Rtef-1變體及其用於抑制血管發生的用途的製作方法

2023-08-13 07:53:31

專利名稱：Rtef-1變體及其用於抑制血管發生的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域並且特別是涉及血管形成中所涉及的過程(血管發 生)。
背景技術：
轉錄增強因子1相關(RTEF-I)基因是TEA DNA結合結構域基因家族成員。TEA DNA 結合結構域基因家族從構巢麴黴(Aspergillus nidulans)、酵母、果蠅屬(Drosophila)、小 鼠至人高度保守。TEA DNA結合家族蛋白質可參與不同基因的活化或阻抑，並且它們的這 些特定功能可以通過與其他蛋白質的結合而改變(Kaneko和DePamphilis，1998)。已經在 多種哺乳動物組織，包括心臟、骨骼肌、胰、胎盤、腦和肺中鑑定出這些基因特定成員的表達 (Stewart 等，1996 ；Yasunami 等，1996 ；Farrance 等，1996)。對於轉錄增強因子 _1 (TEF-I)， 已經在一種組織如胰中鑑定出源於一個基因的選擇性剪接的同種型(Zuzarte等，2000 ； Jiang等，2000)。這些基因在哺乳動物眼中的表達譜尚未見報導。RTEF-I基因轉錄物從雞組織中首次鑑定出來，並且證明在心肌和骨骼肌中富集 (Farrance等，1996)。雞RTEF-I結合肌細胞特異性CAT(M-CAT)順式DNA元件並且調節 肌肉特異性基因的表達，並且對於完全的轉錄活化需要肌肉特異性輔因子。隨機篩選2166 個人結腸直腸癌cDNA文庫鑑定出部分cDNA RTEF-I序列，這導致從心cDNA文庫分離出禽 RTEF-I的全長人同系物(Stewart等，1996 ；Frigerio等，1995)。對人組織的Northern印跡 分析表明在骨骼肌和胰中表達水平最高，在心、腎和胎盤中表達水平較低，而在肝、肺或腦 中未檢測到信使(Stewart等，1996)。對小鼠RTEF-I同系物的Northern印跡分析顯示了與 人不同的組織表達方式。成年小鼠肺組織表達水平最高，在腎、心和骨骼肌中水平極低，在 肝、胸腺、脾和腦中未檢測到，而RTEF-I信使在小鼠胚胎骨骼肌中豐富(Yockey等，1996)。 已經在小鼠骨骼肌細胞中鑑定出RTEF-I的小鼠選擇性剪接同種型，與全長基因相比，該同 種型缺乏外顯子5 (Yockey等，1996)。血管內皮生長因子(VEGF)是一種促血管生成因子，已知在視網膜組織中，低氧條 件將其上調(Young 等，1997 ；Pierce 等，1996 ；Donahue 等，1996 ；Pe' er 等，1995)。最近， 已經鑑定出全長RTEF-I蛋白質不但結合VEGF啟動子，而且還上調VEGF表達，例如在低氧 條件下的牛主動脈內皮細胞中(BAEC) (Shie等，2004)。微列陣分析顯示，低氧條件下的 BAEC中RTEF-I表達上調3倍。令人驚訝地，RTEF-I通過與VEGF啟動子內的Spl元件，而 非M-CAT模體相互作用介導VEGF基因活化。而且，RTEF介導的VEGF表達的實現不依賴於 低氧誘導因子(HIF-I)和低氧應答元件(HRE)途徑的活化(Shie等，2004)。VEGF過表達已經牽涉許多種血管生成性病症，如腫瘤血管發生和異常新血管形 成。例如，已經非常確定，VEGF在早產兒視網膜病變(ROP)和其他眼睛新血管形成疾病的發展和嚴重性中起著重要的作用(Lashkari等，2000 ；Miller, 1997 ；Vannay等，2005 ；Young 等，1997)。考慮到VEGF在此類病症中的突出作用，已經開發出用於抑制VEGF活性的許多 治療策略。然而，當前的VEGF阻斷治療典型地引起抑制細胞外VEGF與相應細胞表面受體 的相互作用。因此，需要用於VEGF阻斷的可替代的策略，例如用於抑制VEGF產生的方法。

發明內容
