非糖基化人甲胎蛋白、製備方法及其應用的製作方法

2023-08-13 03:36:16

專利名稱：非糖基化人甲胎蛋白、製備方法及其應用的製作方法
背景技術：
本發明涉及非糖基化人甲胎蛋白、其在轉基因動物和植物中的製備方法及其應用。
甲胎蛋白(AFP)是一種70kDa糖蛋白，由卵黃囊和胎肝產生。AFP在胎兒血清中的含量為毫克水平，在出生時，下降至納克水平，在成人血清中通常也是納克水平；當成人血清中AFP水平升高時，表明有卵黃囊腫瘤、肝細胞瘤或肝臟再生。AFP在胎兒發育期間的作用尚不清楚，儘管已經知道AFP保護妊娠中的胎兒免遭母體免疫攻擊或者免遭母體雌激素的影響。
體外和體內實驗證明，AFP既具有細胞生長刺激活性又具有細胞生長抑制活性，這取決於靶細胞、AFP相對濃度和其它細胞因子和生長因子的存在。例如，AFP可抑制多種腫瘤細胞的生長，具體地講，抑制雌激素刺激的細胞生長。相反，AFP刺激正常胚胎成纖維細胞的生長。AFP也顯示出具有免疫抑制效應和免疫增生效應。
為了開發利用AFP的各種生物學特性，有必要以有效而划算的方式得到足夠量的該分子。已經證明，在重組系統中表達AFP是困難的，因為在真核細胞中表達野生型AFP通常會因為AFP在一個天冬醯胺殘基(胺基酸233)上的差別糖基化而產生幾種同工型。在原核系統中表達AFP通常產生錯摺疊和無活性的蛋白，它們聚集在一起，沒有恰當的內部二硫鍵。這樣錯摺疊的AFP必須經過純化，然後在允許形成16個二硫鍵的條件下，經過困難而耗時的重摺疊過程，以非常低的總收率產生有用的活性蛋白質。因為AFP的非糖基化形式與糖基化形式表現出相同的生物學特性，並且因為沒有糖基化的變異性而允許產生更標準化、穩定的產品，所以非糖基化AFP優選用於商業生產。因此，需要有效方法，以生產非糖基化人AFP用於商業和治療性應用。
發明概述本發明的特徵為基本純的核酸分子，所述分子編碼非糖基化人甲胎蛋白(ng.HuAFP)或其非糖基化片段。在一個實施方案中，編碼ng.HuAFP的核酸分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874。
本發明的另一特徵為包含非糖基化人甲胎蛋白的多肽。在本發明的這一特徵的一個實施方案中，所述多肽是基本純的並且具有SEQID NO6中所示的胺基酸序列。在另一個實施方案中，所述多肽是基本純的並且具有SEQ ID NO8中所示的胺基酸序列。
本發明還包括非糖基化重組HuAFP的生物活性片段及其類似物。在一個實施方案中，非糖基化重組HuAFP的生物活性片段包含SEQ ID NO15中所示的胺基酸序列(結構域II)、SEQ ID NO16中所示的胺基酸序列(結構域I+II)、或SEQ ID NO17中所示的胺基酸序列(結構域II+III)、或兩個或更多個上述胺基酸序列。
本發明的另一特徵為基本純的核酸分子，所述分子包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)啟動子，所述啟動子與ng.HuAFP編碼序列操作性連接並且使ng.HuAFP能表達，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使細胞能分泌ng.HuAFP。在一個實施方案中，所述細胞是原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細胞(例如酵母細胞(例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)或動物細胞(例如哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)。在一個理想的實施方案中，所述細胞將ng.HuAFP分泌到細胞培養基(即非生物體液)中。在另一個實施方案中，所述真核細胞是在轉基因動物(例如哺乳動物，例如山羊、綿羊、駱駝、牛、豬、兔、馬或美洲駝)中。在又一個實施方案中，所述細胞是轉基因動物的生物體液產生細胞，所述啟動子使生物體液產生細胞中能表達ng.HuAFP，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到轉基因動物的生物體液(例如乳汁、尿液、血液或淋巴液)中。
在一個實施方案中，表達ng.HuAFP的細胞是在轉基因動物中，驅動ng.HuAFP表達的啟動子是乳汁產生細胞特異性啟動子，其使ng.HuAFP在動物的乳汁產生細胞中表達，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到動物乳汁中。在另一個實施方案中，表達ng.HuAFP的細胞是在轉基因動物中，驅動ng.HuAFP表達的啟動子是尿液產生細胞特異性啟動子，其使ng.HuAFP在動物的尿液產生細胞中表達，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到動物尿液中。在又一個實施方案中，表達ng.HuAFP的細胞是在轉基因動物中，驅動ng.HuAFP表達的啟動子是血液產生細胞特異性啟動子，其使ng.HuAFP在動物的血液產生細胞中表達，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到動物血液中。在再一個實施方案中，表達ng.HuAFP的細胞是在轉基因動物中，驅動ng.HuAFP表達的啟動子是淋巴液產生細胞特異性啟動子，其使ng.HuAFP在動物的淋巴液產生細胞中表達，所述前導序列使ng.HuAFP能分泌到動物淋巴液中。
本發明的另一特徵為非人類轉基因生物，所述生物表達ng.HuAFP並將其分泌到生物體液(例如乳汁、尿液、唾液、精液或陰道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊內的液體、血液、汗液和淚液；或者是植物產生的水溶液，包括例如滲出液或吐水液、木質部、韌皮部、樹脂和花蜜)中。在一個實施方案中，所述轉基因生物是哺乳動物(例如例如山羊、綿羊、駱駝、牛、豬、兔、馬或美洲駝)、鳥類、爬行動物、兩棲動物或植物。在另一個實施方案中，ng.HuAFP是由轉基因表達，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)與ng.HuAFP編碼序列操作性連接的啟動子，致使所述啟動子使所述生物的細胞能表達ng.HuAFP並能將蛋白分泌到生物體液中，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列能使所述生物的細胞將ng.HuAFP分泌到生物體液中。在又一個實施方案中，所述啟動子是乳汁特異性啟動子、尿液特異性啟動子、血液特異性啟動子或淋巴液特異性啟動子，所述前導序列使ng.HuAFP能分別分泌到生物體的乳汁、尿液、血液或淋巴液中。在再一個實施方案中，所述生物是小鼠或山羊。
本發明的另一特徵為包括ng.HuAFP的非人類哺乳動物乳汁、尿液、血液或淋巴液。在一個實施方案中，ng.HuAFP是可溶性的，並且由非人類轉基因哺乳動物產生，所述動物的乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞表達轉基因，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)乳汁特異性啟動子、尿液特異性啟動子、血液特異性啟動子或淋巴液特異性啟動子，致使所述啟動子與ng.HuAFP編碼序列操作性連接並且使得所述哺乳動物的乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞能夠表達ng.HuAFP，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列能使乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞將ng.HuAFP分別分泌到所述哺乳動物的乳汁、尿液、血液或淋巴液中。
本發明的另一特徵為通過下述步驟產生ng.HuAFP的方法(a)提供用轉基因轉導的細胞，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)與ng.HuAFP編碼序列操作性連接的啟動子，致使該啟動子使細胞能表達ng.HuAFP，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使細胞能分泌ng.HuAFP；和(b)培養所述轉導細胞，使得所述細胞表達並分泌ng.HuAFP。
在一個實施方案中，所述細胞是原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如酵母細胞(例如巴斯德畢赤酵母)或哺乳動物細胞(例如CHO細胞，或者乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞))。
本發明的另一特徵為通過下述步驟產生ng.HuAFP的方法(a)提供包含轉基因的轉基因生物(例如哺乳動物(例如山羊、綿羊、駱駝、牛、豬、兔、馬或美洲駝)、鳥類、爬行動物、兩棲動物或植物)，所述轉基因具有(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ IDNO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)與ng.HuAFP編碼序列操作性連接的啟動子，致使該啟動子使所述轉基因生物的生物體液產生細胞能表達ng.HuAFP，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列能使所述生物體液產生細胞將ng.HuAFP分泌到轉基因生物的生物體液中；和(b)從所述轉基因生物中收集包含ng.HuAFP的生物體液。
在一個實施方案中，所述生物體液是乳汁、尿液、唾液、精液或陰道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊內的液體、血液、汗液或淚液；或者是植物產生的水溶液，包括例如滲出液或吐水液、木質部、韌皮部、樹脂和花蜜。在一個理想的實施方案中，所述生物體液是乳汁、尿液、血液或淋巴液，而ng.HuAFP分別是從乳汁、尿液、血液或淋巴液中純化的。在另一個實施方案中，所述啟動子是乳汁特異性啟動子、尿液特異性啟動子、血液特異性啟動子或淋巴液特異性啟動子，所述啟動子使ng.HuAFP能分別在轉基因生物體內乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞中表達。在又一個實施方案中，所述轉基因生物表達ng.HuAFP並將其分泌在兩種以上的生物體液(例如乳汁和尿液，乳汁和血液，尿液和血液，或乳汁、尿液和血液)中。
本發明的另一特徵為治療需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的從細胞培養基中純化的ng.HuAFP。
本發明的另一特徵為治療需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的生物體液(例如乳汁、尿液、唾液、精液或陰道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊內的液體、血液、汗液和淚液；或者是植物產生的水溶液，包括例如滲出液或吐水液、木質部、韌皮部、樹脂和花蜜)或其提取物，所述生物體液或其提取物包括從轉基因非人類生物(例如哺乳動物(例如小鼠、山羊、綿羊、駱駝、母牛、豬、兔、馬、公牛或美洲駝)、鳥類、爬行動物、兩棲動物或植物)中獲得的ng.HuAFP。在一個理想的實施方案中，n.g.HuAFP具有SEQ ID NO8所示的序列。在另一個實施方案中，所示生物體液是乳汁。在又一個實施方案中，ng.HuAFP是從轉基因非人類生物的生物體液中純化的(例如從哺乳動物的乳汁、尿液、血液或淋巴液中純化的ng.HuAFP)。在各種理想的實施方案中，所述方法可用於抑制或治療免疫性疾病(例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染、癌細胞生長)，以誘導骨髓細胞增殖(例如在骨髓移植之後，或者在給予化療或放療等骨髓毒性治療之後)，或者作為免疫移植藥(例如抑制自體反應性免疫細胞增殖，抑制移植器官的排斥(例如移植物抗宿主病)，或者移植或治療自身免疫性疾病，例如類風溼性關節炎、肌營養不良、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、多發性硬化、胰島素依賴性糖尿病或銀屑病)。
本發明的另一特徵為治療用組合物，所述組合物包含具有SEQ IDNO8所示胺基酸序列的ng.HuAFP。
本發明的另一特徵為具有SEQ ID NO8所示胺基酸序列的ng.HuAFP在製備用於治療經診斷患有或罹患諸如以下疾病的個體的藥物中的用途癌症、類風溼性關節炎、肌營養不良、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、多發性硬化、胰島素依賴性糖尿病或銀屑病。
本發明的另一特徵為具有SEQ ID NO8所示胺基酸序列的ng.HuAFP在製備用於促進細胞增殖(例如誘導骨髓細胞增殖(例如在骨髓移植之後，或者在給予化療或放療等骨髓毒性治療之後))的藥物中的用途。
本發明的另一特徵為具有SEQ ID NO8所示胺基酸序列的ng.HuAFP在製備用做免疫抑制藥(例如抑制自體反應性免疫細胞增殖；或抑制移植器官排斥(例如移植物抗宿主病))的藥物中的用途。
在本發明的所有特徵的一個實施方案中，ng.HuAFP是重組的(r.ng.HuAFP)。
在本發明的所有特徵中，所述生物是動物(例如哺乳動物、鳥類、爬行動物或兩棲動物)或植物。示例性的哺乳動物包括山羊、綿羊、駱駝、牛、豬、兔、馬和美洲駝。示例性的鳥類包括雞、火雞、鵝、鴕鳥、鵪鶉和鴨。示例性的植物包括來自以下種屬擬南芥屬(Arabidopsis)、苜蓿屬(Medicago)、草莓屬(Fragaria)、豇豆屬(Vigna)、蓮屬(Lotus)、驢食豆屬(Onobrychis)、三葉草屬(Trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、柑橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿蔔屬(Daucus)、芸苔屬(Brassica)、蘿蔔屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、辣椒屬(Capsicum)、天仙子屬(Hyoscyamus)、番茄屬(Lycopersicon)、菸草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、碧冬茄屬(Petuna)、毛地黃屬(Digtalis)、Majorana、Ciohorium、向日葵屬(Helianthus)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、金魚草屬(Antirrhinum)、Hererocallis、龍面花屬(Nemesia)、天竺葵屬(Pelargonium)、黍屬(Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛茛屬(Ranunculus)、千裡光屬(Senecio)、喇叭花屬(Salpiglossis)、甜瓜屬(Cucumis)、Browaalia、大豆屬(Glycine)、黑麥草屬(Lolium)、玉蜀黍屬(Zea)、小麥屬(Triticum)、高粱屬(Sorghum)或曼陀羅屬(Datura)。所述植物也可選自松、矮牽牛、番茄、馬鈴薯、菸草、萵苣、向日葵、油菜、亞麻、棉花、甜菜、芹菜、大豆、苜蓿、蓮藕、黃瓜、胡蘿蔔、茄子、花椰菜、辣根、牽牛、白楊、核桃、蘋果、葡萄、蘆筍、水稻、玉米(maize)、小米、洋蔥、大麥、鴨茅草、燕麥、黑麥、小麥、玉米(corn)、苜蓿、草坪草、滿江紅、浮稻、水葫蘆和西瓜，或者可以選自能夠進行營養體增殖的水生植物或生長在水下的開花植物。
在本發明其它理想的實施方案中，所述生物體液是乳汁、尿液、唾液、精液或陰道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊內的液體、血液、汗液、淚液、植物滲出液、吐水液、木質部、韌皮部、樹脂或花蜜。最好所述生物體液是乳汁。
在本發明其它理想的實施方案中，所述生物是哺乳動物並且ng.HuAFP由哺乳動物細胞表達，所述細胞負責產生蛋白並將其分泌到生物的生物體液中(例如乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞)。在理想的實施方案中，ng.HuAFP由哺乳動物的乳汁產生細胞在乳汁特異性啟動子控制下進行表達，所述乳汁特異性啟動子可選自αS-1酪蛋白啟動子、αS2-酪蛋白啟動子、β-酪蛋白啟動子、γ-酪蛋白啟動子、κ-酪蛋白啟動子、乳清酸性蛋白(WAP)啟動子、α-乳清蛋白啟動子、β-乳球蛋白啟動子和小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)長末端重複序列(LTR)啟動子。ng.HuAFP在以上任一啟動子控制下表達，使所述多肽能分泌到哺乳動物的乳汁中。
在其它理想的實施方案中，ng.HuAFP由哺乳動物的尿液產生細胞在尿液特異性啟動子控制下進行表達，所述尿液特異性啟動子可選自尿斑蛋白(uroplakin)II啟動子和尿調蛋白啟動子。ng.HuAFP在以上任一啟動子控制下表達，使ng.HuAFP能分泌到哺乳動物的尿液中。
在其它理想的實施方案中，ng.HuAFP由哺乳動物的血液產生細胞在血液特異性啟動子(例如清蛋白啟動子和甲胎蛋白啟動子)控制下進行表達。在又一個理想的實施方案中，ng.HuAFP由哺乳動物的血液產生細胞在淋巴細胞特異性啟動子控制下進行表達。ng.HuAFP在以上任一啟動子控制下表達，使ng.HuAFP能分泌到哺乳動物的血液中。
在再一些理想的實施方案中，ng.HuAFP由哺乳動物的淋巴液產生細胞在淋巴液特異性啟動子控制下進行表達。ng.HuAFP在淋巴液特異性啟動子控制下表達，使ng.HuAFP能分泌到哺乳動物的淋巴液中。
在再一些理想的實施方案中，所述生物是鳥並且ng.HuAFP由鳥的細胞在禽類特異性啟動子控制下進行表達，所述禽類特異性啟動子可選自卵清蛋白啟動子或apo-B啟動子。ng.HuAFP在以上任一啟動子控制下表達，使ng.HuAFP能分泌到羊膜液或者卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊周圍的液體中。
在本發明的另一些實施方案中，所述生物是植物並且ng.HuAFP由植物細胞在植物特異性啟動子控制下進行表達，所述植物特異性啟動子可選自花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、CaMV 19S啟動子、T-DNA甘露氨酸合成酶啟動子、穀胱甘肽-S-轉移酶同工型II(GST-II-27)啟動子、地塞米松(DEX)啟動子、細胞啟動子、查耳酮合酶(CHS)啟動子、PATATIN啟動子、胭脂鹼合酶(NOS)啟動子、章魚鹼合酶(OCS)啟動子、馬鈴薯(Solanum tuberosum)葉/莖(ST-LS)1啟動子、大豆熱激蛋白hsp17.5-E、hsp17.3-B啟動子、Parasponia anderson血紅蛋白啟動子、苯丙氨酸氨裂合酶啟動子、碧冬茄5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因啟動子、蔗糖合酶啟動子、葉綠素a/b(Cab)啟動子、玉米rbcS啟動子、豌豆rbcS-3A啟動子、來自核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBICSO)的光誘導型啟動子、脫落酸(ABA)效應基因序列啟動子、ABA誘導型HVA1啟動子、ABA誘導型HVA22啟動子、rd29A啟動子、23-kDa玉米醇溶蛋白基因啟動子、法國豆β-菜豆蛋白基因啟動子、營養儲藏蛋白(vspB)啟動子、擬南芥cdc2a啟動子、擬南芥SAG12啟動子、病原體誘導型PR-1啟動子、b-1，3葡聚糖酶啟動子、醇脫氫酶(ADH)I啟動子、ADH II啟動子、苜蓿中華根瘤菌(Rhizobium meliloti)FIXD基因啟動子、rol A啟動子、rol B啟動子和rol C啟動子。ng.HuAFP在以上任一植物特異性啟動子控制下表達，使ng.HuAFP能在植物的葉、莖、根或果實中產生，並且將ng.HuAFP分泌到植物的滲出液或吐水液、或者植物的木質部、韌皮部、樹脂或花蜜中。
在其它實施方案中，ng.HuAFP在誘導型啟動子控制下表達，因而對過量表達提供了時間和/或空間控制。在一個理想的實施方案中，誘導型啟動子選自熱激蛋白啟動子、金屬硫蛋白啟動子、MMTV-LTR啟動子和蛻皮素啟動子。調節ng.HuAFP表達的其它方式包括使用幕黎甾酮(muristerone)A和四環素/強力黴素選擇。
本發明的其它特徵和優勢在以下詳述和權利要求書中是顯而易見的。
定義「生物體液」是指由哺乳動物、鳥類、兩棲動物或爬行動物等生物產生的水溶液，其中含有由細胞分泌的蛋白，所述細胞浸泡在水溶液中。生物體液的實例包括例如乳汁、尿液、唾液、精液或陰道液、滑液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊內的液體、血液、汗液和淚液；以及植物產生的水溶液，包括例如滲出液或吐水液、木質部、韌皮部、樹脂和花蜜。還包括動物組織提取物以及植物提取物(其中包括芽、葉、根、莖和種子等任何植物結構的水性萃取液或有機萃取液)。植物提取物可以得自滲出液或吐水液。
