一種環氧水解酶基因、編碼蛋白及其應用的製作方法

2023-08-12 19:45:41 2

專利名稱：一種環氧水解酶基因、編碼蛋白及其應用的製作方法
一種環氧水解酶基因、編碼蛋白及其應用
技術領域：
本發明屬於生物化學與分子生物學中基因工程領域，更具體地講，涉及一種綠豆環氧水解酶基因及其編碼蛋白。
背景技術：
手性環氧化物及其開環產物鄰二醇能與各種親核試劑反應，作為合成化學中重要的手性砌塊可以進一步轉化成許多具有生物活性的化合物，如白三烯、昆蟲信息素、留類物質、腎上腺素阻斷劑、神經保護劑和愛滋病毒蛋白酶抑制劑等，在醫藥、農藥、精細化工和化妝品等行業具有廣闊的應用前景。在藥物研究領域，具有單一光學活性結構的藥物往往比具有消旋結構的藥物療效更高，不良反應更少，因此有機化學家、藥物化學家一直在致力於發展新的途徑和方法得到單一光學活性的化合物。不對稱氧化及開環的方法，有化學催化和生物催化兩種。以Katsuki-Siarpless 和Jacobsen不對稱環氧化為代表的含金屬元素類化學催化劑已廣泛應用於各種反應中。 近年來，以水解酶類(特別是脂肪酶和酯酶)、滷酸脫滷素酶、單加氧酶、過氧化物酶、滷過氧化物酶和環氧水解酶(Epoxide hydrolases, EHs)為代表的生物催化劑依賴其高度立體選擇性、環境友好等優勢越來越得到重視，尤其是不依賴於輔因子的環氧化物水解酶 [EC. 3. 3. 2. X]。環氧水解酶廣泛存在於自然界各種生物體內，如哺乳動物、植物、昆蟲、真菌和細菌等，能立體選擇性地將水分子加成到環氧底物上，生成相應的鄰位二醇。由於環氧具有張力三元環和極性碳氧鍵，是非常活潑的親電試劑，因此環氧化物在生物體內可以和許多具有親核基團的生物活性分子進行反應，EHs可以降解這種具有潛在毒性的代謝中間體，特別是那些可以致癌的多環芳烴環氧化物；EHs和血管滲透中內源的化學遞質如花生四烯酸、 亞麻油酸等氧化脂類的代謝也有關，可防止形成的環氧化物導致的炎症、組織缺氧、高血壓等生理機能障礙；多數植物種子含有含氧油脂，例如斑鳩菊脂酸、單加氧的亞麻油酸，它們經過環氧水解酶作用之後得到的相應的二醇是角質素和芳香族化合物合成中重要的中間體，也是植物抗真菌的防衛物。EHs對人體及其他生物體都非常重要。環氧化物的酶促水解反應從20世紀60年代就有科學家開始研究，在自然界中尋找新的EHs酶源是近年來國際上研究的熱點。目前已發現了很多具有環氧化物選擇性水解活力的細菌、真菌和植物，見參考文件[1-7]，使EHs在不對稱合成中的運用成為可能； 隨著基因組測序計劃的進行，EHs的來源也擴大到利用基因重組方法來製備，見參考文獻 [8-11]，如黑麴黴、土豆、大豆等，且已有兩種重組EHs作為商品進行銷售。一般而言，消旋化合物經酶促轉化拆分後最多只能得到50%的單一構型產物。對映體會聚(enantioconvergence)是指將兩種構型的外消旋底物同時轉化成一種構型的產物，可實現底物的完全轉化。常用的對映體會聚的方法有利用兩種選擇性互補的酶共同作用和化學-酶偶聯法兩種。我們已發現綠豆中存在獨特的環氧水解酶，見參考文獻 [12-13]，可以通過對映歸一性水解的方式產生單一構型的鄰位二醇；對此酶進行了部分純
3化、動力學和酶學性質研究。本發明中公幵綠豆環氧水解酶的基因與其編碼的蛋白序列，以及該酶的重組方法。參考文獻[ 1 ] Chri stophe Morisseau, Jeffrey K. Beetham, Franck Pinot et al· Cress and Potato Soluble Epoxide Hydrolases !Purification, Biochemical Characterization, and Comparison to Mammalian Enzymes. Archives of Biochemistry and Biophysics. 2000,378(2) :321-332.[2] Carel A. G. M. Weijers and Jan A. M. de Bont. Epoxide hydrolases from yeasts and other sources versatile tools in biocatalysis Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic. 1999,6 :199-214[3] Martha S. Smi t. Fungal epoxide hydrolases :new landmarks in sequence-activity space. TRENDS in Biotechnology. 