醇)作為生物培養過程中的 添加劑或營養因子是鮮有報導的。本發明的目標產物AP-3屬於大環內酯類抗生素，其合成 需要一系列來源於脂肪酸的CoA，這使利用異丁醇添加提高AP-3產量成為可能。經過對現有技術的檢索發現，K.Hatano, E. Higashide, S. Akiyama, and Μ.Yoneda(1984)在 Selective accumulation of Ansamitocin P_2, P_3and P_4, and biosynthetic origins of their acylmoieties (P_2，P_3 及 P_4 的選擇性積累及其醯基 基團來源)(Agric. Biol. Chem. 48(7) :1721_1729) 一文中記載了纈氨酸也可以作為AP-3的 前體以提高其產量[6，8]，但由於纈氨酸在使用前需要過濾除菌，但其在水中的溶解度低， 為添加操作帶來極大的不便，且提高AP-3產量的幅度(僅為20% -60% )遠不如異丁醇 (200% -400% )，故在AP-3發酵過程中，我們提出添加異丁醇提高目標產物產率的方法。
發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種基於異丁醇的安莎黴素P-3生產 優化方法，即通過在野生型珍貴橙色束絲放線菌比較添加與不添加異丁醇的AP-3產量，獲 得一個有效提高AP-3產量的方法，此方法有助於提高AP-3產率，並減少副產物的生成，可 為簡化後續的分離純化工作作奠定基礎。本發明是通過以下技術方案實現的，包括如下步驟第一步、配製種子培養基，採用甘油保存的珍貴橙色束絲放線菌接種於種子培養基並進行培養操作，獲得一級種子，並經二次培養後獲得二級種子；所述的野生型珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum subsp. auranticum)保藏於 The Global Bioresource Center ATCC (國際生物資源中心 ATCC，保 藏號31565)，可通過以下方式獲得http //www, atcc. orR/ATCCAdvancedCataloRSearch/ProductDetails/ tabid/452/Default. aspx ？ ATCCNum = 31565&Template = bacteria ；所述的種子培養基的組分及質量百分比含量為酵母提取物質1%、牛肉浸膏 1%、葡萄糖0. 5%、甘油和氯化鈉0. 3%以及96. 2%的雙蒸水，其PH為7. 4。所述的甘油管種子保存於-70°c冰箱，保存濃度為108CFU/ml，按1.6%接種率接種 於種子培養基中，接種量為1.6%。所述的培養操作是指在28°C環境下以220rpm轉速培養2天。所述的二次培養是指取一級種子按1. 6%接種率接種於種子培養基中進行培養 操作。第二步、配製發酵培養基，取二級種子接種於發酵培養基，添加異丁醇並進行搖瓶 培養；所述的配製發酵培養基是指依次配置組分及質量百分比含量如下酵母提取物 質1 %、玉米煮沸濾液2 %、葡萄糖0. 5%、甘油4%、碳酸鈣0. 5%、磷酸氫二鉀0. 05%及七 水合硫酸亞鐵0. 0002%，餘量為雙蒸水，配置得到的發酵培養基的pH為7. 4。所述的搖瓶培養是指將二級種子按1. 6%接種率接種於發酵培養基中，在28°C 環境下以220rpm培養4_6天。所述的添加異丁醇是指直接在搖瓶培養過程的0-48小時時間段內滴加質量百 分比濃度大於99%的異丁醇，直至發酵培養基中的異丁醇濃度達到72毫摩爾/升。第三步、培養結束的發酵液經離心後，分離出上清液，用等體積的乙酸乙酯提取3 次，合併提取液，旋轉蒸乾後，再用甲醇溶解並過濾備用，最後採用高相液相色譜分析所得 安莎黴素的純度。經上述方法優化發酵得到的AP-3產量提高200%以上，並大大減少副產物AP-2的 積累。本發明操作簡單，易於實施，便於大規模生產。
圖1為實施例中野生型珍貴橙色束絲放線菌在添加不同濃度異丁醇條件下的 AP-3產量。圖2為實施例中野生型珍貴橙色束絲放線菌在不同培養時間添加異丁醇條件下 的AP-3產量。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施 例。所使用的微生物珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)。液體發酵之前，菌體先接兩級種子(60ml/250ml，220rpm, 28°C各2天)，再以1. 6%的接種量 接種發酵培養基，在培養初始或培養過程中添加不同濃度的異丁醇，培養結束後，再用等體 積的乙酸乙酯萃取Ansamitocin，蒸乾後溶於甲醇，過濾後低溫保存或直接HPLC檢測。