在第一個實施方案中，本發明提供分離的顯性失活(DN)的RTEF-I多肽，包含具 有一個或一個以上內部缺失的RTEF-I胺基酸序列。如本文所使用的術語顯性失活意思是 指RTEF-I變體抑制或降低如SEQ ID NO 1所例舉的完整RTEF-I多肽的活性。例如，在某 些方面中，DN RTEF-I變體可以定義為當在細胞表達時抑制或者降低VEGF啟動子活性的多 肽。此外，在一些情況下，DN RTEF-I可以定義為降低或抑制低氧誘導的或RTEF-I (例如SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4)誘導的VEGF啟動子活性的多肽。在某些方面中， RTEF-I胺基酸序列可以是哺乳動物RTEF-I胺基酸序列，優選人RTEF-I胺基酸序列。因此，在某些方面中提供包含一個或一個以上內部胺基酸缺失的DNRTEF-I多肽。 例如，在某些情況下DN RTEF-I可以包含由外顯子3、4、5、6、7、8、9或10編碼的胺基酸的缺 失。例如，在某些特定實施方案中，DN RTEF-I可以包含由外顯子4、5、6、7、8和/或9編碼 的全部胺基酸序列的缺失。此外，在某些特定情況下，DN RTEF-I可以包含來自外顯子3和 /或外顯子10的胺基酸的部分缺失，例如由外顯子3編碼的大約最後5個胺基酸的缺失或 者由外顯子10編碼的大約最初11個胺基酸的缺失。此外，本領域技術人員將會理解，與野 生型RTEF-I序列，諸如人RTEF-I序列相比，DN RTEF-I可以包含胺基酸替代。因此，在某 些情況下，DN RTEF-I可以定義為包含一個或一個以上內部胺基酸缺失的RTEF-I多肽，其 中 DN RTEF-I 與野生型 RTEF-I 序列(例如 SEQID NO =USEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 4)在 非缺失胺基酸區域範圍內有大約或者至少大約70、75、80、85、90、95、98或99%相同。在一 些非常特別的方面中，RTEF-I顯性失活多肽可以包含與SEQ ID N0:3(由651bp cDNA編碼 的胺基酸序列)有大約或者至少大約70、75、80、85、90、95、98或99%相同的RTEF-I氨基 酸序列。在一些非常特別的方面中，DN RTEF-I多肽可以包含由SEQ ID NO :3給出的序列。 本發明考慮的DN RTEF-I多肽的更多實施方案在具體實施方式
中提供。在一些進一步的方面中，DN RTEF-I多肽可以包含細胞內化部分。在一些情況下， 細胞內化部分可以結合或綴合至DN RTEF-I多肽。例如，DN RTEF-I可以與脂質體囊泡的 複合體提供，由此使多肽穿過細胞膜成為可能。此外，在一些特定實施方案中，細胞內化部 分可以是肽、多肽、適體或高親合性多聚體(avimer)(見例如美國申請號20060234299和 20060223114)序列。例如，細胞內化部分可以包含來自HIV tat、HSV-I間層蛋白VP22或 果蠅屬觸角蛋白(antermopedia)的胺基酸。在某些近一步的方面中，細胞內化部分可以是 工程化的內化部分，諸如由Wright等(2003)和Rothbard等(2000)等描述的聚精氨酸、聚 甲硫氨酸和聚甘氨酸肽。例如，細胞內化部分可以是此處例舉的RMRRMRRMRR(SEQ ID NO 23)。因此，在一些情況下，多肽細胞內化部分和DN RTEF-I多肽可以包含融合蛋白。因此，在某些情況下，提供包含細胞內化部分和DN RTEF-I序列的DNRTEF-I融合 蛋白。技術人員會理解，此類融合蛋白可額外包含將細胞內化部分與DN RTEF-I多肽序列 分開的一個或一個以上胺基酸序列。例如，在一些情況下，連接體序列可分開這樣的兩個結