2004,22 (3) :123-129[4]Hee Sook Kim, 0k Kyung Lee, Soo Jung Lee et al. Enantioselective epoxide hydrolase activity of a newly isolated microorganism， Sphingomonas echinoides EH—983，from seawater. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2006，41 :130-135[5] Michae 1 Kotik a，Vac lav Stepaneka，Helena Mare so va et al.Environmental DNA as a source of a novel epoxide hydrolase reacting with aliphatic terminal epoxides. Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic 2009， 56 :288-293[6] van Loo , B. ；Kingma，J. ； Arand，M. ； Wubbo 11 s , Μ. G. ； Janssen , D. B. "Diversity and biocatalytic potential of epoxide hydrolases identified by genome analysis」，Applied and Environmental Microbiology，2006，72 :2905-2917.[7] Smit, M. S. ；Labuschagne，M. "Diversity of epoxide hydrolase biocatalysts，，，Current Organic Chemistry，2006，10 :1145-1161[8]Lishan zhao, Eric J Mathur, David Weiner et al. epoxide hydrolase, nucleic acids encoding them and methods for making and using them. US 6943001[9] H. Visser aS. Vreugdenhi 1 J. A. M de Bont et al. Cloning and characterization of an epoxide hydrolase-encoding gene from Rhodotorula glutinis Appl Microbiol Biotechnol. 2000，53 :415-419[10]Kenji Gomi，Hiroyuki Yamamato and Kazuya Akimitsu Epoxide hydrolase :a mRNA induced by the fungal pathogen Alternaria alternata on rough lemon(Citrus jambhiri Lush)Plant Molecular Biology,2003 53:189-199，[ll]Michael Kotik，Vaclav Stepanek，Pavel Kyslik，et al. Cloning of an epoxide hydrolase-encoding gene from Aspergillus nigerM200， overexpression in E·coli， and modification of activity and enantioselectivity of the enzyme by protein engineering. Journal of Biotechnology 2007，132 :8-15.[12] Wei Xu, Jian-He Xu, Jiang Pan, Qing Gu， and Xin-Yah Wu. Enantioconvergent Hydrolysis of Styrene Epoxides by Newly Discovered EpoxideHydrolases in Mung Bean. Org. Lett. 2006,8(8) :1737-1740.[13]鞠鑫，潘江，許建和.綠豆環氧水解酶催化對硝基苯乙烯氧化物的對映歸一性水解·催化學報· 2008，29 (8) =696-700.