「生物體液產生細胞」是指浸泡在生物體液中並將蛋白分泌到生物體液中的細胞。
「血液產生細胞」是指將蛋白分泌到血液中的細胞(例如肝上皮細胞、脾上皮細胞、骨髓細胞、胸腺上皮細胞、血管內皮細胞、骨髓細胞(例如淋巴細胞(例如B淋巴細胞或T淋巴細胞)和紅細胞))。
「血液特異性啟動子」是指在將蛋白分泌到血液中的細胞(例如肝上皮細胞、脾上皮細胞、骨髓細胞、胸腺上皮細胞、血管內皮細胞和淋巴細胞(例如B淋巴細胞或T淋巴細胞))中，天然指導基因表達的啟動子。血液特異性啟動子的實例是清蛋白啟動子/增強子，對其已有描述並可用於完成外源基因的肝特異性表達(參見例如Shen等，DNA 8101-108，1989；Tan等，Dev.Biol.14624-37，1991；McGrane等，TIBS 1740-44，1992；Jones等，J.Biol.Chem.26514684-14690，1990；Shimada等，FEBS Letters 279198-200，1991)。甲胎蛋白基因啟動子也特別有用。
「胚胎細胞」是指能夠成為生物體所有體細胞和生殖細胞的祖細胞的細胞。示例性的胚胎細胞是胚胎幹細胞(ES細胞)和受精卵母細胞。優選本發明的胚胎細胞是哺乳動物胚胎細胞。
本文所用的「外源」當指基因或多肽時，是指並非正常存在於動物體內的基因或多肽。例如，ng.HuAFP對山羊來說是外源的。
「表達載體」是指經遺傳工程改造的質粒或病毒，其來自例如噬菌體、腺病毒、逆轉錄病毒、痘病毒、皰疹病毒或人工染色體，用於將與啟動子操作性連接的ng.HuAFP編碼序列轉移到宿主細胞中，使編碼的r.ng，HuAFP在宿主細胞中表達。
「人甲胎蛋白」或「HuAFP」或「rHuAFP」是指這樣的多肽與Genbank檢索號V01514所示成熟甲胎蛋白(胺基酸19-609)(SEQ IDNO4)具有基本上相同的胺基酸序列，並且由Genbank檢索號V01514所示cDNA序列的核苷酸99-1874(SEQ ID NO3)編碼，Morinaga等報導了所述多肽(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804604-4608，1983)。
「片段」當用於非糖基化HuAFP多肽時，是指長度為至少5個毗連胺基酸、優選至少10個毗連胺基酸、更優選至少20、50或100個毗連胺基酸、最優選至少200-400或更多個毗連胺基酸，並且最好在SEQ ID NO4中的第233位胺基酸包括穀氨醯胺殘基代替天冬醯胺殘基。HuAFP片段及其類似物優選保留生物活性。HuAFP片段及其類似物描述於例如美國專利第5,965,528號和第5,384,250號。
目標重組HuAFP片段包括但不限於結構域I(胺基酸1(Arg)-198(Ser)，SEQ ID NO9)、結構域II(胺基酸199(Ser)-390(Ser)，SEQ IDNO15)、結構域III(胺基酸391(Gln)-591(Val)，SEQ ID NO11)、結構域I+II(胺基酸1(Arg)-390(Ser)，SEQ ID NO16)、結構域II+III(胺基酸199(Ser)-591(Val)，SEQ ID NO17)和rHuAFP片段I(胺基酸267(Met)-591(Val)，SEQ ID NO14)。上述重組HuAFP片段的編號是根據缺失信號序列胺基酸1-18的成熟AFP序列而確定的。因此，HuAFP片段1位上的精氨酸殘基相當於前體AFP胺基酸19。可以通過用例如穀氨醯胺取代SEQ ID NO4中的第233位上的天冬醯胺殘基，產生上述HuAFP片段作為非糖基化片段。使用常規技術和測定，通過實驗對片段的活性進行評價。
「人甲胎蛋白前體」是指這樣的多肽與Genbank檢索號V01514所示胺基酸1-609(SEQ ID NO2)具有基本上相同的胺基酸序列，並且由Genbank檢索號V01514所示cDNA序列的核苷酸45-1874(SEQID NO1)編碼。
「前導序列」或「信號序列」是指編碼蛋白分泌信號、並且當與編碼ng.HuAFP的下遊核酸分子操作性連接時能指導ng.HuAFP分泌的核酸序列。前導序列可以是天然的人甲胎蛋白前導序列、人工衍生前導序列，或者可得自與用於指導ng.HuAFP編碼序列轉錄的啟動子相同的基因，或者來自從細胞中正常分泌的另一蛋白。
「淋巴液產生細胞」是指將蛋白分泌到淋巴液中的細胞(例如淋巴管上皮細胞和淋巴結細胞、淋巴細胞(例如B淋巴細胞和T淋巴細胞)和巨噬細胞)。
「淋巴液特異性啟動子」是指在將蛋白分泌到淋巴液中的細胞(例如淋巴管上皮細胞和淋巴結細胞、淋巴細胞(例如B淋巴細胞和T淋巴細胞)和巨噬細胞)中，天然指導基因表達的啟動子。
「乳汁產生細胞」是指將蛋白分泌到乳汁中的細胞(例如乳腺上皮細胞)。
「乳汁特異性啟動子」是指在將蛋白分泌到乳汁中的細胞(例如乳腺上皮細胞)中，天然指導基因表達的啟動子，其包括例如酪蛋白啟動子、例如α-酪蛋白啟動子(例如αS-1酪蛋白啟動子和αS2-酪蛋白啟動子)、β-酪蛋白啟動子(例如山羊β-酪蛋白基因啟動子(DiTullio，BioTechnology 1074-77，1992)、γ-酪蛋白啟動子和κ-酪蛋白啟動子；乳清酸性蛋白(WAP)啟動子(Gorton等，BioTechnology 51183-1187，1987)；β-乳球蛋白啟動子(Clark等，BioTechnology-7487-492，1989)；α-乳清蛋白啟動子(Soulier等，FEBSLetts.29713，1992)。也包括在乳腺組織中特異性激活、並因此用於本發明的啟動子，例如小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)長末端重複序列(LTR)啟動子。
「操作性連接」是指當合適的分子(例如轉錄激活蛋白)連接調節序列時，基因和一個或多個調節序列的連接方式允許基因表達。
「植物」是指植物全株、植物部分、植物細胞或植物細胞組。可用於本發明方法的植物種類通常和可用於轉化技術的高等植物種類一樣廣泛，包括單子葉植物和雙子葉植物。植物包括各倍數水平的植物，包括多倍體、二倍體和單倍體。
「啟動子」是指足以指導轉錄的最小序列。在本發明中也包括這樣的啟動子元件其足以使啟動子依賴性基因表達受到細胞類型特異性、組織特異性、時間特異性或者被外來信號或試劑誘導的控制；這些元件可位於天然基因的5′或3′或內含子序列區。
「純化的」或「基本純的」是指分泌到生物體液(例如乳汁、尿液、血液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊周圍的液體、吐水液、木質部、韌皮部、樹脂或樹液)中的ng.HuAFP與生物體液中天然存在的其它組分(例如蛋白質、脂肪和水)部分或完全分離，因此相對於生物體液中存在的未純化的ng.HuAFP，增加了ng.HuAFP的有效濃度。
「非糖基化人甲胎蛋白」或「ng.HuAFP」是指與上述成熟人甲胎蛋白具有基本上相同的胺基酸序列的多肽，只是在SEQ ID NO4中的第233位胺基酸包含一個從天冬醯胺殘基變為穀氨醯胺殘基的突變(如SEQ ID NO6所示)，從而消除了一個糖基化位點。非糖基化人甲胎蛋白前體的核酸序列包含SEQ ID NO5所示序列的核苷酸45-1874。
「ng.HuAFP分泌信號」或「ng.HuAFP信號肽」或「ng.HuAFP前導序列」或「ng.HuAFP信號序列」是指與Genbank檢索號V01514所示胺基酸1-18(核苷酸45-98所編碼)具有基本上相同胺基酸序列的多肽。在蛋白質成熟和胞外分泌過程中，蛋白分泌信號從ng.HuAFP上切割下來。
「基本純的核酸分子」是指不含本發明核酸分子所來源的生物體天然存在的基因組中的基因的核酸分子。因此該術語包括例如重組DNA分子，所述分子摻入到載體中；摻入到自主複製質粒或病毒中；或者摻入到原核生物或真核生物基因組DNA中；或者其以獨立於其它序列的分離的分子(例如通過PCR或限制性內切核酸酶消化而產生的cDNA或基因組片段或cDNA片段)存在。它也包括作為雜合基因部分的重組DNA以及相應mRNA，所述雜合基因含有對所述基因來說並非天然的核苷酸序列或編碼額外的多肽序列。
「治療有效量」是指當給予患者時，能抑制或刺激由人甲胎蛋白調節的生物活性的非糖基化人甲胎蛋白或其片段的用量。所述生物活性包括抑制腫瘤細胞增殖或自體反應性免疫細胞增殖，或者刺激細胞(例如骨髓細胞)增殖。治療有效量可以隨包括醫學適應症、給藥時間長短和給藥途徑等諸多因素而變化。例如，系統給予ng.HuAFP的範圍可以在0.1ng-10g/kg體重，優選範圍在1ng-1g/kg體重，更優選範圍在10ng-100mg/kg體重，最優選範圍在25μg-10mg/kg體重。
「轉化」、「轉染」或「轉導」是指將外源分子導入細胞中的任何方法。脂轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、微注射、核轉移(參見例如Campbell等，Biol.Reprod.49933-942，1993；Campbell等，Nature 385810-813，1996)、原生質體融合、磷酸鈣沉澱、轉導(例如噬菌體、腺病毒、逆轉錄病毒或其它病毒轉移)、電穿孔和生物射彈轉化就是本領域技術人員已知的幾個可以使用的方法。
「轉化細胞」、「轉染細胞」、「或「轉導細胞」是指通過重組DNA技術引入編碼ng.HuAFP的核酸分子的細胞(或細胞後代)。所述核酸分子可以穩定摻入到宿主染色體中，或者可以以附加體形式保留。
「轉基因」是指人為插入到細胞或其祖先中、並且成為由該細胞發育而來的動物的基因組組成部分的任何核酸分子。所述轉基因可包括對轉基因動物來說部分或完全是外源(即外來)的基因，或可以是與動物內源基因具有同一性的基因。
「轉基因的」是指任何細胞，所述細胞包含人為插入到細胞或其祖先中、並且成為由該細胞發育而來的動物的基因組組成部分的任何核酸分子。優選所述轉基因動物是轉基因哺乳動物(例如小鼠、山羊、綿羊、駱駝、母牛、豬、兔、馬、公牛或美洲駝)。優選所述核酸分子(轉基因)人為插入到核基因組(即染色體)中，儘管所述轉基因也可以以附加體形式保留(例如由含有Epstein-Barr病毒oriP等複製起點的載體攜帶)。
「尿液產生細胞」是指將蛋白分泌到尿液中的細胞(例如膀胱上皮細胞或腎上皮細胞)。
「尿液特異性啟動子」是指在將蛋白分泌到尿液中的細胞(例如膀胱上皮細胞)中，天然指導基因表達的啟動子。尿液特異性啟動子的實例是尿斑蛋白II基因啟動子和尿調蛋白基因啟動子。
附圖簡述

圖1是對含有hAFP的載體進行操作以產生基因組hAFP β-酪蛋白表達構建體BC934的示意圖。
圖2A和圖2B是用於表達rHuAFP或ng.HuAFP並將其分泌到乳汁中的山羊β-酪蛋白/rHuAFP轉基因(圖2A)和β-酪蛋白/ng.HuAFP轉基因(圖2B)的結構示意圖。
圖3是蛋白質印跡圖，顯示轉基因小鼠乳汁樣品中存在rHuAFP。第1-3泳道hAFP。第1泳道50ng hAFP(相當於0.5mg/ml)；第2泳道100ng hAFP(相當於1.0mg/ml)；第3泳道200ng hAFP(相當於2.0mg/ml)；第4泳道陰性(非轉基因)小鼠乳汁；第5-10泳道rHuAFP。第5泳道BC934-1-7，d9，(4μL-1∶40)；第6泳道BC934-1-8，d9，(4μL-1∶40)；第7泳道BC934-1-56，d9，(4μL-1∶40)；第8泳道BC934-1-59，d9，(4μL-1∶40)；第9泳道BC934-1-63，d9，(4μL-1∶40)；第10泳道BC934-1-64，d9，(4μL-1∶40)。
圖4是蛋白質印跡圖，顯示轉基因小鼠乳汁樣品中存在ng.HuAFP。第1泳道hAFP(50ng)；第2泳道hAFP(100ng)；第3泳道分子量標準品；第4泳道陰性(非轉基因)小鼠乳汁；第5-10泳道ng.HuAFP。第5泳道BC1055-1-9(4μL-1∶40)；第6泳道BC1055-1-10(4μL-1∶400)；第7泳道BC1055-1-37(4μL-1∶400)；第8泳道BC1055-1-44(4μL-1∶40)；第9泳道BC1055-1-74(4μL-1∶40)；第10泳道BC1055-1-85(4μL-1∶40)。
圖5是示意圖，顯示BC1055(ng.HuAFP)構建體和跨越5′β-酪蛋白和5′ng.HuAFP序列連接區的332bp PCR產物(標記「PCR產物」)的位置。也顯示了PCR引物3′BC探針的位置，所述探針用於DNA印跡分析。
圖6A和圖6B是照片，顯示從含有ng.HuAFP轉基因的建立者山羊F093採取的血液和耳組織的PCR分析結果。圖6A顯示用山羊外顯子7引物對(410bp產物)和hAFP特異性引物對(332bp產物)進行雙PCR分析的結果。圖6B顯示僅用hAFP特異性引物對進行PCR分析的結果。這兩個實驗中的模板DNA是相同的。第1泳道DNA大小標準品；第2泳道非轉基因山羊血液樣品；第3泳道hAFP陽性山羊細胞系(克隆7)；第4泳道來自hAFP陽性流產胎F026的耳組織；第5泳道來自F093的血組織；第6泳道來自F093的耳組織。
圖7是圖片，顯示建立者山羊F093的DNA印跡分析結果。將5μg DNA用EcoRI消化，進行電泳分離，轉印到Genescreen Plus(NewEngland Nuclear)。將印跡與山羊β-酪蛋白探針雜交，洗滌，然後進行放射自顯影。第1泳道λHindIII，分子量標記；第2泳道非轉基因山羊耳組織DNA；第3泳道F026，hAFP陽性流產胎耳組織DNA；第4泳道F093，建立者山羊血DNA。
圖8A和圖8B是照片，顯示建立者山羊F093的螢光原位雜交(FISH)分析結果。圖8A顯示F093培養白細胞中期染色體的代表性實例。白點和箭頭指示轉基因信號。染色體經DAPI染色後可見。放大倍數1000X。圖8B顯示F093培養白細胞間期核的代表性視野。轉基因信號是白色的並用箭頭指示。核DNA經DAPI染色後可見。放大倍數1000X。
發明詳述本發明的特徵為生物活性非糖基化人甲胎蛋白(ng.HuAFP)、編碼ng.HuAFP的核酸序列以及製備ng.HuAFP的方法。本發明的方法包括在細胞(例如原核細胞(例如大腸桿菌)或真核細胞(例如酵母細胞(例如巴斯德比赤酵母(Pichia pastoris))或哺乳動物細胞))中產生ng.HuAFP。在原核細胞中產生rHuAFP的方法可用於製備ng.HuAFP，該方法可參見美國專利第5,384,250號和第6,331,611號，所述文獻通過引用結合到本文中。可用於在哺乳動物細胞中產生ng.HuAFP的方法，可參見美國順序號09/936,020。Ausubel等(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，New York，NY，第16.12.1-16.20-16頁和第A.5.23-A.5.30頁，1997)提供了各種哺乳動物表達系統和在哺乳動物細胞中表達重組蛋白的方法的詳述。
本發明的方法也包括在轉基因生物、特別是哺乳動物體中產生ng.HuAFP，所述哺乳動物例如反芻動物(例如母牛、綿羊和山羊)、馬、駱駝、公牛、美洲駝、豬、兔和小鼠，但也包括在鳥類(例如雞、火雞、鵝、鵪鶉、鴨和鴕鳥)、兩棲動物、爬行動物和植物中產生ng.HuAFP。所述轉基因含有ng.HuAFP，所述ng.HuAFP包含經改變在前體AFP的第251位或者在缺失信號序列的成熟AFP的第233位含有天冬醯胺變為穀氨醯胺的一個取代的人AFP編碼區。ng.HuAFP編碼區與含有轉錄啟動子的核酸序列下遊融合。在啟動子和所述蛋白編碼區之間是編碼蛋白分泌信號的前導序列。根據所用的啟動子和分泌信號，表達的ng.HuAFP能分泌到轉基因生物的生物體液例如乳汁、尿液、血液、淋巴液、羊膜液、卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊周圍的液體、或吐水液中。轉基因構建體中也可包括額外的核酸元件，例如轉錄增強子、轉錄和翻譯終止序列、增強mRNA穩定性的3′非翻譯區和增強表達的內含子。ng.HuAFP在轉基因動物中表達，分泌到生物體液(例如乳汁、尿液、血液、淋巴液等)中，然後可以從這些液體中收集並純化ng.HuAFP。
將ng.HuAFP分泌到轉基因生物的生物體液(例如乳汁、尿液和淋巴液)中，有利於其純化並避免去除血液產物和培養基添加劑，這些血液產物和培養基添加劑中的有些成分是有毒的、致癌的或具有感染性的。此外，含有ng.HuAFP的乳汁可直接供人或其它哺乳動物消費。ng.HuAFP在尿液中表達，允許使用雄性動物和雌性動物來生產ng.HuAFP。另外，一旦動物開始產生尿液，同時也產生ng.HuAFP。最後，從尿液中純化ng.HuAFP相當簡便，因為尿液通常只含少量蛋白質。
轉基因構建體可用於在乳腺組織中表達ng.HuAFP轉基因的啟動子包括天然驅動乳腺特異性蛋白(例如乳蛋白)表達的啟動子，儘管可以使用能將轉基因產物分泌到乳汁中的任何啟動子。這些啟動子包括例如天然指導以下蛋白表達的啟動子乳清酸性蛋白(WAP)、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白(參見例如Drohan等，U.S.P.N.5,589,604；Meade等美國專利第4,873,316號；Karatzas等，美國專利第5,780,009號)。
可用於在泌尿組織中表達ng.HuAFP轉基因的啟動子是尿斑蛋白啟動子和尿調蛋白啟動子(Kerr等，Nat.Biotechnol.1675-79，1998；Zbikowska等，Transgenic Res.11425-435，2002)，儘管可以使用能將轉基因產物分泌到尿液中的任何啟動子。
轉基因構建體優選包括啟動子下遊的前導序列。前導序列是編碼蛋白分泌信號、並且當與下遊編碼ng.HuAFP的核酸分子操作性連接時能指導ng.HuAFP分泌的核酸序列。前導序列可得自與用於指導編碼ng.HuAFP的核酸分子轉錄的啟動子相同的基因(例如編碼乳特異性蛋白的基因)。或者，可以使用編碼天然人AFP蛋白分泌信號(Genbank檢索號V01514胺基酸1-19)的前導序列；Genbank檢索號V01514核苷酸45-101編碼天然人AFP蛋白分泌信號。其它選項包括使用前導序列，所述序列編碼通常從細胞中正常分泌的任何其它蛋白的蛋白分泌信號，編碼人工蛋白分泌信號的人工前導序列，或雜合前導序列(例如山羊β-酪蛋白和人AFP前導序列的融合體)。
另外，所述轉基因構建體優選包括轉錄終止位點(即轉錄mRNA的聚腺苷酸化信號)和翻譯終止信號。所述轉基因也可編碼增加ng.HuAFP mRNA穩定性的任何3′非翻譯區(UTR)，例如，牛生長激素基因、乳蛋白基因或珠蛋白基因的3′UTR。
所述轉基因構建體也可包括轉基因轉錄區上遊或下遊的轉錄增強子，例如病毒(例如SV40)或哺乳動物(例如酪蛋白)基因的增強子。
所述轉基因構建體還可包括提高轉基因表達水平的內含子。所述內含子可位於轉錄起始位點和翻譯起始密碼子之間、翻譯終止密碼子的3′，或者在轉基因編碼區內。所述內含子應包括5′剪接位點(即供體位點)、3′剪接位點(即受體位點)並且優選在這兩個位點之間的至少有100個核苷酸。可以使用本領域已知的任何可增加轉基因表達的內含子(例如來自反芻動物酪蛋白基因的內含子)。
ng.HuAFP轉基因可以由環狀質粒、粘粒載體或其它載體例如來自病毒的載體所攜帶。所述載體可含有便於其在原核細胞和真核細胞中複製的額外序列，例如藥物選擇標記(例如大腸桿菌中的氨苄青黴素抗性，或哺乳動物細胞中的G-418抗性)和複製起點(例如用於在原核細胞中複製的colE1，用於在哺乳動物細胞中複製的oriP)。
動物啟動子可用於在乳腺組織中表達ng.HuAFP的啟動子包括天然驅動乳腺特異性多肽(例如乳蛋白)表達的啟動子，儘管可以使用能將ng.HuAFP分泌到乳汁中的任何啟動子。這些啟動子包括例如天然指導以下蛋白表達的啟動子乳清酸性蛋白(WAP)、αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白(參見例如Drohan等，美國專利第5,589,604號；Meade等美國專利第4,873,316號；Karatzas等，美國專利第5,780,009號)和美國專利第5,750,172號中描述的其它啟動子。乳清酸性蛋白(WAP；Genbank檢索號X01153)是齧齒動物的主要乳清蛋白，在妊娠後期和哺乳期專一在乳腺中以高水平表達(Hobbs等，J.Biol.Chem.2573598-3605，1982)。有關理想的乳腺特異性啟動子的其它信息，參見例如Richards等，J.Biol.Chem.256526-532，1981(大鼠α-乳清蛋白)；Campbell等，Nucleic Acids Res.128685-8697，1984(大鼠WAP)；Jones等，J.Biol.Chem.2607042-7050，1985(大鼠β-酪蛋白)；Yu-Lee和Rosen，J.Biol.Chem.25810794-10804，1983(大鼠γ-酪蛋白)；Hall，Biochem.J.242735-742，1987(人α-乳清蛋白)；Stewart，Nucleic Acids Res.123895-3907，1984(牛α-S1和κ-酪蛋白cDNA)；Gorodetsky等，Gene 6687-96，1988(牛β-酪蛋白)；Alexander等，Eur.J.Biochem.178395-401，1988(牛κ-酪蛋白)；Brignon等，FEBS Lett.18848-55，1977(牛α-S2酪蛋白)；Jamieson等，Gene 6185-90，1987，Ivanov等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369425-429，1988，和Alexander等，Nucleic Acids Res.176739，1989(牛β-乳球蛋白)；Vilotte等，Biochimie 69609-620，1987(牛α-乳清蛋白)。Mercier和Vilotte(J.Dairy Sci.763079-3098，1993)綜述了各種乳蛋白基因的結構和功能。如果額外的側翼序列用於優化表達的話，所述序列可採用現有序列作為探針來進行克隆。可使用已知關聯核苷酸序列、或關聯蛋白的抗體作為探針，通過篩選不同生物的文庫，得到這些生物的乳腺特異性調節序列。