5構域。例如，連接體序列可以包含帶有大量或者大程度構象自由的「撓性」胺基酸，諸如多 聚甘氨酸連接體。在一些情況下，連接體序列可以包含蛋白酶切割位點。例如，在某些方面 中，連接體序列可以包含被細胞內蛋白酶識別和切割的切割位點，因此一旦融合蛋白被內 化，則將DN RTEF-I序列從內化序列釋放出來。在本發明的進一步的方面中，細胞內化部分可以進一步定義為細胞靶向部分，其 是僅僅被所選擇細胞群體，諸如表達特定細胞受體的細胞結合或內化的部分。此類細胞靶 向可以包括例如結合細胞表面蛋白的抗體、生長因子、激素、細胞因子、適體或高親合性多 聚體。如本文所使用的術語抗體可以指IgA、IgM、IgE、IgG、Fab、F(ab' )2、單鏈抗體或者 互補位肽。在某些情況下，本發明的細胞靶向部分可以靶向特定類型的細胞，諸如視網膜細 胞、內皮細胞、虹膜細胞或神經元細胞。在仍然進一步的方面中，本發明的細胞靶向部分可 以定義為癌細胞結合部分。例如，在一些非常特別的情況下，本發明的細胞靶向部分可靶向 癌細胞相關抗原，如gp240或Her-2/neu。在本發明的仍然進一步的方面中，DN RTEF-I多肽可以包含額外的胺基酸序列，諸 如細胞運輸信號(例如細胞分泌信號、核定位信號或者細胞核輸出信號)或者報告分子多 肽，諸如酶或螢光蛋白。在優選的方面中，例如，DN RTEF-I多肽包含細胞分泌信號。例如， 如本文所例舉，DN RTEF-I多肽可以包含來自人基因的分泌序列，諸如IL-2分泌信號序列 (MYRMQLLSCIALSLALVTNS, SEQ ID NO :22)。因此，在某些情況下，DN RTEF-1多肽可以包含細 胞內化部分和細胞分泌信號，由此允許多肽被一種細胞分泌並被內化進入周圍的細胞內。在本發明的進一步的實施方案中，提供包含編碼如上所述DN RTEF-I多肽序列的 分離的核酸序列。因此，編碼本文所述任何DN RTEF-I多肽或多肽融合蛋白的核酸序列也 作為本發明的部分包括在內。技術人員會理解，鑑於遺傳密碼子的簡併性，許多種核酸序列 可用於編碼相同的多肽。在某些情況下，例如編碼任何特定胺基酸的密碼子可以被改變以 改善細胞表達或者降低核酸在基因組RTEF-I位點重組的機會。在優選的方面中，編碼DN RTEF-I多肽的核酸序列包含在表達盒內。如本文所使 用的術語「表達盒」意思是指使得DN RTEF-I在細胞、或更特別地在真核細胞內表達的所包 含的額外核酸序列。此類額外的序列可以包含例如啟動子、增強子、內含子序列(例如在DN RTEF-I編碼區之前、之後或者之內)或者多腺苷化信號序列。技術人員會認識到，表達盒中 包含的序列可以用於改變DNRTEF-I的表達特性。例如，細胞類型特異性、條件性或可誘導 啟動子序列可用於將DN RTEF-I限制在所選擇的細胞類型或生長條件下。例如，在某些情 況下，低氧可誘導啟動子可用於本發明的RTEF-I表達盒中。此外，在一些情況下，在眼的癌 細胞或細胞中具有增強活性的啟動子可以使用。此外，考慮了可對RTEF-I多肽序列做某些 改變以便增強表達盒，例如如本文所例舉的表達盒的表達，DNRTEF-I的起始密碼子可以改 變成ATG以促進高效翻譯。在本發明的仍然進一步的方面中，DN RTEF-I編碼序列可以包含在表達載體中， 諸如病毒表達載體。用於根據本發明使用的病毒表達載體包括但不限於腺病毒、腺伴隨病 毒、皰疹病毒、SV-40、反轉錄病毒和痘苗病毒載體系統。在某些優選的方面中，反轉錄病毒 載體可以進一步定義為慢病毒載體。在一些情況下，此類慢病毒載體可以是自失活(SIN) 慢病毒載體，諸如美國申請號20030008374和20030082789中描述的那些，美國申請號 20030008374和20030082789併入本文作為參考。