發明內容本發明的第一個目的是提供綠豆環氧水解酶及其編碼基因；本發明的第二個目的是提供一種編碼環氧水解酶DNA分子的重組表達載體的構建方法及其所獲得的重組表達載體；本發明的第三個目的是提供重組表達載體獲得的重組環氧水解酶在水解消旋環氧化物製備光學純手性中間體中的應用以及環氧水解酶的蛋白序列在植物生長、發育和抗逆中的應用。本發明的第四個目的是提供一種含有上述編碼環氧水解酶的DNA分子中8-100個連續核苷酸的互補序列探針分子。本發明所提供的綠豆中獲得的一種環氧水解酶基因，命名為VREH1，具有下列特徵之一 (1)具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列；( 在嚴格條件下與SEQ ID NO 1所示DNA 序列雜交的DNA分子；(3)由鹼基簡併性或/和鹼基替代得到的與SEQ ID NO :1所述核苷酸序列90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列，如SEQ ID NO :3。該序列在GenBank中同源搜索，未發現同源序列，為一新基因。所述嚴格條件是在0. IXSSPE(或 0. 1XSSC)，0. 1% SDS溶液中，65°C下雜交並洗膜。本發明所提供的VREHl編碼產物，是具有序列表中序列SEQ ID NO 2胺基酸序列組成的蛋白質，或其活性片段，或由序列SEQ ID NO 2胺基酸序列中經過取代、缺失和/或疊加一個或幾個胺基酸、以及在N末端和/或C末端添加數個胺基酸衍生得到的蛋白質或多肽，衍生蛋白或多肽與序列SEQ ID NO :2編碼蛋白質具有相同生物學功能，如SEQ ID NO 4。本發明還公開了所述編碼環氧水解酶的DNA分子的重組表達載體及其構建方法， 利用重組表達載體構建重組宿主(如大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞和酵母、昆蟲、哺乳動物、植物等真核細胞)，以及重組環氧水解酶在水解消旋環氧化物製備光學純手性中間體中的應用。本發明還包括VREHl的反義序列，該序列可用於抑制細胞內VREHl的表達；還包括可用作探針的DNA分子，通常具有VREHl序列中連續的10-100個鹼基的互補序列，可用於檢測樣本中是否存在編碼VREHl的基因或該基因的轉錄水平。為了解決上述問題，本發明提供了以下技術方案VREHl基因序列的獲得抽提綠豆mRNA，反轉錄得到cDNA ；比對豆科植物環氧水解酶基因的高度保守區， 設計兼併引物；以反轉錄得到cDNA為模板，PCR擴增保守區序列，RACE延伸得到綠豆環氧水解酶的完整編碼區序列。SEQ ID NO 1 =VREHl基因的核苷酸序列全長960bp，編碼319個胺基酸ATGGAAGAAATAGAGCACAGAACAGTTGAAGTGAATGGCATAAAAATGCATGTAGCAGAGAAAGGAGAGGGTCCTGTCGTGTTGTTCCTCCATGGCTTCCCCGAGCTCTGGTACTCCTGGCGCCACCAGATTCTCGCTCTCAGCTC CCGAGGCTACCGCGCCGTCGCCCCTGATCTACGTGGCTACGGTGATACAGAGGCACCAGAGTCAATCAGCAGCTACA CCATCATGCATCTCGTGGGTGACATCGTGGCACTCATAGACTCACTTGGTGTGGGTCAAGTCTTCCTCGTTGCGCAT GATTGGGGCGCCATCGTAGGATGGTACCTATGTTTGTTTCGACCAGAGAAAATCAAGGCCTACGTTTGCCTCAGCGT CCCTTTCATGCCCAGAAACCCAAAAGTCAGGCCCGTGGATGCCATGCGGGCCCTCTACGGGGATGACTACTACATCT GCAGATTCCAGGAGCCAGGCAAAGCGGAAGCTCTGTATGGCAGTAATAATAACATTGGAGAAGTAATAAAGAGCATC CTTACAAATCGGAGACCTGGACCACCAATCCTACCCAAAGAAGGGGTTGCCCTTCCTTCAGGGTCCCTTCCCTCAAG