三聚氰胺快速檢測試劑盒及其應用的製作方法
2023-08-12 18:19:26
專利名稱：三聚氰胺快速檢測試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種化學成分檢測試劑盒及其應用，特別涉及一種用於配合飼料、動 物性蛋白質飼料、植物性蛋白質飼料及肉食品中的三聚氰胺快速檢測試劑盒及其應用。
背景技術：
三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，簡稱三胺，又叫2，4，6_三氨基-1， 3，5-三嗪、1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰醯胺、氰脲三醯胺。三 聚氰胺由於具有多個氨基，因此其PKb值為8. 0。三聚氰胺常用於製造三聚氰胺樹脂，是建築 業中常用的防火材料，本來與食品、飼料行業毫不相干，但是發生在美國的數起飼料致死寵 物的事件和近期國內嬰兒奶粉受三聚氰胺汙染導致嬰兒腎結石事件，使兩者聯繫在一起。 經過調查，發現這些進口飼料中含有一定濃度的三聚氰胺，對此，美國食品藥品監督管理局 (FDA)關注在使用添加三聚氰胺及其類似物飼料餵養的寵物的食用安全，要求飼料廠商提 供三聚氰胺的檢測報告，因此，三聚氰胺事件也使得分析領域掀起了檢測方法的開發熱潮。2008年10月7日，國家標準委員會規定了高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用 法、液相色譜_質譜/質譜法三種方法為三聚氰胺的標準檢測方法，但是這三種方法不但需 要大型的精密儀器、熟練的操作人員，耗時也較長。傳統的色譜檢測方法檢測三聚氰胺，其 分析結果容易得到「假陽性」結果；而利用質譜方法進行三聚氰胺檢測，則更容易出現「假陰 性」結果。ELISA試劑盒是一種經典的免疫學測定方法，廣泛應用於臨床診斷、食品安全(如 瘦肉精)、農藥殘留等方面的檢測，作為一種準確的定量檢測方法得到美國FDA認可。與色 譜、質譜精確定量檢測法相比，ELISA檢測方法因其檢出精度相對較低，只能用於疑似含有 三聚氰胺的樣品檢測。因此，基於當前形勢的迫切需要，亟需提供一種方便、快捷且敏感度高的檢測方 法，即研製並開發一種快速檢測配合飼料、動物性蛋白質飼料、植物性蛋白質飼料及肉食品 中三聚氰胺殘留的試劑盒及其應用，造福於人類，將是該技術領域科研人員急需深入研究 開發的新課題之一。
發明內容
本發明的目的在於克服上述不足之處，提供一種應用效果顯著的三聚氰胺快速檢 測試劑盒及其應用。為實現上述目的本發明所採用的實施方式如下一種三聚氰胺快速檢測試劑盒， 其特徵在於該試劑盒內分別設有測試液體樣品處理液(w/v)的三氯乙酸溶液；試劑B 40% (w/v)氫氧化鈉溶液；試劑C :含量為88%食品級的乳酸原液；
顯色劑D 鹼性碘化汞鉀試液，
鹼性碘化汞鉀試液的配製(1)取氫氧化鈉81g，用300ml無氨水溶解，溶解後冷卻；(2)取碘化鉀36g，用IOOml無氨水溶解；取氯化汞13. 6g，將300ml無氨水加熱後 使其溶解，加熱溫度為50 80°C ；氯化汞溶解後，在不斷攪拌下緩緩加到碘化鉀溶液中，用 無氨水定容至500ml ；(3)將冷卻後的氫氧化鈉溶液緩緩倒入步驟(2)配製的碘化汞鉀溶液中，避光、靜 置> 12h，取上清液備用。