可用於表達ng.HuAFP並將其分泌到乳汁中的信號序列是乳特異性信號序列。理想的是，所述信號序列選自乳特異性信號序列，即來自分泌到乳汁中的蛋白的編碼基因。最理想的是，所述乳特異性信號序列與上述乳汁特異性啟動子相關。所述信號序列的大小對本發明並不重要。所需要的不過是所述序列具有足夠大小以影響ng.HuAFP在例如乳腺組織中的分泌。例如，來自編碼以下蛋白的基因的信號序列可用於本發明酪蛋白(例如α酪蛋白、β酪蛋白、γ酪蛋白或κ酪蛋白)、β乳球蛋白、乳清酸性蛋白和乳清蛋白。也可使用來自其它分泌蛋白(例如肝細胞、腎細胞或胰腺細胞分泌的蛋白)的信號序列。
可用於在泌尿組織中表達重組多肽轉基因的啟動子是尿斑蛋白啟動子和尿調蛋白啟動子(Kerr等，Nat.Biotechnol.1675-79，1998；Zbikowska，等，Biochem.J.3657-11，2002；Zbikowski等，TransgenicRes.11425-435，2002)，儘管可以使用能將轉基因產物分泌到尿液中的任何啟動子。
可用於通過血液產生細胞或血清產生細胞(例如肝上皮細胞)表達ng.HuAFP並將其分泌到血液中的啟動子是清蛋白啟動子(參見例如Shen等，DNA 8101-108，1989；Tan等，Dev.Biol.14624-37，1991；McGrane等，TIBS 1740-44，1992；Jones等，J.Biol.Chem.26514684-14690，1990；Shimada等，FEBS Letters 279198-200，1991)，儘管可以使用能將轉基因產物分泌到血液中的任何啟動子。也可以使用天然甲胎蛋白啟動子(參見例如Genbank檢索號AB053574、AB053573、AB053572、AB053571、AB053570和AB053569)。
可用於在精液中表達ng.HuAFP的啟動子描述於美國專利第6,201,167號。
有用的禽類特異性啟動子是卵清蛋白啟動子和apo-B啟動子。其它禽類特異性啟動子是本領域已知的。卵清蛋白啟動子可用於指導ng.HuAFP的表達，然後將其沉積在卵的卵白中。apo-B啟動子也可用於指導重組多肽在肝臟中的表達，其中它將最終沉積在卵黃中。禽類的卵是表達大量重組多肽的最佳載體，其原因如下(1)大量蛋白包裝在每個卵中，(2)能容易而非侵入性地收集卵並可儲藏較長時間，和(3)卵是無菌的，而且與乳汁不同，卵不含細菌汙染物。具體地講，對於每個卵，鳥可在輸卵管中產生3克清蛋白，其中50％以上的是卵清蛋白。另外在肝中產生3克(血清脂蛋白)並沉積在卵黃中。另外，因為鳥類與哺乳動物的進化差異，所以它們通常在免疫上不能識別哺乳動物蛋白，所以在鳥中表達ng.HuAFP，對鳥的生存和健康的不利影響更小。
用於本發明方法的其它啟動子包括誘導型啟動子。通常，重組蛋白在大多數真核表達系統中以組成型方式表達。加入誘導型啟動子或增強子元件，對ng.HuAFP的過量表達提供了時間或空間控制，並且提供替代的表達機制。誘導型啟動子包括熱激蛋白、金屬硫蛋白和MMTV-LTR，而誘導型增強子元件包括用於蛻皮素、幕黎甾酮A和四環素/強力黴素的元件。
Tet-On和Tet-Off基因表達系統(Clontech)是用於本發明方法的誘導系統的實例之一。該系統使用四環素(Tc)效應元件，以開(組成型關閉，用Tc誘導)或關(組成型打開，被Tc或強力黴素阻抑)的方式維持ng.HuAFP表達。
也可將選擇標記摻入到ng.HuAFP轉基因中，以便易於鑑定轉化的細胞。選擇標記通常有兩個功能性類別隱性和顯性。隱性標記通常是編碼在宿主細胞(缺乏「標記」產物或功能的細胞)中不產生的蛋白的基因。胸苷激酶(TK)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(APRT)和次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT)的標記基因屬於此類。顯性標記包括編碼賦予生長抑制化合物(抗生素、藥物)抗性的產物的基因和/或允許宿主細胞在代謝限制環境中生長的基因。常用的此類標記包括突變型DHFR基因(所述基因賦予對甲氨蝶呤的抗性)；黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶的gpt基因(所述基因允許宿主細胞在含有黴酚酸/黃嘌呤的培養基上生長)；和用於氨基糖苷3′-磷酸轉移酶的neo基因(所述基因可賦予對以下藥物的抗性G418、慶大黴素、卡那黴素和新黴素)。
轉基因動物的產生通常通過微注射，將轉基因構建體導入細胞中(Ogata等，美國專利第4,873,292號)。然後將微注射的胚胎轉移到合適的母體中，結果生出轉基因動物或嵌合動物，這取決於所述轉基因整合時胚胎的發育期。可以讓嵌合動物交配，以繁育出真正的種系轉基因動物。
在某些轉基因方法中，將轉基因導入受精卵母細胞的原核中。對於某些動物例如小鼠來說，受精是在體內進行，受精卵經手術取出。在其它動物中，卵可以從活體中取出，或者從剛死的動物(例如屠宰場)中取出並在體外受精。
或者，可以將轉基因導入胚胎幹細胞(ES細胞)中。可以通過電穿孔、微注射、核轉移或技術人員已知的用於轉染細胞的任何其它技術，將轉基因導入所述細胞中。轉化細胞與其起源相同的動物的胚泡結合。轉化細胞定植在胚胎中，在某些胚胎中，這些細胞形成所得嵌合動物的生殖細胞(Jaenisch，R.，Science 2401468-1474，1988)。
含有ng.HuAFP轉基因的ES細胞也可用做核源，移植到去核受精卵母細胞中，由此產生轉基因動物。更通常的是，來自胚胎、胎兒或成體組織並含有rHuAFP轉基因的任何二倍體細胞都可以導入去核未受精的卵中。將克隆的胚胎植入合適母體並讓其妊娠，由此產生完全的轉基因動物(Wilmut等，Nature 385810-813，1997)。
一般而言，任何轉基因的表達都取決於其整合位置和拷貝數。當通過傳統方法(例如原核注射或產生嵌合胚胎)，得到具有合適轉基因表達水平和組織特異性轉基因表達模式的轉基因動物之後，繁殖所述動物，以便得到具有相同轉基因表達水平和模式的子代。該方法有一些局限。首先，在缺乏轉基因生殖細胞的轉基因嵌合體中，轉基因不能遺傳給子代。第二，因為讓雜合轉基因建立者與非轉基因動物交配，僅有半數子代是轉基因的。第三，妊娠周期長短和每次懷孕的子代數量進一步限制了轉基因子代數量。最後，性別也限制了有用的轉基因子代的數量。例如，只有雌性動物可用於產生在乳汁中表達的ng.HuAFP。因為諸多局限，核轉移技術提供了優勢，即在相對短的時間中，能夠產生大量的遺傳上相同的雌性轉基因動物。
也可通過將轉基因直接轉移到分娩後動物的乳腺組織中，產生在其乳汁中表達ng.HuAFP的動物(Karatzas等，美國專利第5,780,009號)。所述動物在其生殖細胞中不含轉基因，因而不產生轉基因子代。
任何動物都可用於本發明。最好優選產生大量生物體液(例如乳汁)的動物。優選的動物是鳥類、爬行動物和兩棲動物、以及反芻動物、有蹄類動物、馴養的哺乳動物和產奶動物。合適的鳥類包括雞、鵝、火雞、鵪鶉、鴨和鴕鳥。特別優選的動物包括小鼠、山羊、綿羊、駱駝、母牛、豬、兔、馬、公牛和美洲駝。當然，這其中的各動物並不是同樣有效表達ng.HuAFP的。例如，具體的生物體液特異性啟動子(例如乳汁特異性啟動子、尿液特異性啟動子、血液特異性啟動子或淋巴液特異性啟動子)或信號序列在一種哺乳動物可能比在其它動物中更有效。然而，本領域技術人員可以通過本發明的以下描述和現有技術的知識容易地進行選擇。當ng.HuAFP分泌到轉基因動物的乳汁、尿液、血液或淋巴液中時，所述動物每年應能產生至少1升、更好至少10升、25升或50升、最好100升、500升、1000升或10,000升或更多的乳汁、尿液、血液或淋巴液。最好從生物體所產生的產物中回收ng.HuAFP，所述產物例如乳汁、尿液、血液、羊膜液、或卵的卵黃囊、絨毛膜或尿囊周圍的液體，但也可以從種子、毛髮、組織或卵中回收。
可以產生在兩種或三種生物體液中(例如在乳汁和尿液中，在乳汁和血液中，或在乳汁、尿液和血液中)產生ng.HuAFP的轉基因動物。構建所述動物的方法之一是用至多3個構建體轉化動物的胚胎細胞，其中所述構建體選自ng.HuAFP核酸分子，所述分子由能夠從以下細胞表達和分泌重組多肽的啟動子指導乳汁產生細胞、尿液產生細胞或血液產生細胞。按照該方法，雙重或三重轉化的細胞用於產生能在一種或多種其生物體液中表達ng.HuAFP的轉基因動物。
因此，向哺乳動物(例如反芻動物)受精卵中微注射(或共微注射(co-microinjected))表達ng.HuAFP的2個或3個核酸分子，所述分子處於一個或多個例如以下啟動子的控制下乳汁特異性啟動子、尿液特異性啟動子、血液特異性啟動子或淋巴液特異性啟動子。所產生的轉基因動物將在其一種或多種乳汁、尿液、血液或淋巴液中分泌/產生ng.HuAFP。這將增加單位轉基因動物產生ng.HuAFP的總產量。
這種能在一種或多種生物體液中產生ng.HuAFP的動物的第二個產生方法是獨立產生胚胎幹細胞，所述幹細胞攜帶能表達ng.HuAFP並將其分泌到生物體液產生細胞(例如乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞)中的構建體。然後將一種或多種轉化ES細胞類型與來自其相同來源的動物的胚泡結合，產生嵌合動物，然後將其繁育到純合型。
這類雙重或三重表達的動物具有若干優點。首先，兩種性別的動物從其出生開始均可在尿液或血液等中產生ng.HuAFP，而雌性動物在泌乳的成年期還能在乳汁等中產生ng.HuAFP。其次，按照重組多肽變化的需要，可以增加(通過誘導泌乳)或減少(通過不誘導泌乳)任何單個雌性動物所產生的ng.HuAFP的數量。
在例如以下文獻中可以找到產生轉基因動物的方案White和Yannoutsos，Current Topics in Complement Research64th Forum inImmunology，第88-94頁；Bader和Ganten，Clinical and ExperimentalPharmacology and Physiology，增刊3S81-S87，1996；TransgenicAnimal Technology，A Handbook，1994，Carl A.Pinkert編著，AcademicPress，Inc；美國專利第5,523,226號；美國專利第5,530,177號；美國專利第5,573,933號；PCT申請WO93/25071；PCT申請WO95/04744。產生轉基因動物的其它方法是本領域已知的(參見例如Love等，Biotechnology 1260-63，1994；Naito等，Mol.Reprod.Dev.39153-161，1994；Chang等，Cell Biol.Int.21495-499，1997；Carscience等，Development 117669-675，1993；Pain等，Cell，Tissues，Organs 165212-219，1999；Pettite等，Development 108185-189，1990；Pettite等，載於Transgenic Animal Research Conference III(Tahoe City)，第32-33頁，2001；Wright等，BioTechnology 9830-83，1991；Pursel等，J.Anim.Sci.71增刊31-9，1993；Wall等，Theriogenology 557-968，1996；Campbell等，Nature 38064-66，1996；Wilmut等，Nature 385810-813，1997；Cibelli等，Science 2801256-1258，1998；Wakayama等，Nature394369-374，1998)。
篩選表達ng.HuAFP的轉基因動物產生候選轉基因動物後，必須對其進行篩選，以便檢測其細胞中含有並表達轉基因的動物。通常可通過DNA印跡分析或通過使用PCR擴增候選轉基因動物的DNA，檢測動物組織中轉基因的存在(參見例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，New York，NY，1998；另見Lubon等，U.S.P.N.5,831,141)。可通過任何標準免疫測定法，例如ELISA或蛋白質印跡分析，使用針對人AFP的抗體，測定乳汁、尿液、血液或淋巴液中表達的ng.HuAFP(參見例如Murgita等，U.S.P.N.5,384,250和Ausubel等，出處同上)。基於ELISA測定法，測定乳汁中轉基因編碼蛋白的工作實例，可參見Drohan等，U.S.P.N.5,589,604。
轉基因植物使用本發明的構建體，許多植物宿主都可用於產生ng.HuAFP，所述植物宿主包括但不限於藻類、樹木類、觀賞植物類、溫帶水果類、熱帶水果類、蔬菜類、豆類、十字花科植物、單子葉植物、雙子葉植物或任何商業或農業用植物。合適植物宿主的特別實例包括但不限於松、矮牽牛、番茄、馬鈴薯、菸草、萵苣、向日葵、油菜、亞麻、棉花、甜菜、芹菜、大豆、苜蓿、蓮藕、黃瓜、胡蘿蔔、茄子、花椰菜、辣根、牽牛、白楊、核桃、蘋果、葡萄、蘆筍、水稻、玉米(maize)、小米、洋蔥、大麥、鴨茅草、燕麥、黑麥、小麥、玉米(corn)、苜蓿、草坪草、能夠進行營養體增殖的水生植物、滿江紅、浮稻、水葫蘆、西瓜、生長在水下的開花植物，以及來自以下的種屬擬南芥屬、苜蓿屬、豇豆屬、草莓屬、蓮屬、驢食豆屬、三葉草屬、胡盧巴屬、柑橘屬、亞麻屬、老鸛草屬、木薯屬、胡蘿蔔屬、芸苔屬、蘿蔔屬、白芥屬、顛茄屬、天仙子屬、番茄屬、菸草屬、茄屬、碧冬茄屬、毛地黃屬、Majorana、Ciohorium、向日葵屬、萵苣屬、雀麥屬、金魚草屬、Hererocallis、龍面花屬、天竺葵屬、黍屬、狼尾草屬、毛茛屬、千裡光屬、喇叭花屬、甜瓜屬、Browaalia、大豆屬、黑麥草屬、玉蜀黍屬、小麥屬、高粱屬和曼陀羅屬。
可以從能夠產生ng.HuAFP的任何轉基因植物中得到植物提取物。另外，如下所述，在植物中可表達轉基因構建體，以產生ng.HuAFP，其可以從植物組織或從植物分泌物中分離。
植物啟動子已經從不同植物中鑑定並分離出多種植物啟動子，其描述可參見各專利，例如美國專利第5,391,725、5,536,653、5,589,583、5,608,150、5,898,096、6,072,050、6,184,440和6,331,663號。理想的植物啟動子包括強植物啟動子和非組織特異性或發育特異性植物啟動子(例如在許多或所有植物組織類型中強表達的啟動子)。理想的植物啟動子包括花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)和19S(CaMV 19S)基因啟動子，所述啟動子使幾乎所有植物組織以高水平表達(Benefey等，Science 250959-966，1990；Odell等，Nature 313810-812，1985；Jensen等，Nature 321669-674，1986；Jefferson等，EMBO J.63901-3907，1987；Sanders等，Nuc.Acids Res.141543-1558，1987)。在CaMV 35S啟動子中，發現結構域A(-90至+8)賦予的表達在根部組織特別強烈，而結構域B(-343至-90)賦予的表達看來在種子的子葉和幼苗以及在下胚軸的維管組織中最強(Benfey等，EMBO J.82195-2202，1989)。此外，通過CaMV 35S啟動子的加倍，還可進一步增強該啟動子的活性(即2-10倍之間)(參見例如Kay等，Science 2361299，1987；Ow等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.844870，1987；Fang等，Plant Cells 1141，1989)。
其它理想的植物啟動子包括例如T-DNA甘露氨酸合成酶啟動子和各種衍生物；誘導型啟動子，例如玉米穀胱甘肽-S-轉移酶同工型II(GST-II-27)基因啟動子，其在響應外源安全劑的應用而被激活(WO93/01294，ICI Ltd)；GST-II-27基因啟動子，其被某些用於促進植物生長的化合物誘導；地塞米松(DEX)啟動子(Aoyama等，PlantJournal 11605-612，1997)；伸長組織特異性啟動子(例如細胞啟動子)；查耳酮合酶啟動子(CHS)；和來自馬鈴薯的PATATIN啟動子(Rocha-Sosa等，EMBO J.823-29，1989)，當希望在伸長組織和器官中表達時可採用該啟動子。
其它合適的植物啟動子包括例如胭脂鹼合酶(NOS)啟動子和章魚鹼合酶(OCS)啟動子(其攜帶於根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的根瘤誘導質粒上；Ha和An，Nucleic Acids Res.17215-224，1989；An等，Plant Physiol.88547-552，1988)；馬鈴薯葉/莖(ST-LS)1基因(Stockhaus等，Plante Cell 1805-814，1989)；大豆熱激蛋白hsp17.5-E或hsp17.3-B啟動子(Gurley等，Mol.Cell Biol.6559-565，1986)；Parasponia andersoni血紅蛋白啟動子(Landsmann等，Mol.Gen.Genet.21468-73，1988)；苯丙氨酸氨裂合酶啟動子(其在響應創傷而積累苯丙酸類衍生物的特定細胞類型中並且在木質部和花的正常發育過程中有活性)(Bevan等，EMBO J.81899-1906，1989)；碧冬茄5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶基因啟動子(Benfey和Chua，Science244174-181，1989)；蔗糖合酶啟動子。所有這些啟動子都已用於產生在植物中表達的各類DNA構建體(參見例如PCT申請WO84/02913)。
對於某些應用來說，最好是在合適植物組織中以合適水平或在合適的發育時期調節ng.HuAFP的產生。為了達到該目的，對基因啟動子進行了分類，每種在其具體的調節序列中各有自己的獨特特徵，顯示出在響應環境、激素和/或發育信號時被調節。這其中包括負責熱調節基因表達的基因啟動子(參見例如Takahashi和Komeda，Mol.Gen.Genet.219365-372，1989)；負責光調節基因表達的基因啟動子(例如擬南芥Cab2光合作用、葉特異性啟動子)；描述於以下文獻的玉米rbcS啟動子Schffner和Sheen，Plant Cell 3997-1012，1991；豌豆rbcS-3A；來自核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBICSO，一種十分豐富的植物多肽；Coruzzi等，EMBO J.31671-1679，1984；Herrera-Estrella等，Nature 310115-120，1984)的光誘導型啟動子；集光葉綠素蛋白複合體的葉綠素a/b結合蛋白(Cab)(Apel等，Eur.J.Biochem.85581-588，1978；Stiekema等，Plant Physiol.72717-724，1983；Thompson等，Planta 158487-500，1983；Jones等，EMBO J.42411-2418，1985)；或存在於豌豆中的葉綠素a/b結合蛋白基因，其描述於Simpson等，EMBO J.42723，1985；來自以下文獻描述的小麥Em基因的激素調節基因表達(例如脫落酸(ABA)效應序列Marcotte等，Plant Cell 1969-976，1989；ABA-誘導型HVA1和HVA22以及描述於以下文獻的大麥和擬南芥的rd29A啟動子Straub等，Plant Mol.Biol.26617-630，1994，Shen等，Plant Cell 7295-307，1995；創傷誘導的基因表達(例如Siebertz等，Plant Cell 1961-968，1989中描述的wunI的基因表達)，器官特異性基因表達；玉米23-kDa玉米醇溶蛋白基因；或以下文獻描述的法國豆β-菜豆蛋白基因Bustos等，Plant Cell 1839-853，1989；以下文獻描述的營養儲藏蛋白啟動子(大豆vspB)Sadka等，Plant Cell 6737-749，1994)，循環啟動子(例如描述於以下文獻的擬南芥cdc2a啟動子Hemerly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893295-3299，1992)；衰老特異性啟動子(例如描述於以下文獻的擬南芥SAG12啟動子Gan等，Science 2701986-1988，1995)；種子特異性啟動子(例如胚乳特異性啟動子或胚特異性啟動子)；或病原體誘導型啟動子(例如，PR-1或b-1，3葡聚糖酶啟動子)。
廣泛用於植物細胞轉化的兩個其它啟動子是編碼醇脫氫酶AdhI和AdhII的基因的啟動子。這兩個基因是在無氧生活開始後誘導的。在本發明再一個實施方案中，有利的是用操作性連接修飾或人工植物啟動子的ng.HuAFP轉基因構建體轉化植物。通常用不同植物啟動子的重組結構元件構建的所述啟動子具有天然植物啟動子所不具備的獨特的表達模式和/或水平(參見Salina等，Plant Cell 41485-1493，1992，例如用順式調節元件和啟動子核心聯合構建的人工啟動子)。