ACCCCTTCCATCTTGGCTCTCGGAGGAAGATGTCACTTATTATGCTTCTAAATTTTCAAAAACAGGCCTAACTGGGG GCCTCAACTACTACAGAAATCTCAACCTCAATTGGGAGCTCACAGCAGCATGGACTGGAGCAAAAGTGAAAGTTCCA GTAAAGTTCATTACTGGTGATTTGGATGTAGTATACACTTCACTAGGGATAAAAGACTACATAGACAGTGGTGCTTT CAAGCGAGATGTGCATTATTTGGAGGAAGTGGTTGTGCAGGAAGGGGTTGCTCACTTCAACAACCAAGAAGCTGCAG AGGATATCAGCAATCACATTTATGAATTCATCAAGAAGTTCTGASEQ ID NO 3 VREHl 基因的同源序列ATGGAAGAAATAGAGCACAGAACAGTTGAAGTGAATGGCATAAAAATGCATGTTGCAGAGAAAGGAGAG GGTCCAGTGGTGTTGTTCCTCCACGGCTTCCCTGAGCTCTGGTACTCATGGCGCCATCAGATTCTCGCTCTCAGCTC CCGAGGCTACCGCGCCGTCGCTCCCGATCTCCGTGGCTACGGTGACACCGAGGCACCAGAGTCAATCAGCAGCTACA CCTGCTTCCATCTAGTGGGTGACATCGTTGCGCTTATTGACTCTCTGGGTGTCGGTCAAGTGTTCCTTGTGGCTCAT GACTGGGGAGCCATCGTAGGTTGGTATCTATGCTTGTTTCGCCCTGAGAAAATCAAGGCCTATGTCTGCCTCAGTGT CCCTTTCATGCCCAGAAACCCAAAAGTCAGGCCCGTGGATGCCATGCGTGCTTTGTATGGAGACGACTACTATATCT GCAGATTTCAGGAGCCAGGGAAAGCGGAGGCTCTGTATGGCAGTAATAATAACATTGGAGAAGTAATAAAGAGCATC CTTACAAATCGCAGACCTGGTCCTCCAATTCTTCCCAAGGAAGGGGTTGCCCTTCCTTCAGGGTCCCTTCCCTCAAG ACCCCTTCCCTCTTGGCTCACAGAAGAAGATCTCGCCTATTATGCTTCTAAATTTTCAAAAACAGGCCTAACTGGGG GCCTCAACTACTACAGAAATTTCAACTTAAATTGGGAGTTGACGGCACCATGGACAGGAGCAAAAGTCAAGGTGCCC GTAAAGTTCATAACAGGTGAGTTGGATGTGGTATACACTTCACTAGGGATAAAAGAGTATATAGACAGCGGTGCGTT CAAGCGAGATGTGCATTATTTAGAGGAAGTGGTTGTGCAGGAAGGAGTGGCTCACTTCAATAATCAAGAAGCAGCAG AGGATATCAGCAATCACATATACGAATTTATCAACAAGTTCTGA獲得同源序列的嚴格條件是對擴增獲得的VREHl基因的核苷酸序列按照編碼相同胺基酸的原則進行密碼子的第三位鹼基替代和/或非活性中心胺基酸編碼密碼子進行鹼基替代或在其5』端和/或3』端在不引起後續閱讀框的情況下添加/減少數個鹼基。SEQ ID NO 2 =VREHl基因編碼的蛋白的胺基酸序列MEEIEHRTVEVNGIKMHVAEKGEGPVVLFLHGFPELffYSffRHQILALS SRGYRAVAPDLRGYGDTEAP ESISSYTMHLV⑶IVALIDSLGVGQVFLVAHDWGAIVGWYLCLFRPEKIKAYVCLSVPFMPRNPKVRPVDAMRAL YGDDYYICRFQEPGKAEALYGSNNNIGEVIKSILTNRRPGPPILPKEGVALPSGSLPSRPLPSWLSEEDVTYYAS KFSKTGLTGGLNYYNLNLNffELTAAffTGAKVKVPVKFITGDLDVVYTSLGIKDYIDSGAFKRDVHYLEEVVVQEG