根據權利要求1所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒的應用，其特徵在於該試 劑盒 在溫度為25士5°C條件下，用於配合飼料、動物性蛋白質飼料、植物性蛋白質飼料及肉食品 中三聚氰胺的半定量測定；應用所述三聚氰胺快速檢測試劑盒進行檢測，具體操作步驟如下(1)進行飼料原料中三聚氰胺的檢測步驟稱取5g粉末狀或細顆粒狀樣品，準 確加入50ml樣品處理液A，充分振蕩搖勻，依次靜置2 3min、濾紙過濾，或用離心機 IOOOOrpm, IOmin,取濾液或上清液20ml ；然後滴加試劑B2 3滴，混勻，依次靜置2 3min、 濾紙過濾、取濾液Iml ；再加處理液A9ml，混勻，取混勻後的液體5ml，滴加顯色劑D3滴，靜 置，在3 5min之內，觀察結果；或進行肉食品中三聚氰胺的檢測步驟稱取5g肉食品，剪碎，放於研缽中，加入 50ml樣品處理液A，依次充分研磨、紗布過濾、取濾液20ml ；然後滴加試劑B2 3滴，混勻， 依次靜置2 3min、IOOOOrpm離心lOmin、取離心後的全部上清液；滴加試劑C5 6滴，混 勻，依次靜置2 3min、IOOOOrpm離心lOmin、取上清液Iml ；再加處理液A9ml，依次混勻、 取混勻後的液體5ml，滴加顯色劑D3滴，靜置，在3 5min之內，觀察結果；(2)待測樣品經過上述處理後，採用目視比濁測定法進行結果判定陽性低濃度時，三聚氰胺濃度為2 lOppm，在靠近瓶底部出現一層類白色沉澱 帶；隨著濃度的升高，三聚氰胺濃度為> lOppm，出現白色或黃色絮狀沉澱；陰性不出現沉 澱反應；採用該目視比濁測定法，最低檢出濃度為2ug/ml。本發明試劑盒的檢測原理三聚氰胺性狀為純白色單斜稜晶體，無味，密度1.573g/cm3(16°C )。常壓熔點 354°C (分解)；快速加熱升華，升華溫度30(TC。溶於熱水，水溶性3G/L(20°C )，微溶於冷 水，極微溶於熱乙醇，不溶於醚、苯和四氯化碳，可溶於甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、批 啶等。低毒。三聚氰胺分子模型呈弱鹼性(PKb = 8)，與鹽酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能 形成三聚氰胺鹽。在中性或微鹼性情況下，與甲醛縮合而成各種羥甲基三聚氰胺，但在微酸性中(pH 值5. 5 6. 5)與羥甲基的衍生物進行縮聚反應而生成樹脂產物。遇強酸或強鹼水溶液水 解，胺基逐步被羥基取代，先生成三聚氰酸二醯胺，進一步水解生成三聚氰酸一醯胺，最後 生成三聚氰酸。三聚氰胺水解生成的產物能夠與鹼性碘化汞鉀試劑生成沉澱或發生顏色反 應，利用這一特點可作為三聚氰胺的鑑定及半定量檢測。本發明的有益效果是本發明具有特異、靈敏、準確、快速、方便、價廉等特點，而且 適用範圍較廣，主要適用於配合飼料、動物性蛋白質飼料、植物性蛋白質飼料及肉食品中三 聚氰胺的半定量測定。本發明所提供的三聚氰胺快速試劑盒主要是應用比濁測法半定量檢測樣品中三聚氰胺，最低檢出濃度為2ug/ml。
本發明所提供的三聚氰胺快速檢測試劑盒的優點在於樣品前處理過程操作簡 便，無需培養專業技術人員，易於實施，能夠對樣品進行快速檢測；完成全部檢測操作過程 只需30 60min，而且檢測結果的精密度較高，非常適合大中小型養殖場的需求。本發明所提供的三聚氰胺快速檢測試劑盒中的主要試劑均以工作液形式提供，使 用方便，並且試劑易於保存。顯色劑與三聚氰胺分解產物發生反應，生成類白色或黃色沉 澱，通過目視比濁法就可以觀察樣品中是否含有三聚氰胺。該試劑盒可供10次檢測使用， 有效降低檢測成本。因此，本發明有效解決了目前市場上檢測三聚氰胺需要大型的精密儀 器設備，熟練的專業人士操作，費時費力及不適合現場測定等難題。該試劑盒在飼料、飼料 原料及肉食品中三聚氰胺含量檢測中具有廣闊的應用前景，並且具有巨大的經濟效益和社 會效益。