也已觀察到某些細菌啟動子能在植物中表達，所述啟動子包括美國專利第4,782,022號中介紹的苜蓿中華根瘤菌FIXD基因啟動子。在髮根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)中已經鑑定了一些啟動子序列，稱為rol A、B和C啟動子(參見例如Schmulling等，Plant Cell 1665-670，1989；Sugaya等，Plant Cell Physiol.30649-654，1989)。Sugaya等(出處同上)介紹的rol C啟動子位於細菌Ri質粒上，已知能在韌皮部細胞中表達。其它合適的啟動子對於本領域技術人員來說是眾所周知的。
另外，根據本發明，ng.HuAFP可以從表達的植物細胞中分泌，其通過將ng.HuAFP核酸序列與任何合適的分泌信號肽融合而實現。
用於表達本發明ng.HuAFP轉基因構建體的材料可得自眾多來源，包括美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockland，MD)；或得自任何種子公司，例如W.Atlee Burpee Seed Co.(Warminster，PA)、Park Seed Co.(Greenwood，SC)、Johnny Seed Co.(Albion，ME)或Northrup King Seeds(Harstville，SC)。
以下文獻介紹了用於產生轉基因植物的方法Ausubel等，出處同上；Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989；GeMn等，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，1990；Kindle，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA871228-1232，1990；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biology 42205，1991；BioRad(Hercules，CA)Technical Bulletin #1687(生物射彈顆粒傳遞系統)。表達載體可選自以下文獻中提供的載體例如載於Cloning VectorsA Laboratory Manual(Pouwels等，1985，附錄，1987)；Clontech Molecular Biology Catalog(Catalog 1992/93 Toolsfor the Molecular Biologist，Palo Alto，CA)；及其中引用的參考文獻。其它表達構建體描述於Fraley等(美國專利第5,352,605號)。
適於建立轉基因植物的各種載體是公眾可獲得的，以下文獻中介紹了所述載體Pouwels等(出處同上)、Weissbach和Weissbach(出處同上)和Gelvin等(出處同上)。可以修飾這些植物表達載體以便用於本發明，所述載體包括(1)編碼ng.HuAFP的核酸序列，(2)啟動子(例如賦予以下類型的表達的啟動子誘導型或組成型表達、病原體或創傷誘導型表達、環境或發育調節型表達、或者細胞特異性或組織特異性表達)，(3)指導ng.HuAFP分泌的信號序列，(4)顯性選擇標記，(5)轉錄起始位點，(6)核糖體結合位點，(7)RNA加工信號，(8)轉錄終止位點，和/或(9)聚腺苷酸化信號。所述啟動子和信號序列與ng.HuAFP核酸序列操作性連接。
為了在發育、細胞、組織、激素或環境表達中應用，合適的5′上遊非編碼區得自其它基因，例如得自在分生組織發育、種子發育、胚發育或葉片發育中被調節的基因。
植物表達載體也可任選包括RNA加工信號，例如內含子，其在有效的RNA合成和積累中已顯示出重要性(Callis等，Genes and Dev.11183-1200，1987)。RNA剪接序列的位置可以顯著地影響ng.HuAFP轉基因在植物中的表達水平。鑑於這一事實，內含子可位於ng.HuAFP轉基因內調節子編碼序列的上遊或下遊，以調節基因表達水平。
另外，表達載體可包括5′和3′調節控制序列，所述序列通常存在於植物基因的5′區和3′區(An等，Plant Cell 1115-122，1989)。例如，表達載體中可包括3′終止區，以增加mRNA的穩定性。一個這樣的終止區可衍生自馬鈴薯PI-II終止區。另外，其它常用終止子可衍生自章魚鹼合酶信號或胭脂鹼合酶信號。
植物表達載體通常也含有顯性選擇標記基因，用於鑑定已被轉化的細胞。用於植物系統的選擇性基因包括編碼抗生素抗性基因的基因，例如編碼抗以下抗生素的基因潮黴素、卡那黴素、博來黴素、G418、鏈黴素或壯觀黴素。光合作用所需基因在光合作用缺陷株中也可用作選擇標記。最後，編碼除草劑抗性的基因可用作選擇標記；有用的除草劑抗性基因包括編碼膦絲菌素乙醯轉移酶並賦予對廣譜除草劑BASTA(Hoechst AG，Frankfurt，Germany)的抗性的bar基因。
有效使用選擇標記，有利於測定植物細胞對特定選擇試劑的敏感性並確定該試劑殺死大多數(如果不是全部的話)轉化細胞的有效濃度。一些用於菸草轉化的抗生素的有效濃度包括例如75-100μg/ml(卡那黴素)、20-50μg/ml(潮黴素)或5-10μg/ml(博來黴素)。以下文獻描述了選擇除草劑抗性轉化子的有效策略例如Vasil I.K.，Cell Cultureand Somatic Cell Genetics of Plants，第I、II、III卷，LaboratoryProcedures and Their Applications Academic Press，New York，1984。
植物轉化對於植物表達載體的構建，幾個標準方法可用於將載體導入植物宿主，從而產生轉基因植物。一般而言，參見Methods in Enzymology第153卷(″Recombinant DNA Part D″)1987，Wu和Grossman編著，Academic Press and European Patent Application EP 693554。這些方法包括(1)土壤桿菌介導的轉化(根癌土壤桿菌或髮根土壤桿菌)(參見例如Lichtenstein和Fuller，載於Genetic Engineering，第6卷，PWJ Rigby主編，London，Academic Press，1987；Lichtenstein，C.P.和Draper，J，.載於DNA Cloning，第II卷，D.M.Glover主編，Oxford，IRI Press，1985；Horsch等，Science 233496-498，1984；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803，1983)；(2)粒子傳遞系統(參見例如Gordon-Kamm等，Plant Cell 2603，1990；Klein等，Nature 32770-73，1987)；或BioRadTechnical Bulletin 1687，出處同上)；(3)微注射方案(參見例如Green等，出處同上)；(4)聚乙二醇(PEG)方法(參見例如Draper等，Plant CellPhysiol.23451，1982；Paszkowski等，EMBO J.32712-2722，1984；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76835，1988)；(5)脂質體介導的DNA攝入(參見例如Freeman等，Plant Cell Physiol.251353，1984)；(6)電穿孔方案(參見例如Gelvin等，出處同上；Dekeyser等，出處同上；Fromm等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 825824，1985；Fromm等，Nature 319791，1986；Sheen，Plant Cell 21027，1990；Jang和Sheen，Plant Cell 61665，1994)；(7)渦旋方法(參見例如Kindle，出處同上)，和花浸泡(floraldip)方法(參見例如Clough和Bent，Plant J.16735-743，1998)。轉化方法對本發明來說並不重要。任何方法，只要能提供有效轉化，都可以採用。因為新方法可用於轉化作物或其它宿主細胞，所以它們可直接使用。
下面概述一個具體技術的實例，即土壤桿菌介導的植物轉化。採用該項技術，將基因轉化到植物細胞基因組中的通用方法分成兩步。首先，在大腸桿菌中進行克隆和DNA修飾步驟，然後將含有目標基因構建體的質粒通過接合或電穿孔轉移到土壤桿菌中。第二步，所得土壤桿菌菌株用於轉化植物細胞。因此，對於通用型植物表達載體來說，所述質粒含有複製起點(允許其在土壤桿菌中複製)和高拷貝數的複製起點(其在大腸桿菌中起作用)。這方便了在大腸桿菌中進行轉基因製備和檢測，然後再轉移到土壤桿菌中供隨後導入植物中。所述載體可攜帶抗性基因，一個用於細菌選擇，例如鏈黴素，而另一個在植物中起作用，例如編碼卡那黴素抗性或除草劑抗性的基因。載體上也可存在限制性內切核酸酶位點，用於添加一個或多個轉基因和定向T-DNA邊界序列(border sequence)，所述序列當被土壤桿菌轉移功能識別時，能確定將轉移到植物中的DNA區。
在另一個實例中，植物細胞可通過將沉積有克隆DNA的鎢微粒轟擊到細胞中而進行轉化。在轟擊所用的Biolistic Apparatus(Bio-Rad)中，裝滿火藥(22口徑Power Piston Tool Charge)或氣動爆破驅動塑料微粒通過槍筒。沉澱有DNA的鎢微粒的等分懸浮液放在塑料微粒前端。後者在有孔的丙烯酸填料板上點火，所述孔非常小，不能讓微粒通過。結果，塑料微粒擊碎填料板，鎢微粒通過板上的孔持續射向其靶標。對於本發明來說，靶標可以是任何植物細胞、組織、種子或胚。在微粒上導入細胞的DNA整合到細胞核或葉綠體中。
一般而言，目前，轉基因在植物細胞中的轉移和表達對於本領域技術人員來說是常規操作，業已成為植物基因表達研究和產生農業或商業用改良植物品種的主要工具。
可以評價轉基因細胞系的ng.HuAFP表達水平。首先測定RNA水平的表達，以鑑定和定量測定表達陽性植物。採用RNA分析的標準技術，包括PCR擴增測定和溶液雜交測定，前者使用設計用來僅擴增轉基因RNA模板的寡核苷酸引物；後者使用轉基因特異性探針(參見例如Ausubel等，出處同上)。然後通過蛋白質免疫印跡分析，使用特異性抗體，分析RNA陽性植物的蛋白表達(參見例如Ausubel等，出處同上)。另外，可以按照標準方案，分別使用ng.HuAFP特異性核苷酸探針和抗體，進行原位雜交和免疫細胞化學，以確定轉基因組織內表達的位點。
轉基因植物的再生按照標準植物組織培養技術，植物表達載體轉化的植物細胞可以從單細胞、愈傷組織或葉圓盤(leaf discs)等再生。本領域眾所周知的是，來自幾乎所有植物的各種細胞、組織和器官都可以成功培養，以再生出完整的植株；所述技術描述於例如Vasil等，出處同上；Green等，出處同上；Weissbach和Weissbach，出處同上；Gelvin等，出處同上；Methods in Enzymology第153卷，Wu和Grossman編輯，AcademicPress，1987；Methods in Enzymology，第118卷，Wu和Grossman編輯，Academic Press，1987。以下文獻介紹了從培養的原生質體再生植物Evans等，Handbook of Plant Cell Cultures 1124-176，MacMillanPublishing Co.New York，1983；Davey，Protoplasts(1983)-LectureProceedings，第12-29頁，Birkhauser，Basal，1983；Dale，Protoplasts(1983)-Lecture Proceedings，第31-41頁，Birkhauser，Basel，1983；Binding，Plant Protoplasts，第21-73頁，CRC Press，Boca Raton，1985。
從生物體液中純化AFP可使用標準蛋白質純化技術例如親和色譜法(參見例如Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley Sons，NewYork，NY，1998；另見Lubon等，U.S.P.N.5,831,141)或本領域技術人員已知的蛋白質純化的其它方法，從轉基因生物的生物體液中純化ng.HuAFP。當分離ng.HuAFP後，必要時，可通過例如高效液相色譜法(HPLC；例如參見Fisher，Laboratory Techniques In Biochemistryand Molecular Biology，Work和Burdon編著，Elsevier，1980)進一步純化。純化後，ng.HuAFP的純度至少為80％，優選90％，更優選95％，最優選99％。
從轉基因生物的生物體液中純化的ng.HuAFP的用途分泌到轉基因生物(例如哺乳動物)的生物體液(例如乳汁、尿液、血液或淋巴液)中的或者可以從生物體液中純化的ng.HuAFP可用作治療藥。例如，可以將本發明方法產生的ng.HuAFP給予需要抑制癌細胞生長的患者，以誘導骨髓細胞增殖(例如在骨髓移植之後，或者在給予化療或放療等骨髓毒性治療之後)，或者作為免疫移植藥(例如抑制自體反應性免疫細胞增殖，抑制移植器官排斥(例如移植物抗宿主病)或治療類風溼性關節炎、肌營養不良、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力或胰島素依賴性糖尿病)。
生物體液(例如乳汁、尿液、血液或淋巴液)中存在的或從中純化的ng.HuAFP可以通過技術人員已知的常規方法，以有效量單獨給予或與藥物可接受的載體或稀釋劑聯合、或者與其它治療藥聯合給予。
治療有效量的ng.HuAFP或其藥物可接受的鹽的藥物製劑可與適於常規給藥的藥物可接受的載體一起經以下途徑給予口服、胃腸外(例如肌內、腹膜內、靜脈內或皮內；皮下注射；吸入；或通過使用滴眼劑或植入物)、鼻腔、陰道、直腸、舌下或局部。含有治療有效量的ng.HuAFP的藥物製劑最好通過皮下、肌內或靜脈內給予。
在以下文獻中可找到本領域眾所周知的製劑製備方法例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版)，A.Gennaro編著，1990，Mack Publishing Company，Easton，PA。按照本領域已知用於製備藥物組合物的任何方法，可以固體或液體形式製備供口服用的組合物。組合物可任選含有甜味劑、矯味劑、著色劑、香料和/或防腐劑，以便提供更具適口性的製劑。供口服給藥用的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、粉劑和顆粒劑。在所述固體形式中，將ng.HuAFP與至少一種惰性藥物可接受的載體或賦形劑混合。這其中可包括例如惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、蔗糖、澱粉、磷酸鈣、磷酸鈉或高嶺土。也可使用粘合劑、緩衝劑和/或潤滑劑(例如硬脂酸鎂)。還可用腸溶衣來製備片劑和丸劑。可用增強劑來製備供口服用的組合物，以利於將ng.HuAFP吸收到受體血流中。
供口服給藥的液體劑型包括藥物可接受的乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和軟質明膠膠囊劑。這些形式含有本領域常用的惰性稀釋劑，例如水或油性介質。除了所述惰性稀釋劑之外，組合物也可包括輔料，例如潤溼劑、乳化劑和懸浮劑。
供胃腸外給藥用的製劑包括無菌水性或非水溶液劑、混懸劑或乳劑。合適溶媒的實例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油、明膠、氫化萘和注射用有機酯，例如油酸乙酯。所述製劑也可含有輔料，例如防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑。可使用生物相容的、生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，以控制組合物中ng.HuAFP或其它活性化合物的釋放。其它用於含有ng.HuAFP的組合物的潛在的胃腸外給藥系統包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸注系統和脂質體。
可通過例如截留細菌的濾器過濾、通過向組合物中摻入消毒劑、或者通過將組合物進行輻照或加熱，可以對液體製劑進行滅菌。或者，它們可以製備成無菌形式的固體組合物，臨用前將其溶於無菌水或其它無菌注射介質中。
供直腸或陰道給藥用的組合物最好是栓劑，除了活性物質外，還可含有賦形劑，例如可可脂或栓劑用蠟。供鼻腔或舌下給藥用的組合物也可用本領域已知的標準賦形劑製備。吸入製劑可含有賦形劑，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘油膽酸酯和脫氧膽酸的水溶液劑，或者可以是油溶液劑，用於以滴鼻劑或噴霧劑或凝膠劑形式給藥。
組合物中ng.HuAFP的用量可以不同。本領域技術人員將會理解，可以依據給藥時間、給藥途徑、製劑的特性、排洩率、患者病症的特點和患者年齡、體重、健康狀況和性別等各種因素，對準確的個人劑量稍微進行調整。通常，給予的日劑量水平為0.1μg/kg至100mg/kg體重，可作為單劑量或分成多次劑量。對於大多數治療來說，預期每周給予一次或兩次的胃腸外劑量為10μg/kg至5.0mg/kg體重。預期對於某些疾病可以給予高劑量(高達5mg/kg)，以允許至多每月給予一次。考慮到各給藥途徑的效果不同和待治療疾病不同，預期所需劑量可有很大差異。例如，預期口服給藥通常比靜脈內注射需要較高劑量水平。這些劑量水平的差異將採用本領域眾所周知的標準經驗性途徑來調節。一般而言，ng.HuAFP的精確治療有效量由主治醫師根據上述因素來確定。
ng.HuAFP可以以緩釋組合物形式給予，例如美國專利第5,672,659號和美國專利第5,595,760號中描述的那些組合物。速釋組合物或緩釋組合物的使用取決於待治療病症的類型。如果病症是急性或超急性(over-acute)疾病的話，則需要用速釋形式而不是用緩釋組合物進行治療。或者，對於預防性治療或長期治療而言，則通常需要緩釋組合物。
實施例以下實施例用於舉例說明本發明，不得解釋為以任何方式對本發明的限制。
實施例1表達重組人AFP(rHuAFP)和非糖基化人AFP(ng.HuAFP)的轉基因動物的產生材料與方法重組DNA方法重組DNA方法按照以下文獻進行Sambrook，Fritsch和Maniatis(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1989)。基因組文庫和cDNA文庫用放射性標記的寡核苷酸探針進行篩選，所述探針來自人AFP基因(GenBank檢索號M16110)開頭(5′)、中間和末尾(3′)的編碼外顯子。這三個探針的序列如下所示
AFP15′-ATGAAGTGGGTGGAATCAATTTTTTTAATT-3′(SEQ ID NO18)AFP25′-ATTCATTTATGAGATAGCAAGAAGGCAT-3′(SEQ ID NO19)AFP35′-AAAAAATCATGTCCTACATATGTTCTCAA-3′(SEQ ID NO20)人AFP基因複製人AFP基因約為19kb，含有15個外顯子(14個編碼)，其中間插14個內含子。人AFP基因的完整序列已由Gibbs等(Biochemistry 261332-1343，1987)報導，見Genbank檢索號M16610。該基因最初是克隆到約15kb的兩個片段中，然後結合在一起，產生表達蛋白。
人胎盤基因組文庫(Stratagene，La Jolla，CA)的平均插入片段大小在9kb和23kb之間，首先，將該文庫用一系列互補寡核苷酸探針進行篩選，這些探針能識別人AFP基因開頭、中間和末尾的外顯子。初次篩選不會產生任何陽性克隆。然後，採用聚合酶鏈式反應(PCR)製備2個較大的DNA探針，從人基因組DNA擴增AFP基因的開頭區和末尾區。用這些探針再次篩選文庫，產生大約15kb的2個重疊lambda(λ)噬菌體克隆，其共同跨越人AFP基因(圖2)的長度。
通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，使用含有HuAFP cDNA(Genbank檢索號J00077)的質粒例如pHuAFP(描述於Murgita等，U.S.P.N.5,384,250)作為模板，並使用以下寡核苷酸引物，獲得含有人AFP全長編碼區並缺失翻譯起始序列的DNA片段NH2(5′-AAACTC GAG AAG TGG GTG GAA-3′；SEQ ID NO21)和COOH(5′-AAACTC GAG TTA AAC TCC CAA AGC-3′；SEQ ID NO22)。
每次PCR反應都使用34μl DNA模板、10μl 10pmol/μl 5′-引物、10μl 10X反應緩衝液、20μl 1mM四種dNTP、2μl DMSO和1μl DNA模板、10μl 10pmol/μl 5′引物、10μl 10pmol/μl 3′引物、1μl甘油、10μlDMSO和1μl Pfu DNA聚合酶。退火、延伸和變性溫度分別為50℃、72℃和94℃，進行30次循環，使用Gene Amp PCR System 9600。按照生產商的說明書，使用Genecleau的方法(Bio 101；Vista，CA)，將得自PCR反應的1783bp DNA用Xho I消化，然後通過下述步驟進行純化從0.7％TAE瓊脂糖凝膠中分離片段，接著再用凝膠萃取。