VAHFNNQEAAEDISNHIYEFIKKFSEQ ID NO 4 =VREHl基因編碼的蛋白的胺基酸同源序列MEEIEHRTVEVNGIKMHVAEKGEGPVVLFLHGFPELffYSffRHQILALS SRGYRAVAPDLRGYGDTEAP ESISSYTCFHLVGDIVALIDSLGVGQVFLVAHDWGAIVGWYLCLFRPEKIKAYVCLSVPFMPRNPKVRPVDAMRAL YGDDYYICRFQEPGKAEALYGSNNNIGEVIKSILTNRRPGPPILPKEGVALPSGSLPSRPLPSWLTEEDLAYYASKFSKTGLTGGLNYYRNFNLNWELTAPWTGAKVKVPVKFITGELDVVYTSLGIKEYIDSGAFKRDVHYLEEVVVQE GVAHFNNQEAAEDISNHIYEFINKF.VREHl基因的重組表達依據VREHl基因的核苷酸序列和表達載體可用的多克隆位點，設計特異性引物， 從cDNA模板中擴增目標基因，限制性酶切後與相應的表達載體連接，轉化、篩選得到重組表達質粒。轉化相應的宿主細胞，並在其內表達。所述宿主細胞可以是大腸桿菌、枯草桿菌等原核細胞或者酵母、昆蟲、哺乳動物、植物等真核細胞。所述特異性引物為FATGGAAGAAATAGAGCACAG ； R TCAGAACTTCTTGATCA A本發明的優點在於，本發明公開的從綠豆中獲得的一種環氧水解酶(VREHl)的編碼序列，在GenBank中同源搜索，未發現同源序列，為一新基因，並且首次衍生獲得VREHl相應的胺基酸序列，分析了其主要功能區。本發明基因的發現不僅擴大了環氧水解酶基因的資源，為進一步闡明該酶在植物抗逆和發育過程中的作用提供了便利，而且為構建生物有機合成中製備光學純環氧化物和鄰二醇的基因工程菌提供了科學依據。

圖1為綠豆總RNA抽提結果；圖2為PCR擴增目標基因，其中，M代表MarkerIII ； 1代表陰性對照；2代表綠豆環氧水解酶；圖3為VREHl的核苷酸序列和編碼的蛋白的胺基酸序列；圖4為SDS-PAGE分析重組菌的表達，其中1代表1#菌誘導前的樣本；2代表1#菌誘後的樣本；3代表2#菌誘前的樣本；4代表2#菌誘導後的樣本；圖5為重組酶催化對硝基苯乙烯氧化物前後樣本的薄層層析結果圖，其中，1代表重組酶作用後樣本，底物完全轉化生成產物二醇；2代表重組酶作用前的底物對硝基苯乙烯氧化物；圖6為重組酶催化對硝基苯乙烯氧化物前後樣本的HPLC分析圖；圖7 (a)、圖7 (b)為VREHl基因DNA序列與已報導的環氧水解酶DNA序列的進化分析圖，其中(a)序列比對；(b)進化樹；圖8為VREHl基因編碼蛋白序列與已報導的環氧水解酶蛋白的進化分析圖；圖9為VREHl基因編碼蛋白序列與已報導的植物來源的環氧水解酶蛋白序列比對圖。
具體實施方式下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
做詳細說明。實施例IVREHl基因的獲得I、RNA的提取和cDNA的獲得綠豆總RNA提取取適量綠豆種子，在液氮中研磨成粉，加入Iml Trizol,混勻放置5min後，加入200μ 1氯仿，混勻放置5min，4°C，12000Xg離心IOmin ；取上清，加入 200 μ 1 3Μ NaAc，再次離心取上清；加入氯仿，離心除蛋白和多糖；上清液中加入250 μ 1異丙醇沉澱RNA ；4°C 12000 Xg離心lOmin，棄上清，用75%乙醇洗滌；沉澱用50 μ ITE溶解。電泳和分光光度計檢測mRNA質量和純度。cDNA 的獲得取 l-2ug RNA，依照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)試劑盒步驟進行反轉錄，獲得cDNA。綠豆總RNA抽提結果見圖1所示。II、目的基因VREHl的獲得根據土豆和大豆環氧水解酶基因的高度同源區設計引物。F GGCTTCCCTGAGCTCTGGTACT, R :CTCCTGTCCATGGTGC，以綠豆反轉錄得到的 cDNA 為模板，擴增約600bp的部分目標序列。