具體實施例方式以下結合較佳實施例，對依據本發明提供的具體實施方式
詳述如下實施例1三聚氰胺快速檢測試劑盒的組成部分如下樣品處理液(w/v)的三氯乙酸溶液；6瓶，IOOml/瓶。試劑B ·Α0% (w/v)氫氧化鈉溶液；1瓶，IOml/瓶。試劑C:含量為88%食品級的乳酸原液(市售)；1瓶，IOml/瓶。顯色劑D 鹼性碘化汞鉀試液，1瓶，5ml/瓶。鹼性碘化汞鉀試液的配製(1)取氫氧化鈉81g，用300ml無氨水溶解，溶解後冷卻；(2)取碘化鉀36g，用IOOml無氨水溶解；取氯化汞13. 6g，將300ml無氨水加熱後 使其溶解，加熱溫度為50 80°C ；氯化汞溶解後，在不斷攪拌下緩緩加到碘化鉀溶液中，用 無氨水定容至500ml ；(3)將冷卻後的氫氧化鈉溶液緩緩倒入步驟(2)配製的碘化汞鉀溶液中，避光、靜 置時間彡12h，取上清液備用。該試劑盒在溫度為25士5°C條件下(三聚氰胺溶解性較好)用於配合飼料、動物性 蛋白質飼料、植物性蛋白質飼料及肉食品中三聚氰胺的半定量測定。應用所述三聚氰胺快速檢測試劑盒對飼料及蛋白性飼料原料中三聚氰胺的檢測 具體操作步驟如下稱取5g飼料原料，例如魚粉(或豆柏、酒糟、棉柏、玉米粉)，放於50ml具塞的比色 管中，加入處理液A50ml，充分振蕩、搖勻，靜置2 3min ；濾紙過濾，取濾液20ml，滴加試劑 B2 3滴，混勻，靜置2 3min ；濾紙過濾；取濾液1ml，加處理液A 9ml，混勻；取混勻後的 液體5ml，滴加顯色劑D3滴，靜置，滴加顯色劑後3 5min之內觀察結果。陽性低濃度時(三聚氰胺濃度為2 IOppm)，在靠近瓶底部出現一層類白色沉 澱帶；隨著濃度的升高(三聚氰胺濃度為> IOppm)，出現白色或黃色絮狀沉澱；陰性不出 現沉澱反應。如檢測顆粒飼料時，應先將其研磨粉碎後，再按照試驗步驟操作；具有離心機時，濾紙過濾步驟可用離心機取代(lOOOOrpm，IOmin)。本發明的一個優選實施方案中，試劑盒中所提供的顯色劑為納氏試劑。在鹼性條件下，三聚氰胺的分解產物能夠與顯色劑反應，生成類白色或黃色沉澱，通過目視比濁法就 可以觀察樣品中是否含有三聚氰胺。而且還發現在進行對三聚氰胺提取時，隨溫度升高，其 在溶劑中溶解度呈現增大趨勢。因此，一定要注意提取溫度(25士5°C)及樣品中三聚氰胺 含量。本發明所提供的試劑盒能夠對樣品中三聚氰胺進行半定量檢測即在顯色反應中，如 果發現靠近瓶底部出現一層類白色沉澱帶時，說明樣品中三聚氰胺含量在2 IOppm範圍； 隨著濃度的升高(三聚氰胺濃度為> IOppm)，出現白色或黃色絮狀沉澱，並且沉澱物的量 隨著三聚氰胺含量的增高，沉澱越加明顯。本方法還可以用濁度儀對樣品中三聚氰胺含量 進行定量檢測。實施例2配製三聚氰胺快速檢測試劑盒中的測試液體同實施例1。應用所述三聚氰胺快速檢測試劑盒肉食品中三聚氰胺的檢測具體操作步驟如 下稱取5g豬肉，剪碎，放於研缽中，加入50ml處理液A，充分研磨；紗布過濾；取濾液 20ml，滴加試劑B2 3滴，混勻，靜置2 3min ；離心lOOOOrpm, IOmin ；取離心後的全部上 清液，滴加試劑C5 6滴，混勻，靜置2 3min ；離心lOOOOrpm, IOmin ；取上清液lml，加處 理液A9ml，混勻；取混勻後的液體5ml，滴加顯色劑D3滴，靜置，滴加顯色劑後3 5min之 內觀察結果。