基因組DNA構建體的構建對兩個重疊λ噬菌體克隆進行鑑定，其跨越rHuAFP編碼序列的長度。將這些噬菌體插入片段亞克隆到supercos載體，供後續操作用(圖1，gtc913和gtc912)。將5′-側翼區、gtc913起始ATG上遊的額外序列和gtc912最後一個外顯子下遊的額外3′-側翼序列都除去。另外，在5′端添加一個Kozak序列，以確保有效的翻譯起始。這通過下述步驟完成將限制酶「接頭」插入到基因序列中，用於合適序列的後續切割，留下完整的側翼序列(圖1)。第二，用這兩個插入片段共用的酶，將各載體中的5′和3′片段切下，以便讓它們能連接在一起形成完整的基因。使用酶BglI，因為它在5′片段的3′端切割一次，並且在3′片段的5′端的相同位點切割一次。然後，將所得兩個片段連接在β-酪蛋白表達載體(GBC350)的XhoI位點上，產生BC934。通過分別操作BC934內部的Blpl片段，通過使用缺口(gapped)誘變，改變了233位的正常糖基化位點(N→Q)。隨後，將3個BIpI片段以合適方向重新連接，產生BC1055(圖2A和圖2B)。
所述轉基因載體(參見圖1；參見Meade等，U.S.P.N.5,827,690)含有經改變的山羊β-酪蛋白基因，其中Xho I位點取代了基因的編碼部分。山羊β-酪蛋白基因中缺失的部分從外顯子2中的Taq I位點延伸到外顯子7中的Ppu MI位點。外顯子2除了含有15個胺基酸的分泌信號外還含有翻譯起始密碼子。為了產生山羊β-酪蛋白/人AFP轉基因，將Xho I/Xho I HuAFP cDNA連接到山羊β-酪蛋白基因在Xho I位點的外顯子2和外顯子7之間。完整的轉基因含有6.2kb的5′山羊β-酪蛋白序列、1.8kb HuAFP cDNA和7.1kb的3′山羊β-酪蛋白側翼序列。
供微注射和轉染用的DNA的製備通過使用SalI和NotI(New England Biolabs，Beverly，MA)徹底消化質粒，將轉基因DNA從載體骨架上分離出來。然後，對消化物進行瓊脂糖凝膠電泳，使用1X TAE(Maniatis等，1982)作為跑膠緩衝液。含有對應於表達盒的DNA片段的凝膠區域在紫外燈(長波)下進行目測。將含有目標DNA的條帶切下，在1X TAE中進行電洗脫，分離所述DNA。該方法可用於各表達盒。
電洗脫後，將DNA片段進行濃縮並進一步純化。最後的洗脫是在125μl微注射緩衝液(10mM Tris pH7.5，0.2mM EDTA)中進行。恰好在用於微注射之前，將微注射儲液的等分試樣用微注射緩衝液稀釋，使各片段的終濃度為0.5ng/ml。
轉基因小鼠的產生胚胎收集、核轉移和胚胎轉移對於核轉移，從胎兒組織或皮膚活檢組織中分離體細胞，轉導，然後如上所述進行進一步表徵。將含有rHuAFP或ng.HuAFP構建體的轉導和表徵的體細胞放入培養基中，用於進行核轉移程序。將DNA(用微注射緩衝液稀釋)微注射到雄性原核中。
CD1雌性小鼠用激素刺激排卵，從輸卵管採集受精卵。通過機械去除MII卵母細胞赤道板，給採集的卵母細胞去核。然後，將去核卵母細胞(胞質體)用單獨分離的轉導體細胞(核體)進行重新構建。重新構建後，偶聯體(couplet，去核卵母細胞和體細胞)通過電脈衝而融合在一起，這同時激活了重建的胚胎。然後，將活化的胚胎放入培養基中。將重建的胚胎保持在培養基中達24-48小時(在CZB培養基中)，在胚胎轉移之前評價胚胎活力和發育狀況，或者將其立即轉移到假孕受體CD 1雌性小鼠的輸卵管內。
核轉移和胚胎培養之後，將活的發育胚胎轉移到合適的受體動物體內。用玻璃移液管準確插入輸卵管內，向每隻雌性受體的輸卵管(位於CL同側)中轉移20-30個二細胞期胚胎或40-50個單細胞期胚胎(在少量培養基中)，然後讓其發育至足月。
建立者動物的鑑定通過蛋白酶K消化、接著用NaCl抽提和乙醇沉澱，從小鼠尾組織中分離基因組DNA，然後通過聚合酶鏈式反應(PCR)進行分析，以測定僅存於轉基因中的β-酪蛋白/甲胎蛋白連接DNA序列。山羊耳組織和白細胞按類似方式進行處理，但是DNA依次用飽和苯酚、苯酚異戊醇和氯仿抽提，再用乙醇沉澱。對於PCR反應，大約250ng基因組DNA用含有1.0單位Taq聚合酶的50ml PCR緩衝液(20mMTris(pH8.3)、50mM KCl和1.5mM MgCl2、100mM脫氧核苷酸三磷酸和各引物，其濃度為600nM)稀釋，在MJ Research DNA Engine中用標準PCR循環條件進行擴增。以下引物用於該PCR反應寡聚GTC17 GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC(SEQ ID NO23)；寡聚AFP-PCR3 TTTGTAAACCTCTTGTAAAGTTACAAG(SEQ ID NO24)；寡聚GEX7F CCAGGCACAGTCTCTAGTCTA(SEQ ID NO25)；寡聚GEX7R GGACAGGACCAAGTACAGGCT(SEQ ID NO26)。
DNA印跡分析將5μg基因組DNA用100單位EcoRI消化，接著通過0.8％瓊脂糖凝膠電泳。然後通過在0.4N NaOH和紫外交聯(Stratalinker，Sratagene)的毛細管作用，將凝膠轉印到帶電的尼龍膜(Genescreen Plus，New England Nuclear)上。在含有20μg/ml變性鯡精DNA的雜交緩衝液(5X SSC、50％甲醯胺、10％硫酸葡聚糖、20mM磷酸鈉、1X Denhardt液、0.5％SDS)中預雜交後，加入探針，將印跡在42℃保溫過夜。印跡洗滌如下在1X SSC、1％SDS中於室溫洗滌1次20分鐘；在0.5XSSC、0.5X SDS中於室溫洗滌1次20分鐘；再在0.1X SSC、0.1％SDS中於65℃洗滌3次，每次20分鐘。洗滌後，對印跡進行放射自顯影。
蛋白質印跡採用Harlow和Lane的免疫印跡方法(AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Laboratory，1988)，進行蛋白的免疫測定。將乳汁樣品在PBS中稀釋到1∶20，與2X SDS凝膠加樣緩衝液(50mM Tris HCl(pH 6.8)、2％SDS、10％甘油、10％β-巰基乙醇)按1∶1混合，於65℃加熱2分鐘，然後進行SDS-PAGE。在轉移緩衝液(50mM Tris、380mM甘氨酸、0.1％SDS、20％甲醇)中通過電印跡將凝膠上的蛋白轉移到Immobilon P膜上。為了進行免疫染色，將膜與封閉緩衝液(4％脫脂奶粉(BioRad，Hercules，CA)/含有0.01％吐溫-20的PBS)在室溫下(RT)保溫1小時。再將膜與抗-hAFP抗體(1∶5000的封閉緩衝液)一起在室溫下保溫1小時。在dH2O中快速洗滌3次後，將膜與第二抗體(1∶10000的封閉緩衝液)一起在室溫下保溫1小時。然後，將膜在dH2O中洗滌3次，每次4分鐘，其中在PBS/吐溫-20中洗滌一次，然後在dH2O中再洗滌6次，再用化學發光底物(ECL)顯影，最後進行螢光自顯影。
從基因組DNA構建體獲得的轉基因小鼠的分析用PCR鑑定從基因組構建體BC1055獲得的轉基因雌性小鼠，列在表I中。來自這些動物的乳汁通過蛋白質印跡進行分析，通過與已知濃度的hAFP標準品進行比較，對其表達水平進行評價。該表達分析結果見表I和表II以及圖3(rHuAFP)和圖4(ng.HuAFP)。通常在原始建立者動物的第二代雌性上進行表達分析，以測試轉基因的遺傳和嵌合性。認為第二代表達水平的下降是因為多個轉基因整合位點與下遊表達位點的分離，並將其遺傳給下一代。
表I.小鼠乳汁表達結果-BC934構建體
表II.小鼠乳汁表達結果-BC1055構建體
山羊胎兒成纖維細胞的分離和ng.HuAFP轉基因的轉染山羊胎兒成纖維細胞是從懷孕山羊(Genzyme TransgenicCorporation)的山羊胎兒組織中分離而來的。製備ng.HuAFP轉基因(BC1055)和新黴素抗性基因的DNA片段，然後使用LipofectAmine，以1-2μg轉基因DNA片段/106細胞，將其共轉導到山羊胎兒成纖維細胞中。經G418選擇後，分離新黴素抗性細胞集落。擴增分離的克隆，將選定的細胞系進行冷藏。將這些細胞系進行PCR分析，使用BC1055特異性引物，確定轉基因的存在。另外，對細胞系進行FISH分析，證實轉基因的整合(見下文)。
轉基因建立者山羊的產生將從原核生物DNA中純化的山羊β-酪蛋白-HuAFP的15.1kb片段以1.0μg/ml(溶於10mM Tris，pH7.5，0.1mM EDTA)的濃度，注射到所採集的胚胎的原核中，產生轉基因山羊。然後，將注射的胚胎轉移到受體母體中。通過聚合酶鏈式反應(PCR)和DNA印跡分析，分析血的基因組DNA，測定轉基因的存在，從而鑑定建立者(Fo)轉基因山羊。對於PCR分析，反應中使用用於產生HuAFP cDNA的同樣的兩個寡核苷酸。對於DNA印跡分析，將DNA在1％TBE瓊脂糖凝膠上分離，轉印到硝基纖維素上，然後用隨機引物32P標記的1.8kbHuAFP cDNA進行探測。讓經鑑定的建立者可以與非轉基因動物交配，以產生轉基因子代。或者，轉基因子代可通過如上所述的核轉移而獲得。如上所述，轉基因的遺傳可以通過分析血液和其它組織的基因組DNA而檢出。
建立者山羊F093的遺傳分析一隻健康母山羊(F093)於2002年3月11日出生。為了檢測該山羊是否攜帶ng.HuAFP轉基因，進行了血液和耳組織的PCR分析。開始，同時使用2個PCR引物對。第一對如圖5所示，對轉基因是特異性的，所得332bp產物跨越5′β-酪蛋白和5′ng.HuAFP序列的連接點。第二對引物對識別山羊β-酪蛋白外顯子7(其在轉基因構建體中並不存在)，得到439bp的產物。圖6A和圖6B顯示ng.HuAFP轉基因存在於山羊F093的血樣和耳樣中。已表徵的轉導細胞系用作陽性對照。攜帶ng.HuAFP轉基因的流產胎兒耳組織也可用作陽性對照。
證實了基因型後，進行DNA印跡分析，以估計拷貝數並排除總轉基因重排(圖7)。所用的DNA探針是3′β-酪蛋白基因的XhoI/HindIII片段(圖2，3′BC探針)，該片段存在於轉基因和內源山羊β-酪蛋白基因中。通過比較轉基因和內源基因的相對強度，可以估計轉基因拷貝數。內源基因信號以兩拷貝的基因存在於二倍體基因組中。如圖7所示，F093樣品中的2個條帶看來其強度十分相似。掃描光密度測定法(Molecular Dynamics)證實1∶1的比率(F026流產兒的光密度測定為13∶1的比率)。
螢光原位雜交(FISH)分析採用標準培養和製備程序，以從山羊F093培養的血液淋巴細胞中得到中期核和間期核。使細胞核沉積在玻片上，與來自含有8kb人AFP基因組序列的構建體的洋地黃毒苷標記探針進行雜交。結合的探針用辣根過氧化物酶綴合的抗體進行擴增，然後用tyramide-綴合的異硫氰酸螢光素(FITC，綠色螢光染料)進行檢測。核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，藍色染料)進行復染。用MetaMorph軟體得到FISH圖像。
中期染色體和間期核的FISH圖像顯示圖8所示的轉基因。轉基因信號位於大的常染色體中間的「q」。FISH分析與一個轉基因整合位點的存在是一致的。
泌乳的誘導採用超過12天周期的激素療法和手工刺激，誘導12月齡或更大的雌性動物泌乳。在前4天，給動物皮下注射溶於100％乙醇的0.1mg/kg雌二醇17-β和0.25mg/kg黃體酮。這樣的日劑量分為早晚兩次注射。每天觸摸乳房一次，每天早上用手刺激乳頭5-10分鐘。每天用手工方法給泌乳的轉基因雌性動物擠奶兩次，將所得乳汁在-20℃冷藏。
蛋白質純化含有rHuAFP或ng.HuAFP的轉基因山羊乳汁經切向流過濾澄清，以除去酪蛋白膠團和其它汙染蛋白質。所得含有rHuAFP或ng.HuAFP的濾液(乳清部分)通過22μm濾器過濾。通過加入等體積20mM咪唑(pH6.7)，調節pH和離子強度，然後，將溶液通過用20mM咪唑(pH6.7)平衡的含有Pharmacia Blue SEPHAROSE 6 Fast flow珠的柱子，從乳清部分純化rHuAFP或ng.HuAFP。流出的rHuAFP或ng.HuAFP用裝有Pharmacia Q HP珠並用20mM咪唑(pH6.7)平衡的柱子捕獲。rHuAFP或ng.HuAFP用0-250mM NaCl的20mM咪唑(pH6.7)進行梯度洗脫。經蛋白質印跡、ELISA或考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠測定，將含有rHuAFP或ng.HuAFP的流分合併，並將NaCl濃度調節到725mM。然後，將該合併的流分加到裝有Pharmacia PhenylHiSub珠並用1M NaCl、20mM咪唑(pH6.7)平衡的柱子上。將rHuAFP或ng.HuAFP用1-10mM NaCl的20mM咪唑(pH6.7)進行梯度洗脫。經蛋白質印跡、ELISA或考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠測定，將含有rHuAFP或ng.HuAFP的流分合併，然後超濾濃縮。
將濃縮樣品加到用磷酸鹽緩衝液平衡的SUPERDEX200 HR柱子上，完成rHuAFP或ng.HuAFP的最後純化。經蛋白質印跡、ELISA或考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠測定，將含有rHuAFP或ng.HuAFP的流分合併。
以上結果證明，重組天然人AFP以及重組非糖基化形式的人甲胎蛋白(ng.HuAFP)被克隆並在幾個轉基因小鼠品系的乳汁中表達，作為基因組的「小基因(mini-gene)」。該基因的表達處於山羊β-酪蛋白調節元件的控制之下。在非嵌合小鼠(能將轉基因遺傳給後代的小鼠)中的表達水平的範圍為1.0-20mg/ml。正如先前研究所預計的一樣，基因組表達構建體看來顯示出更高水平的ng.HuAFP表達，儘管ng.HuAFP在來自cDNA構建體的動物中表達也相當高(5-10mg/ml)。來自所有構建體的轉基因產物與hAFP特異性抗體都具有免疫反應活性。
我們也產生了攜帶用於在小鼠中高水平表達ng.HuAFP的相同基因組轉基因的建立者轉基因山羊。對該山羊F093的若干組織進行遺傳分析證實，她確實是轉基因的並且在一個整合位點上攜帶大約兩拷貝的ng.HuAFP轉基因。
其他實施方案以下出版物介紹了將重組蛋白分泌到乳汁中的轉基因動物的產生、檢測和分析以及重組蛋白的純化。這些出版物通過引用結合到本文中Hurwitz等，U.S.P.N.5,648,243(山羊)；Meade等，U.S.P.N.5,827,690(山羊)；DiTullio等，U.S.P.N.5,843,705(山羊)；Clark等，U.S.P.N.5,322,775(綿羊)；Garner等，U.S.P.N.5,639,940(綿羊)；Deboer等，U.S.P.N.5,633,076(母牛)；Drohan等，U.S.P.N.5,589,604(豬和小鼠)。Kerr等(Nat.Biotechnol.1675-79，1998)介紹了將重組蛋白分泌到尿液中的轉基因動物的產生和分析，以及重組蛋白的純化，所述文獻通過引用結合到本文中。
本發明說明書所提到的所有出版物和專利申請都通過引用結合到本文中，其程度如同每篇出版物或專利申請具體而單獨指明通過引用全部結合到本文中一樣。
雖然本發明是通過其具體的實施方案進行描述的，但是，人們知道，可以作進一步修改，而且本申請可包括通常在遵循本發明原理的基礎上對本發明的任何變化、用途或更改，包括對本發明公開內容的偏離，所述偏離是在本發明所屬領域已知的或常規實踐範圍內並且可用於上文所提出的基本特徵。
序列表110梅裡麥克藥品公司等(Merrimack Pharmaceuticals，Inc.et al.)120非糖基化人甲胎蛋白、製備方法及其應用13006727/012CN1150PCT/US2004/0234741512004-07-2115010/624,3801512003-07-2216026170FastSEQ for Windows Version 4.021012112027212DNA213智人(Homo sapiens)220
221CDS222(45)...(1874)4001atattgtgct tccaccactg ccaataacaa aataactagc aacc atg aag tgg gtg 56Met Lys Trp Val1gaa tca att ttt tta att ttc cta cta aat ttt act gaa tcc aga aca 104Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr Glu Ser Arg Thr5 10 15 20ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct tac caa 152Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr Gln25 30 35tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt ttt gcc 200Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe Ala40 45 50cag ttt gtt caa gaa gcc act tac aag gaa gta agc aaa atg gtg aaa 248Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val Lys
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4002Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr1 5 10 15Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu20 25 30Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr35 40 45Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser50 55 60Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp65 70 75 80Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu85 90 95Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp100 105 110Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His115 120 125Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro130 135 140Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn145 150 155 160Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro165 170 175Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys180 185 190Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr195 200 205Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys210 215 220Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val225 230 235 240Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln245 250 255Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly260 265 270Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile275 280 285Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys290 295 300Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp305 310 315 320Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp325 330 335Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala340 345 350Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser355 360 365Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys370 375 380