實施例1採用的菌種珍貴橙色束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)；種子及發酵培養種子培養基成份為酵母提取物質1%、牛肉浸膏1%、葡萄糖 0. 5 %，甘油1 %和氯化鈉0.3%。發酵培養基成份為酵母提取物質1 %、玉米煮沸濾液1 %、 葡萄糖0. 5 %，甘油4 %，碳酸鈣0. 5 %，磷酸氫二鉀0. 05 %及七水合硫酸亞鐵0. 0002 %。 250-ml搖瓶裝液量60ml。低溫保存的甘油管種子1ml，於28°C，220rpm培養2天，按1. 6% 的接種量轉接二級種子，28°C，培養2天，再以1. 6%的接種量轉接發酵培養基，並添加不同 濃度的異丁醇(7. 2、18、36和72mM，對應為40、100、200、400微升)，以不添加為對照，每個 條件設三個生物學重複，培養4-6天。樣品處理及檢測方法液體培養結束後，發酵液離心取上清用等體積的乙酸乙酯 萃取3次，合併3次乙酸乙酯萃取液。上述乙酸乙酯液於50°C旋轉蒸發後，加入Iml的甲醇 溶解，用0. 22 μ m有機膜過濾後於高相液相色譜(HPLC)檢測AP-3和AP-2含量；所使用的 HPLC柱為C18反向柱，柱溫28°C，流動相為85%甲醇和15%水，流速0. 6ml/min。結果表明，添加異丁醇濃度為36mM能有效地提高AP-3產量。實施例2採用的菌種如實施例1;種子及發酵培養如實施例1，不同的是在培養的初始(即第0小時)、第12小時、 第24小時、第36小時及第48小時添加36mM的異丁醇，以不添加為對照，每個條件設三個 生物學重複，培養4-6天。樣品處理及檢測方法如實施例1。結果表明，在培養初始，即第0小時，添加終濃度為36mM的異丁醇能使AP_3產量 達 93. 8mg/L。
權利要求
一種基於異丁醇的安莎黴素P 3生產優化方法，其特徵在於，包括如下步驟第一步、配製種子培養基，採用甘油保存的珍貴橙色束絲放線菌接種於種子培養基並進行培養操作，獲得一級種子，並經二次培養後獲得二級種子；第二步、配製發酵培養基，取二級種子接種於發酵培養基，添加異丁醇並進行搖瓶培養；第三步、培養結束的發酵液經離心後，分離出上清液，用等體積的乙酸乙酯提取3次，合併提取液，旋轉蒸乾後，再用甲醇溶解並過濾備用，最後採用高相液相色譜分析所得安莎黴素的純度。
2.根據權利要求1所述的基於異丁醇的安莎黴素P-3生產優化方法，其特徵是，所述的 種子培養基的組分及質量百分比含量為酵母提取物質1%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、 甘油和氯化鈉0. 3%以及96. 2%的雙蒸水，其pH為7. 4。
3.根據權利要求1所述的基於異丁醇的安莎黴素P-3生產優化方法，其特徵是，所述 的甘油管種子保存於-70°C冰箱，保存濃度為108CFU/ml，按1.6%接種率接種於種子培養基 中，接種量為1.6%。
4.根據權利要求1所述的基於異丁醇的安莎黴素P-3生產優化方法，其特徵是，第一步 中所述的培養操作是指在28°C環境下以220rpm轉速培養2天。
5.根據權利要求1所述的基於異丁醇的安莎黴素P-3生產優化方法，其特徵是，第一步 中所述的二次培養是指取一級種子按1. 6%接種率接種於種子培養基中進行培養操作。
6.根據權利要求1所述的基於異丁醇的安莎黴素P-3生產優化方法，其特徵是，所述 的配製發酵培養基是指依次配置組分及質量百分比含量如下酵母提取物質1%、玉米煮 沸濾液2%、葡萄糖0. 5%、甘油4%、碳酸鈣0. 5 %、磷酸氫二鉀0. 05%及七水合硫酸亞鐵 0. 0002%，餘量為雙蒸水，配置得到的發酵培養基的pH為7. 4。
7.根據權利要求1所述的基於異丁醇的安莎黴素P-3生產優化方法，其特徵是，第二步 中所述的搖瓶培養是指將二級種子按1. 6%接種率接種於發酵培養基中，在28°C環境下 以220rpm培養4-6天。
8.根據權利要求1所述的基於異丁醇的安莎黴素P-3生產優化方法，其特徵是，所述 的添加異丁醇是指直接在搖瓶培養過程的0-48小時時間段內滴加質量百分比濃度大於 99%的異丁醇，直至發酵培養基中的異丁醇濃度達到72毫摩爾/升。
全文摘要
一種生物工程技術領域的基於異丁醇的安莎黴素P-3生產優化方法，通過在野生型珍貴橙色束絲放線菌比較添加與不添加異丁醇的AP-3產量，獲得一個有效提高AP-3產量的方法，此方法有助於提高AP-3產率，並減少副產物的生成，可為簡化後續的分離純化工作作奠定基礎。
文檔編號C12R1/01GK101914587SQ20101026691
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月30日 優先權日2010年8月30日
發明者林錦霞, 鍾建江 申請人:上海交通大學