陽性低濃度時(三聚氰胺濃度為2 IOppm)，在靠近瓶底部出現一層類白色沉 澱帶；隨著濃度的升高(三聚氰胺濃度為> IOppm)，出現白色或黃色絮狀沉澱；陰性不出 現沉澱反應。其它同實施例1。應用試驗分析實例1 三聚氰胺快速檢測試劑盒精密度試驗本實驗例為精密度試驗，具體操作為將配製好的三聚氰胺快速檢測試劑盒對供試品分別進行重複性、中間精密度、重 現性試驗。重複性試驗在規定範圍內，設計3個不同濃度，每個濃度做3個平行，每個濃度 的3個平行都測3次，用所得測定結果進行評價；中間精密度試驗在本實驗室內，由3個不 同的分析人員用不同設備配製上述3個不同濃度的溶液，每個濃度做3個平行，每個濃度的 3個平行都測3次，用所得測定結果進行評價；並且用所得到的測定結果與重複性試驗得到 的測定結果進行評價；重現性試驗在2個不同的試驗室內由不同的分析人員對上述3個 不同濃度的溶液進行測定。將重複性試驗、中間精密度試驗、重現性試驗所得到試驗結果進 行評定，試驗結果一致，表明本發明所提供的三聚氰胺快速檢測試劑盒精密度達到了要求。應用試驗分析實例2 三聚氰胺快速檢測試劑盒回收率試驗在規定範圍內，設計3個不同濃度，精密稱取三聚氰胺標樣，對樣品進行添加回收 試驗，每個濃度做3個平行，分別計算回收率。結果表明飼料中的添加回收率為100%。應用試驗分析實例3
三聚氰胺快速檢測試劑盒保存期試驗長期試驗將三批配製好的試劑盒放於25°C陰涼乾燥處保存，分別於0、3、6、9、12
個月時對同一批送檢樣品進行測定，結果測定表明三聚氰胺添加實際測定值均在正常範圍 之內。
加速試驗將三批配製好的試劑盒放於40°C恆溫箱內放置2周，進行加速老化試 驗，然後對同一批送檢樣品進行測定，結果表明待測樣中三聚氰胺添加實際測定值均在正 常範圍之內；將三批配製好的試劑盒放於-20°C冰箱冷凍1周，然後對同一批送檢樣品進行 測定，結果表明待測樣中三聚氰胺添加實際測定值均在正常範圍之內。本發明所提供的三聚氰胺快速檢測試劑盒檢測限的確定試驗，通過直觀法確定三 聚氰胺快速檢測試劑盒最低檢出濃度為2ug/ml ；通過具體實施例(半定量檢測豆柏；棉柏； 酒糟；魚粉；玉米粉中三聚氰胺含量)來說明本發明所提供的三聚氰胺快速檢測試劑盒的 檢測及觀察方法。本發明所提供的三聚氰胺快速檢測試劑盒檢測限的確定試驗，通過精密稱取 IOOmg三聚氰胺標準品(準確至0. Img)於IOOmL容量瓶中，加少量1 %三氯乙酸溶液完全 溶解後，然後用1 %三氯乙酸溶液定容至刻度，混勻，製成100 μ g/mL的標準貯備液，4°C條 件下避光保存，有效期為1個月。在使用時配製成不同濃度的三聚氰胺標準工作液，分別為Oug/ml ；2ug/ml ；4ug/ ml ；6ug/ml ；8ug/ml ； 10ug/mL·在配製好上述三聚氰胺溶液後，準備6個清潔的西林瓶擺成 一排，分別取溶液5ml於相應的西林瓶內，同時在每一西林瓶內滴加顯色劑D3滴，在3 5min內觀察試驗結果。三聚氰胺快速檢測試劑盒靈敏、快速、準確，主要用於配合飼料、動物性蛋白質飼 料、植物性蛋白質飼料及肉食品中三聚氰胺殘留的篩查；盒中的主要試劑均以工作液的形 式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏性、高精確性、高準確性等特點。上述參照實施例對該三聚氰胺快速檢測試劑盒及其應用進行的詳細描述，是說明 性的而不是限定性的，可按照所限定範圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發明總體 構思下的變化和修改，應屬本發明的保護範圍之內。