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221CDS222(1)...(1776)4003aga aca ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct48Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser1 5 10 15tac caa tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt96Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe20 25 30
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ctg agt cag aag ttt acc aaa gtt aat ttt act gaa atc cag aaa cta720Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu225 230 235 240gtc ctg gat gtg gcc cat gta cat gag cac tgt tgc aga gga gat gtg768Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val245 250 255ctg gat tgt ctg cag gat ggg gaa aaa atc atg tcc tac ata tgt tct816Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser260 265 270caa caa gac act ctg tca aac aaa ata aca gaa tgc tgc aaa ctg acc864Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr275 280 285acg ctg gaa cgt ggt caa tgt ata att cat gca gaa aat gat gaa aaa912Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys290 295 300cct gaa ggt cta tct cca aat cta aac agg ttt tta gga gat aga gat960Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp305 310 315 320ttt aac caa ttt tct tca ggg gaa aaa aat atc ttc ttg gca agt ttt1008Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe325 330 335gtt cat gaa tat tca aga aga cat cct cag ctt gct gtc tca gta att1056Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile340 345 350cta aga gtt gct aaa gga tac cag gag tta ttg gag aag tgt ttc cag1104Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln355 360 365act gaa aac cct ctt gaa tgc caa gat aaa gga gaa gaa gaa tta cag1152Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln370 375 380aaa tac atc cag gag agc caa gca ttg gca aag cga agc tgc ggc ctc1200Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu385 390 395 400ttc cag aaa cta gga gaa tat tac tta caa aat gcg ttt ctc gtt gct1248Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala405 410 415tac aca aag aaa gcc ccc cag ctg acc tcg tcg gag ctg atg gcc atc1296
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5 10 15 20ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct tac caa 152Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr Gln25 30 35tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt ttt gcc 200Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe Ala40 45 50cag ttt gtt caa gaa gcc act tac aag gaa gta agc aaa atg gtg aaa 248Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val Lys55 60 65gat gca ttg act gca att gag aaa ccc act gga gat gaa cag tct tca 296Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser Ser70 75 80ggg tgt tta gaa aac cag cta cct gcc ttt ctg gaa gaa ctt tgc cat 344Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys His85 90 95 100gag aaa gaa att ttg gag aag tac gga cat tca gac tgc tgc agc caa 392Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser Gln105 110 115agt gaa gag gga aga cat aac tgt ttt ctt gca cac aaa aag ccc act 440Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro Thr120 125 130cca gca tcg atc cca ctt ttc caa gtt cca gaa cct gtc aca agc tgt 488Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr Ser Cys135 140 145gaa gca tat gaa gaa gac agg gag aca ttc atg aac aaa ttc att tat 536Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr150 155 160gag ata gca aga agg cat ccc ttc ctg tat gca cct aca att ctt ctt 584Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile Leu Leu165 170 175 180tgg gct gct cgc tat gac aaa ata att cca tct tgc tgc aaa gct gaa 632Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys Ala Glu185 190 195aat gca gtt gaa tgc ttc caa aca aag gca gca aca gtt aca aaa gaa 680Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr Lys Glu200 205 210
tta aga gaa agc agc ttg tta aat caa cat gca tgt gca gta atg aaa728Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met Lys215 220 225aat ttt ggg acc cga act ttc caa gcc ata act gtt act aaa ctg agt776Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu Ser230 235 240cag aag ttt acc aaa gtt can ttt act gaa atc cag aaa cta gtc ctg824Gln Lys Phe Thr Lys Val Xaa Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val Leu245 250 255 260gat gtg gcc cat gta cat gag cac tgt tgc aga gga gat gtg ctg gat872Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu Asp265 270 275tgt ctg cag gat ggg gaa aaa atc atg tcc tac ata tgt tct caa caa920Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln280 285 290gac act ctg tca aac aaa ata aca gaa tgc tgc aaa ctg acc acg ctg968Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu295 300 305gaa cgt ggt caa tgt ata att cat gca gaa aat gat gaa aaa cct gaa1016Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro Glu310 315 320ggt cta tct cca aat cta aac agg ttt tta gga gat aga gat ttt aac1064Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe Asn325 330 335 340caa ttt tct tca ggg gaa aaa aat atc ttc ttg gca agt ttt gtt cat1112Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val His345 350 355gaa tat tca aga aga cat cct cag ctt gct gtc tca gta att cta aga1160Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile Leu Arg360 365 370gtt gct aaa gga tac cag gag tta ttg gag aag tgt ttc cag act gaa1208Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu375 380 385aac cct ctt gaa tgc caa gat aaa gga gaa gaa gaa tta cag aaa tac1256Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr390 395 400
atc cag gag agc caa gca ttg gca aag cga agc tgc ggc ctc ttc cag1304Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln405 410 415 420aaa cta gga gaa tat tac tta caa aat gcg ttt ctc gtt gct tac aca1352Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala Tyr Thr425 430 435aag aaa gcc ccc cag ctg acc tcg tcg gag ctg atg gcc atc acc aga1400Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile Thr Arg440 445 450aaa atg gca gcc aca gca gcc act tgt tgc caa ctc agt gag gac aaa1448Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys455 460 465cta ttg gcc tgt ggc gag gga gcg gct gac att att atc gga cac tta1496Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu470 475 480tgt atc aga cat gaa atg act cca gta aac cct ggt gtt ggc cag tgc1544Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys485 490 495 500tgc act tct tca tat gcc aac agg agg cca tgc ttc agc agc ttg gtg1592Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val505 510 515gtg gat gaa aca tat gtc cct cct gca ttc tct gat gac aag ttc att1640Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile520 525 530ttc cat aag gat ctg tgc caa gct cag ggt gta gcg ctg caa acg atg1688Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met535 540 545aag caa gag ttt ctc att aac ctt gtg aag caa aag cca caa ata aca1736Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr550 555 560gag gaa caa ctt gag gct gtc att gca gat ttc tca ggc ctg ttg gag1784Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu565 570 575 580aaa tgc tgc caa ggc cag gaa cag gaa gtc tgc ttt gct gaa gag gga1832Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly585 590 595caa aaa ctg att tca aaa act cgt gct gct ttg gga gtt taa1874
Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val *600 605attacttcag gggaagagaa gacaaaacga gtctttcatt cggtgtgaac ttttctcttt 1934aattttaact gatttaacac tttttgtgaa ttaatgaaat gataaagact tttatgtgag 1994atttccttat cacagaaata aaatatctcc aaa 20272106211609212PRT213智人(Homo sapiens)220
221變異體222251223Xaa＝任何胺基酸4006Met Lys Trp Val Glu Ser Ile Phe Leu Ile Phe Leu Leu Asn Phe Thr1 5 10 15Glu Ser Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu20 25 30Asp Ser Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr35 40 45Ile Phe Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser50 55 60Lys Met Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp65 70 75 80Glu Gln Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu85 90 95Glu Leu Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp100 105 110Cys Cys Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His115 120 125Lys Lys Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro130 135 140Val Thr Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn145 150 155 160Lys Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro165 170 175Thr Ile Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys180 185 190Cys Lys Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr195 200 205Val Thr Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys210 215 220Ala Val Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val225 230 235 240Thr Lys Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Xaa Phe Thr Glu Ile Gln