具體步驟如下反應體系總體積為20μ 1，內含 0. 5μ IcDNAU μ 1 引物、10 μ 1 2 XPCRMixture (東盛)。反應程序為95°C預變性5min後，以95°C變性30s、50°C退火30s、72°C延伸Imin 反應25個循環，72°C延伸lOmin。反應結束後進行電泳檢測，並回收目的片段。回收的目的片段與克隆載體PMD18T連接獲得克隆質粒，挑單克隆培養過夜後，抽提質粒鑑定，陽性克隆測序驗證。Blast進行同源搜索，確證是否為目標環氧水解酶序列。根據hvitrogen RACE試劑盒的操作步驟，分別以上述兩個引物為3』 -RACE 和5』 -RACE的基因特異性引物，與試劑盒中RACE引物搭配，擴增延伸，電泳檢測，回收 800-1500bp之間的目標片段，與克隆載體連接、轉化、鑑定、測序，拼接後得到目標綠豆環氧水解酶的編碼序列。實施例2環氧水解酶基因VREHl在大腸桿菌中的克隆與表達根據拼接得到的序列設計引物，正向引物F-Nde為GGCATATGGAGCAAATAAAGCAC， 反向引物R-HindIII為:GCAAGCTTCAGAACTTCTTGATCAA(下劃線部分分別為引入的酶切位點 Nde I和HindIII)；以綠豆反轉錄得到的cDNA為模板，PCR擴增，擴增條件為95°C預變性 5min後，以95°C變性30s、50°C退火30s、72°C延伸Imin反應25個循環，72°C延伸lOmin。 反應結束後進行電泳檢測，結果如圖2所示，並回收目的片段。回收的目的片段與克隆載體 PMD18T連接、轉化、抽質粒酶切鑑定，篩選陽性重組子，測序驗證。用Nde I和Hind III雙酶切陽性克隆載體和空表達載體pET48a(+)，分別回收目標基因片段和線性化載體片段，連接、轉化、鑑定，獲得陽性表達重組子。重組子轉化表達菌E. coli BL21(DE3)，挑單克隆培養過夜，第二天轉接，37°C培養至對數期，加入終濃度為0. 5mmol的IPTG在37°C誘導表達3H菌液超聲破碎後，電泳檢測目標蛋白表達情況，結果見圖4。以對硝基苯環氧化物為底物，檢測重組酶的活力。實施例3重組酶的同源性分析將VREHl序列與Genebank資料庫中已報到的環氧水解酶編碼基因進行比對和進化樹分析(圖7)。圖7中各縮寫分別代表Ah 落花生DQ889519. 1 ；Asp N黑麴黴Asp N DQ443737 ；Asp N2DQ443738 ；Asp F 煙麴黴 XM749627. 2 ；At 擬南芥 gi30683229 ；Ca 鷹嘴豆 AJ487037. 1 ；Cec 秀麗隱杆線蟲 NM_073^1. 3 ;Dmj 黑腹果蠅 NM_137541. 3 ;Gm 大豆，Gml BT093943, Gm2, X78547, Gm3AF529301. 1，Gm4BT095178 ；Hs 人 NM_001979. 4 ；Mm 小鼠 NM_007940. 3 ；Nt 咖啡 GT021148. 1 ；Mt 蒺藜苜蓿 gi 56899956 ；Os 水稻 EF576088. 1 ； 0s2, AY319965. 1 ；St 馬鈴薯 M1U02498. lSt2U02498. 1 ；Tc 水芹 NM_116467 ；Sc 馬鈴薯 AM050815. 1 ；VR 綠豆我們的序列VREH1。由圖可以發現VREHl與土豆、擬南芥、水芹、苜蓿、 鷹嘴豆、大豆中兩種基因屬同一分支，且與苜蓿、鷹嘴豆、大豆中兩種基因的親緣關係最近。
將VREHl編碼的蛋白序列與Swiss-Port蛋白資料庫中相關序列比對，如圖8 所示，進化樹分析更清楚地表明了 VREHl在進化過程中與其他環氧水解酶的親緣關係， 進化樹所需要的序列全部來自SWISS-PORT蛋白資料庫中的環氧水解酶全長序列。圖中 Ah 落花生 ACF74284. 1 ；Asp N 黑麴黴 Asp NABE98162. 1 ；Asp N2ABE98163. 1 ；Asp F 煙麴黴XM 749627. 2 ；At 擬南芥NP_193331. 6 ；Ca 鷹嘴豆CAD31713 ；Cec 秀麗隱杆線蟲 NP_505662. 1 ；Dmj 黑腹果蠅 NP_611385. 