權利要求
一種三聚氰胺快速檢測試劑盒，其特徵在於該試劑盒內分別設有測試液體樣品處理液A1％(w/v)的三氯乙酸溶液；試劑B40％(w/v)氫氧化鈉溶液；試劑C含量為88％食品級的乳酸原液；顯色劑D鹼性碘化汞鉀試液，鹼性碘化汞鉀試液的配製(1)取氫氧化鈉81g，用300ml無氨水溶解，溶解後冷卻；(2)取碘化鉀36g，用100ml無氨水溶解；取氯化汞13.6g，將300ml無氨水加熱後使其溶解，加熱溫度為50～80℃；氯化汞溶解後，在不斷攪拌下緩緩加到碘化鉀溶液中，用無氨水定容至500ml；(3)將冷卻後的氫氧化鈉溶液緩緩倒入步驟(2)配製的碘化汞鉀溶液中，避光、靜置≥12h，取上清液備用。
2.根據權利要求1所述的三聚氰胺快速檢測試劑盒的應用，其特徵在於該試劑盒在 溫度為25士5°C條件下，用於配合飼料、動物性蛋白質飼料、植物性蛋白質飼料及肉食品中 三聚氰胺的半定量測定；應用所述三聚氰胺快速檢測試劑盒進行檢測，具體操作步驟如下(1)進行飼料原料中三聚氰胺的檢測步驟稱取5g粉末狀或細顆粒狀樣品，準確加入 50ml樣品處理液A，充分振蕩搖勻，依次靜置2 3min、濾紙過濾，或用離心機lOOOOrpm、 IOmin,取濾液或上清液20ml ；然後滴加試劑B2 3滴，混勻，依次靜置2 3min、濾紙過濾、 取濾液Iml ；再加處理液A9ml，混勻，取混勻後的液體5ml，滴加顯色劑D3滴，靜置，在3 5min之內，觀察結果；或進行肉食品中三聚氰胺的檢測步驟稱取5g肉食品，剪碎，放於研缽中，加入50ml樣 品處理液A，依次充分研磨、紗布過濾、取濾液20ml ；然後滴加試劑B2 3滴，混勻，依次靜 置2 3min、IOOOOrpm離心lOmin、取離心後的全部上清液；滴加試劑C5 6滴，混勻，依 次靜置2 3min、IOOOOrpm離心lOmin、取上清液Iml ；再加處理液A9ml，依次混勻、取混勻 後的液體5ml，滴加顯色劑D3滴，靜置，在3 5min之內，觀察結果；(2)待測樣品經過上述處理後，採用目視比濁測定法進行結果判定陽性低濃度時，三聚氰胺濃度為2 lOppm，在靠近瓶底部出現一層類白色沉澱帶；隨 著濃度的升高，三聚氰胺濃度為> lOppm，出現白色或黃色絮狀沉澱；陰性不出現沉澱反 應；採用該目視比濁測定法，最低檢出濃度為2ug/ml。
全文摘要
本發明涉及一種三聚氰胺快速檢測試劑盒及其應用，該試劑盒內分別設有測試液體樣品處理液A1％(w/v)的三氯乙酸溶液，試劑B40％(w/v)氫氧化鈉溶液，試劑C含量為88％食品級的乳酸原液，顯色劑D鹼性碘化汞鉀試液。該試劑盒適用於配合飼料、動物性蛋白質飼料、植物性蛋白質飼料及肉食品中三聚氰胺的半定量測定。本發明解決了目前市場上檢測三聚氰胺需要大型的精密儀器設備，熟練的專業人士操作，費時費力及不適合現場測定等難題。本發明能夠半定量檢測三聚氰胺，最低檢出限為2mg/kg。總之，該試劑盒具有特異、靈敏、快速、準確、方便、廉價等特點；盒中主要試劑均以工作液的形式提供，檢測效率高，操作簡單，攜帶方便，經濟與社會效益非常顯著。
文檔編號G01N31/22GK101881759SQ20091006874
公開日2010年11月10日 申請日期2009年5月5日 優先權日2009年5月5日
發明者倫豔霞 申請人:天津生機集團股份有限公司