245 250 255Lys Leu Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly260 265 270Asp Val Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile275 280 285Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys290 295 300Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp305 310 315 320Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp325 330 335Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala340 345 350Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser355 360 365Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys370 375 380Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu385 390 395 400Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys405 410 415Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu420 425 430Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met435 440 445Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu450 455 460Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile465 470 475 480Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly485 490 495Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe500 505 510Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp515 520 525Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala530 535 540Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys545 550 555 560Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser565 570 575Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe580 585 590Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly595 600 605Val
21072111776212DNA213智人(Homo sapiens)220
221CDS222(1)...(1776)221其他特徵222699223n＝A或G4007aga aca ctg cat aga aat gaa tat gga ata gct tcc ata ttg gat tct 48Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser1 5 10 15tac caa tgt act gca gag ata agt tta gct gac ctg gct acc ata ttt 96Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe20 25 30ttt gcc cag ttt gtt caa gaa gcc act tac aag gaa gta agc aaa atg 144Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met35 40 45gtg aaa gat gca ttg act gca att gag aaa ccc act gga gat gaa cag 192Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln50 55 60tct tca ggg tgt tta gaa aac cag cta cct gcc ttt ctg gaa gaa ctt 240Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu65 70 75 80tgc cat gag aaa gaa att ttg gag aag tac gga cat tca gac tgc tgc 288Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys85 90 95agc caa agt gaa gag gga aga cat aac tgt ttt ctt gca cac aaa aag 336Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys100 105 110ccc act cca gca tcg atc cca ctt ttc caa gtt cca gaa cct gtc aca 384Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr115 120 125agc tgt gaa gca tat gaa gaa gac agg gag aca ttc atg aac aaa ttc 432Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe130 135 140
att tat gag ata gca aga agg cat ccc ttc ctg tat gca cct aca att480Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile145 150 155 160ctt ctt tgg gct gct cgc tat gac aaa ata att cca tct tgc tgc aaa528Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys165 170 175gct gaa aat gca gtt gaa tgc ttc caa aca aag gca gca aca gtt aca576Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr180 185 190aaa gaa tta aga gaa agc agc ttg tta aat caa cat gca tgt gca gta624Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val195 200 205atg aaa aat ttt ggg acc cga act ttc caa gcc ata act gtt act aaa672Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys210 215 220ctg agt cag aag ttt acc aaa gtt can ttt act gaa atc cag aaa cta720Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Xaa Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu225 230 235 240gtc ctg gat gtg gcc cat gta cat gag cac tgt tgc aga gga gat gtg768Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val245 250 255ctg gat tgt ctg cag gat ggg gaa aaa atc atg tcc tac ata tgt tct816Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser260 265 270caa caa gac act ctg tca aac aaa ata aca gaa tgc tgc aaa ctg acc864Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr275 280 285acg ctg gaa cgt ggt caa tgt ata att cat gca gaa aat gat gaa aaa912Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys290 295 300cct gaa ggt cta tct cca aat cta aac agg ttt tta gga gat aga gat960Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp305 310 315 320ttt aac caa ttt tct tca ggg gaa aaa aat atc ttc ttg gca agt ttt1008Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn Ile Phe Leu Ala Ser Phe325 330 335
gtt cat gaa tat tca aga aga cat cct cag ctt gct gtc tca gta att1056Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln Leu Ala Val Ser Val Ile340 345 350cta aga gtt gct aaa gga tac cag gag tta ttg gag aag tgt ttc cag1104Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu Leu Glu Lys Cys Phe Gln355 360 365act gaa aac cct ctt gaa tgc caa gat aaa gga gaa gaa gaa tta cag1152Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln370 375 380aaa tac atc cag gag agc caa gca ttg gca aag cga agc tgc ggc ctc1200Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala Lys Arg Ser Cys Gly Leu385 390 395 400ttc cag aaa cta gga gaa tat tac tta caa aat gcg ttt ctc gtt gct1248Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln Asn Ala Phe Leu Val Ala405 410 415tac aca aag aaa gcc ccc cag ctg acc tcg tcg gag ctg atg gcc atc1296Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser Ser Glu Leu Met Ala Ile420 425 430acc aga aaa atg gca gcc aca gca gcc act tgt tgc caa ctc agt gag1344Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu435 440 445gac aaa cta ttg gcc tgt ggc gag gga gcg gct gac att att atc gga1392Asp Lys Leu Leu Ala Cys Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly450 455 460cac tta tgt atc aga cat gaa atg act cca gta aac cct ggt gtt ggc1440His Leu Cys Ile Arg His Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly465 470 475 480cag tgc tgc act tct tca tat gcc aac agg agg cca tgc ttc agc agc1488Gln Cys Cys Thr Ser Ser Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser485 490 495ttg gtg gtg gat gaa aca tat gtc cct cct gca ttc tct gat gac aag1536Leu Val Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys500 505 510ttc att ttc cat aag gat ctg tgc caa gct cag ggt gta gcg ctg caa1584Phe Ile Phe His Lys Asp Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln515 520 525acg atg aag caa gag ttt ctc att aac ctt gtg aag caa aag cca caa1632
Thr Met Lys Gln Glu Phe Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln530 535 540ata aca gag gaa caa ctt gag gct gtc att gca gat ttc tca ggc ctg 1680Ile Thr Glu Glu Gln Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu545 550 555 560ttg gag aaa tgc tgc caa ggc cag gaa cag gaa gtc tgc ttt gct gaa 1728Leu Glu Lys Cys Cys Gln Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu565 570 575gag gga caa aaa ctg att tca aaa act cgt gct gct ttg gga gtt taa 1776Glu Gly Gln Lys Leu Ile Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val *580 585 5902108211591212PRT213智人(Homo sapiens)4008Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser1 5 10 15Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe20 25 30Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met35 40 45Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln50 55 60Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu65 70 75 80Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys85 90 95Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys100 105 110Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr115 120 125Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe130 135 140Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile145 150 155 160Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys165 170 175Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr180 185 190Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val195 200 205
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195 20021012211390212PRT213智人(Homo sapiens)40012Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser1 5 10 15Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe20 25 30Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met35 40 45Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln50 55 60Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu65 70 75 80Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys85 90 95Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys100 105 110Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr115 120 125Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe130 135 140Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile145 150 155 160Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys165 170 175Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr180 185 190Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val195 200 205Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys210 215 220Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu225 230 235 240Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val245 250 255Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser260 265 270Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr275 280 285Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys290 295 300Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp305 310 315 320
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245 250 255Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His260 265 270Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser275 280 285Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr290 295 300Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp305 310 315 320Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe325 330 335Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu340 345 350Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln355 360 365Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile370 375 380Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val385 39021014211325212PRT213智人(Homo sapiens)40014Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr1 5 10 15Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His20 25 30Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg35 40 45Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu Lys Asn50 55 60Ile Phe Leu Ala Ser Phe Val His Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Gln65 70 75 80Leu Ala Val Ser Val Ile Leu Arg Val Ala Lys Gly Tyr Gln Glu Leu85 90 95Leu Glu Lys Cys Phe Gln Thr Glu Asn Pro Leu Glu Cys Gln Asp Lys100 105 110Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser Gln Ala Leu Ala115 120 125Lys Arg Ser Cys Gly Leu Phe Gln Lys Leu Gly Glu Tyr Tyr Leu Gln130 135 140Asn Glu Phe Leu Val Ala Tyr Thr Lys Lys Ala Pro Gln Leu Thr Ser145 150 155 160Ser Ala Leu Met Ala Ile Thr Arg Lys Met Ala Ala Thr Ala Ala Thr165 170 175