1 ；Gm 大豆 Gml ACU18288, Gm2 CAA55293. 1， Gm3 AAM94615. lGm4 ACU19450 ；Hs 人 NP_001970. 2 ；Mm 小鼠 NP_031966 ；Mt 蒺藜苜蓿 Mt， ABN08020,Mt2ABN08024 ；Nb =Nicotiana benthamiana, NblACE82565 ；Nt 咖啡 GT021148. 1 ； Os 水稻 ABR25676 ；0s2, AAR18812 ；Sc =Solanum commersonii 茄屬 CAJ19276. 1 ；St 馬鈴薯 StlAAA81891, St2AAA81893. 1 ；Tc ^K 芹 NP_567228 ； VR 綠豆我們的序列；Vv =Vitis vinifera CBI39538. 3。從圖8、圖9的進化樹分析和同源比對分析可以看出，VREH 1編碼蛋白與豆科植物的環氧水解酶序列具有較高的同源性，催化活性區高度保守。實施例5同源序列的重組、表達與活性分析依照實例4中環氧水解酶胺基酸同源序列比對結果，根據日本東洋坊(Τ0Υ0Β0)定點突變試劑盒(KOD-Plus-Mutagenesis Kit)引物設計原則，設計下列突變引物。
權利要求
1.一種編碼環氧水解酶的DNA分子，其序列滿足下述任一條件(1)SEQID NO 1所示核苷酸序列；(2)在嚴格條件下與(1)限定的DNA序列雜交的DNA分子；(3)由鹼基簡併或/和替代衍生的與(1)所述核苷酸序列90%以上同源性，且與(1) 編碼相同功能蛋白質的序列。
2.一種環氧水解酶，其胺基酸序列如(1)或( 所示(1)SEQID NO :2所示的胺基酸序列；(2)在(1)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或/和疊加一個或幾個胺基酸衍生得到的，且與(1)編碼蛋白質具有相同功能的衍生蛋白質的胺基酸序列。
3.—種權利要求1所述的編碼環氧水解酶DNA分子的重組表達載體的構建方法，其特徵在於，依據權利要求1所述的環氧水解酶基因的核苷酸序列和表達載體可用的多克隆位點，設計特異性引物，從cDNA模板中擴增目標基因，限制性酶切後與相應的表達載體連接， 轉化、篩選得到重組表達質粒，轉化相應的宿主細胞，並在所述宿主細胞內表達，所述宿主細胞是原核細胞或真核細胞。
4.根據權利要求3所述的構建方法，其特徵在於，所述原核細胞指大腸桿菌或枯草桿菌，所述真核細胞指酵母、昆蟲、哺乳動物或植物中的一種。
5.根據權利要求3所述的構建方法，其特徵在於，所述特異性引物中含F:ATGGAAGAAATAGAGCACAG ；R :TCAGAACTTCTTGATCAA。
6.一種通過權利要求3所述的構建方法獲得的重組表達載體，其特徵在於，含有權利1 要求所述的DNA。
7.權利要求6所述的重組表達載體獲得的重組環氧水解酶在水解消旋環氧化物製備光學純手性中間體中的應用。
8.權利要求1所述的環氧水解酶的核苷酸序列或權利要求2所述的環氧水解酶的蛋白序列在植物生長、發育和抗逆中的應用。
9.一種探針分子，其特徵在於，含有權利要求1所述DNA分子中10-100個連續核苷酸的互補序列。
全文摘要
本發明公開了從綠豆中獲得的一種環氧水解酶(VREH1)的編碼序列，在GenBank中同源搜索，未發現同源序列，為一新基因，並且首次衍生獲得VREH1相應的胺基酸序列，分析了其主要功能區。本發明還公開了所述編碼環氧水解酶的DNA分子的重組表達載體及其構建方法，以及在水解消旋環氧化物製備光學純手性中間體中的應用。本發明基因的發現不僅擴大了環氧水解酶基因的資源，為進一步闡明該酶在植物抗逆和發育過程中的作用提供了便利，而且為構建生物有機合成中製備光學純環氧化物和鄰二醇的基因工程菌提供了科學依據。
文檔編號C12N15/63GK102382847SQ20101026694
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月27日 優先權日2010年8月27日 公開號201010266947.9
發明者範立強, 許建和, 賀婉紅, 趙健 申請人:華東理工大學