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165 170 175Cys Gln Asp Lys Gly Glu Glu Glu Leu Gln Lys Tyr Ile Gln Glu Ser180 185 19021016211390212PRT213智人(Homo sapiens)40016Arg Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser1 5 10 15Tyr Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe20 25 30Phe Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met35 40 45Val Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln50 55 60Ser Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu65 70 75 80Cys His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys85 90 95Ser Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys100 105 110Pro Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr115 120 125Ser Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe130 135 140Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile145 150 155 160Leu Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys165 170 175Ala Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr180 185 190Lys Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val195 200 205Met Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys210 215 220Leu Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Gln Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu225 230 235 240Val Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val245 250 255Leu Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser260 265 270Gln Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr275 280 285Thr Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys290 295 300
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225 230 235 240Thr Ala Ala Thr Cys Cys Gln Leu Ser Glu Asp Lys Leu Leu Ala Cys245 250 255Gly Glu Gly Ala Ala Asp Ile Ile Ile Gly His Leu Cys Ile Arg His260 265 270Glu Met Thr Pro Val Asn Pro Gly Val Gly Gln Cys Cys Thr Ser Ser275 280 285Tyr Ala Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ser Leu Val Val Asp Glu Thr290 295 300Tyr Val Pro Pro Ala Phe Ser Asp Asp Lys Phe Ile Phe His Lys Asp305 310 315 320Leu Cys Gln Ala Gln Gly Val Ala Leu Gln Thr Met Lys Gln Glu Phe325 330 335Leu Ile Asn Leu Val Lys Gln Lys Pro Gln Ile Thr Glu Glu Gln Leu340 345 350Glu Ala Val Ile Ala Asp Phe Ser Gly Leu Leu Glu Lys Cys Cys Gln355 360 365Gly Gln Glu Gln Glu Val Cys Phe Ala Glu Glu Gly Gln Lys Leu Ile370 375 380Ser Lys Thr Arg Ala Ala Leu Gly Val385 3902101821130212DNA213人工序列220
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220
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223合成的40022aaactcgagt taaactccca aagc 242102321127212DNA213人工序列220
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tttgtaaacc tcttgtaaag ttacaag272102521121212DNA213人工序列220
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223合成的40026ggacaggacc aagtacaggc t 2權利要求
1.一種核酸分子，所述分子編碼非糖基化人甲胎蛋白(ng.HuAFP)或其非糖基化片段。
2.權利要求1的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5所示序列的核苷酸45-1874。
3.一種核酸分子，所述分子包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸序列，(ii)與所述ng.HuAFP編碼序列操作性連接的啟動子，所述啟動子使ng.HuAFP能表達，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使細胞能分泌所述ng.HuAFP。
4.權利要求3的核酸分子，其中所述細胞是大腸桿菌(E.coli)。
5.權利要求3的核酸分子，其中所述細胞是真核細胞。
6.權利要求5的核酸分子，其中所述真核細胞是酵母細胞或動物細胞。
7.權利要求6的核酸分子，其中所述動物細胞是在轉基因動物體內。
8.權利要求7的核酸分子，其中所述轉基因動物是哺乳動物。
9.權利要求8的核酸分子，其中所述哺乳動物是山羊、綿羊、駱駝、牛、豬、兔、馬或美洲駝。
10.權利要求3的核酸分子，其中所述細胞是轉基因動物體內的生物體液產生細胞；所述啟動子使所述ng.HuAFP能在所述生物體液產生細胞中表達；所述前導序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述轉基因動物的生物體液中。
11.權利要求10的核酸分子，其中所述生物體液是乳汁、尿液、血液或淋巴液。
12.權利要求3的核酸分子，其中所述細胞是在轉基因動物體內；所述啟動子是乳汁特異性啟動子，該啟動子使所述ng.HuAFP能在所述動物的乳汁產生細胞中表達；所述前導序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述動物的乳汁中。
13.權利要求3的核酸分子，其中所述細胞是在轉基因動物體內；所述啟動子是尿液特異性啟動子，該啟動子使所述ng.HuAFP能在所述動物的尿液產生細胞中表達；所述前導序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述動物的尿液中。
14.權利要求3的核酸分子，其中所述細胞是在轉基因動物體內；所述啟動子是血液特異性啟動子，該啟動子使所述ng.HuAFP能在所述動物的血液產生細胞中表達；所述前導序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述動物的血液中。
15.權利要求3的核酸分子，其中所述細胞是在轉基因動物體內；所述啟動子是淋巴液特異性啟動子，該啟動子使所述ng.HuAFP能在所述動物的淋巴液產生細胞中表達；所述前導序列使所述ng.HuAFP能分泌到所述動物的淋巴液中。
16.非糖基化HuAFP(ng.HuAFP)，其包含在SEQ ID NO4中的第233位上的穀氨醯胺殘基。
17.一種多肽，所述多肽包含SEQ ID NO6中所示的胺基酸序列。
18.一種基本純的非糖基化人甲胎蛋白的生物活性片段。
19.權利要求18的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO15中所示的胺基酸序列即結構域II、SEQ ID NO16中所示的胺基酸序列即結構域I+II或SEQ ID NO17中所示的胺基酸序列即結構域II+III，或者兩個或兩個以上的所述胺基酸序列。
20.一種非人類轉基因真核生物，所述生物表達ng.HuAFP並將其分泌到生物體液中。
21.權利要求20的轉基因生物，其中所述轉基因生物是哺乳動物。
22.權利要求21的轉基因生物，其中所述哺乳動物是山羊、綿羊、駱駝、牛、豬、兔、馬或美洲駝。
23.權利要求21的轉基因生物，其中所述生物體液是乳汁、尿液、血液或淋巴液。
24.權利要求21的轉基因生物，其中所述ng.HuAFP是由轉基因表達的，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸序列，(ii)啟動子，所述啟動子與所述ng.HuAFP編碼序列操作性連接並且使得所述轉基因生物的細胞能夠表達ng.HuAFP並將蛋白分泌到生物體液中，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使所述轉基因生物的所述細胞將所述ng.HuAFP分泌到所述生物體液中。
25.權利要求24的轉基因生物，其中所述啟動子是乳汁特異性啟動子、尿液特異性啟動子、血液特異性啟動子或淋巴液特異性啟動子，所述前導序列使所述ng.HuAFP能分別分泌到乳汁、尿液、血液或淋巴液中。
26.權利要求24的轉基因生物，其中所述啟動子是乳汁特異性啟動子，所述前導序列使所述ng.HuAFP能分泌到乳汁中。
27.權利要求26的轉基因生物，其中所述轉基因生物是山羊。
28.權利要求24的轉基因生物，其中所述啟動子是尿液特異性啟動子，所述前導序列使所述ng.HuAFP能分泌到尿液中。
29.權利要求28的轉基因生物，其中所述哺乳動物是山羊。
30.權利要求24的轉基因生物，其中所述啟動子是血液特異性啟動子，所述前導序列使所述ng.HuAFP能分泌到血液中。
31.權利要求30的轉基因生物，其中所述哺乳動物是山羊。
32.權利要求24的轉基因生物，其中所述啟動子是淋巴液特異性啟動子，所述前導序列使所述ng.HuAFP能分泌到淋巴液中。
33.權利要求32的轉基因生物，其中所述哺乳動物是山羊。
34.包含ng.HuAFP的非人類哺乳動物乳汁。
35.權利要求34的乳汁，其中所述ng.HuAFP是可溶的並由轉基因非人類哺乳動物產生，所述動物的乳汁產生細胞表達轉基因，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸序列，(ii)與所述ng.HuAFP編碼序列操作性連接的乳汁特異性啟動子，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使所述乳汁產生細胞將ng.HuAFP分泌到所述哺乳動物的乳汁中。
36.包含ng.HuAFP的非人類哺乳動物尿液。
37.權利要求36的尿液，其中所述ng.HuAFP是可溶的並由轉基因非人類哺乳動物產生，所述動物的尿液產生細胞表達轉基因，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸序列，(ii)與所述ng.HuAFP編碼序列操作性連接的尿液特異性啟動子，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使所述尿液產生細胞將ng.HuAFP分泌到所述哺乳動物的尿液中。
38.包含ng.HuAFP的非人類哺乳動物血液。
39.權利要求38的血液，其中所述ng.HuAFP是可溶的並由轉基因非人類哺乳動物產生，所述動物的血液產生細胞表達轉基因，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸序列，(ii)與所述ng.HuAFP編碼序列操作性連接的血液特異性啟動子，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使所述血液產生細胞將ng.HuAFP分泌到所述哺乳動物的血液中。
40.包含ng.HuAFP的非人類哺乳動物淋巴液。
41.權利要求40的血液，其中所述ng.HuAFP是可溶的並由轉基因非人類哺乳動物產生，所述動物的淋巴液產生細胞表達轉基因，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸序列，(ii)與所述ng.HuAFP編碼序列操作性連接的淋巴液特異性啟動子，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使所述淋巴液產生細胞將ng.HuAFP分泌到所述哺乳動物的淋巴液中。
42.一種製備ng.HuAFP的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供用轉基因轉導的細胞，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)啟動子，所述啟動子與所述ng.HuAFP編碼分子操作性連接並且使所述細胞能表達所述ng.HuAFP，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使所述細胞能分泌所述ng.HuAFP；和(b)培養所述轉導細胞，其中所述細胞表達並分泌所述ng.HuAFP。
43.權利要求42的方法，其中所述細胞是大腸桿菌。
44.權利要求42的方法，其中所述細胞是真核細胞。
45.權利要求44的方法，其中所述真核細胞是酵母細胞或動物細胞。
46.權利要求45的方法，其中所述酵母細胞是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。
47.權利要求43的方法，其中所述細胞將所述ng.HuAFP分泌到細胞培養基中。
48.權利要求45的方法，其中所述動物細胞是乳汁產生細胞、尿液產生細胞、血液產生細胞或淋巴液產生細胞。
49.一種製備ng.HuAFP的方法，所述方法包括下述步驟(a)提供包含轉基因的轉基因生物，所述轉基因包含(i)編碼ng.HuAFP的核酸分子，所述分子包含SEQ ID NO5中所示的核酸序列的核苷酸45-1874，(ii)啟動子，所述啟動子與所述ng.HuAFP編碼分子操作性連接並且使得所述轉基因生物的生物體液產生細胞能夠表達ng.HuAFP，和(iii)編碼蛋白分泌信號的前導序列，所述前導序列使所述生物體液產生細胞能分泌所述rHuAFP；和(b)從所述轉基因生物中收集包含所述ng.HuAFP的生物體液。
50.權利要求49的方法，其中所述生物體液是乳汁、尿液、血液或淋巴液。
51.權利要求50的方法，其中所述生物體液是乳汁。
52.權利要求51的方法，其中所述ng.HuAFP是從所述乳汁中純化的。
53.權利要求49的方法，其中所述啟動子是乳汁特異性啟動子，所述啟動子使所述轉基因生物的乳汁產生細胞中能表達ng.HuAFP。
54.權利要求50的方法，其中所述生物體液是尿液。
55.權利要求54的方法，其中所述ng.HuAFP是從所述尿液中純化的。
56.權利要求49的方法，其中所述啟動子是尿液特異性啟動子，所述啟動子使所述轉基因生物的尿液產生細胞中能表達ng.HuAFP。
57.權利要求50的方法，其中所述生物體液是血液。
58.權利要求57的方法，其中所述ng.HuAFP是從所述血液中純化的。
59.權利要求49的方法，其中所述啟動子是血液特異性啟動子，所述啟動子使所述轉基因生物的血液產生細胞中能表達ng.HuAFP。
60.權利要求50的方法，其中所述生物體液是淋巴液。
61.權利要求60的方法，其中所述ng.HuAFP是從所述淋巴液中純化的。
62.權利要求49的方法，其中所述啟動子是淋巴液特異性啟動子，所述啟動子使所述轉基因生物的淋巴液產生細胞中能表達ng.HuAFP。
63.一種治療需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的ng.HuAFP，所述ng.HuAFP是從包含所述ng.HuAFP的細胞培養基中純化的。
64.一種治療需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的含有ng.HuAFP的非人類哺乳動物的乳汁。
65.一種治療需要ng.HuAFP的患者的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的ng.HuAFP，所述ng.HuAFP是從包含所述ng.HuAFP的非人類哺乳動物的生物體液中純化的。
66.權利要求65的方法，其中所述生物體液是乳汁、尿液、血液或淋巴液。
67.一種包含ng.HuAFP的治療組合物，所述ng.HuAFP包含SEQID NO8中所示的胺基酸序列。
68.ng.HuAFP在製備用於治療免疫性疾病的藥物中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的胺基酸序列。
69.權利要求68的用途，其中所述免疫性疾病是愛滋病(HIV)。
70.ng.HuAFP在製備用於治療自身免疫性疾病的藥物中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的胺基酸序列。
71.權利要求70的用途，其中所述自身免疫性疾病是類風溼性關節炎、肌營養不良、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力、多發性硬化、胰島素依賴性糖尿病或銀屑病。
72.ng.HuAFP在製備免疫抑制藥中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的胺基酸序列。
73.權利要求72的用途，其中所述免疫抑制藥抑制或治療自體反應性免疫細胞增殖或移植物抗宿主病。
74.ng.HuAFP在製備用於減輕化療副作用或放療副作用的藥物中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的胺基酸序列。
75.ng.HuAFP在製備用於促進細胞增殖的藥物中的用途，所述ng.HuAFP包含SEQ ID NO8中所示的胺基酸序列。
76.權利要求44的方法，其中所述細胞將所述ng.HuAFP分泌到細胞培養基中。
全文摘要
本發明的特徵為非糖基化人甲胎蛋白、製備方法及其應用。
文檔編號C07K14/47GK1826350SQ200480020701
公開日2006年8月30日 申請日期2004年7月21日 優先權日2003年7月22日
發明者R·穆爾羅伊, I·克蘭 申請人:梅裡麥克藥品公司