在仍然進一步的實施方案中，本發明涉及用於降低或抑制RTEF-I依賴性轉錄活 性的方法。如本文所使用的術語RTEF-I依賴性轉錄活性指，被如SEQ IDNO =USEQ ID NO: 2或SEQ ID NO :4所例舉的全長或者完全活性RTEF-I多肽的表達所介導或增強的轉錄。因 此，在一些方面，本發明提供用於抑制或降低VEGF啟動子活性(並且由此抑制或降低VEGF 表達)的方法，包括在細胞中表達DN RTEF-I多肽。因此，在特定實施方案中，提供用於治療 患有血管生成性病症的患者的方法，包括向患者施用有效量的治療組合物，所述治療組合 物包含如上所述的RTEF-I顯性失活多肽或者編碼RTEF-I顯性失活多肽的核酸表達載體。 在優選的方面中，本文所描述的方法可用於治療人患者。如本文所使用的術語血管生成性病症指涉及不良血管形成的病症，諸如眼新血管 形成、動靜脈畸形、冠狀動脈再狹窄、外周血管再狹窄、腎小球腎炎、風溼性關節炎或癌症 (例如腫瘤血管形成)。因此，在某些情況下，本發明方法可以用於治療眼病，諸如黃斑變 性(例如年齡相關的黃斑變性(AMD))、角膜移植排斥、角膜新血管形成、早產兒視網膜病變 (ROP)和糖尿病視網膜病變。例如，本發明方法可以用於治療溼性或乾性AMD。因此，在某 些情況下，本發明方法可用於治療多種AMD相關的眼病變，諸如典型為主性、微小典型性和 隱匿無典型性損害(Gragoudas等，2004)。技術人員會理解，額外的抗血管生成治療可以與本發明方法組合或結合使用。此 種額外的治療可以在本文所述方法之前、之後或者基本上同時施用。例如，額外的抗血管生 成治療可以拮抗VEGF和/或FGF信號途徑。因此，在一些情況下，額外的治療可以包括施用 結合VEGF、VEGF受體、FGF或FGF受體的抗體。在某些特定方面中，本發明的方法和組合物 可以與AVASTIN (貝伐單抗)、LUCENTIS (蘭尼單抗)、MACUGEN (哌加他尼 鈉)或抗炎藥結合使用。因此，在某些特定情況下，提供包含在可藥用載體中的DN-RTEF-I 成分和貝伐單抗或哌加他尼鈉的治療組合物。在仍然進一步的方面中，調節血管發生的基 因可以與本發明方法結合遞送。例如，在一些方面中，調節血管發生的基因可以是金屬蛋白 酶組織抑制劑、內皮抑制素、血管抑制素、內皮抑制素XVIII、內皮抑制素XV、kringle 1_5、 PEX、基質金屬蛋白酶-2的C末端血管素結合蛋白結構域、人纖維蛋白溶酶原的kringle 5 結構域、內皮抑制素和血管抑制素的融合蛋白、內皮抑制素和人纖維蛋白溶酶原kringle 5 結構域的融合蛋白、幹擾素Y誘導的單核因子(Mig)、幹擾素α可誘導蛋白IO(IPlO)、Mig 和IPlO的融合蛋白、可溶性FLT-I (鰭樣酪氨酸激酶1受體)、和激酶插入結構域受體(KDR) 基因。在某些特定方面中，此類血管生成調節物基因可以可以在病毒載體，諸如美國專利 7，122，181中所述的慢病毒載體中遞送，美國專利7，122，181通過參考併入本文。如上所述，在某些方面中，本發明提供用於治療癌症的方法。因此，在某些情況下， 所述方法可以用於限制或者減少向腫瘤的血液流動，由此降低腫瘤生長或轉移。在某些情 況下，本文的方法可以用於抑制或治療轉移癌。許多種癌症類型可以用本發明方法治療，例 如治療的癌症可以是膀胱癌、血癌、骨癌、骨髓癌、腦癌、乳腺癌、結腸癌、食道癌、眼癌、腸胃 道癌、牙齦癌、頭癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、頸癌、卵巢癌、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、睪丸 癌、舌癌或子宮癌。此外，額外的抗癌治療可以與本發明方法組合或結合使用。此類額外治 療可以在本發明方法之前、之後或同時施用。例如，額外的抗癌治療可以是化學療法、手術 療法、免疫療法或放射療法。考慮了本發明的DN RTEF-I組合物可以向患者局部性或者全身性施用。例如，本發明的方法可以包括局部、靜脈內、真皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺 內、胸膜內、氣管內、眼內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、肌內、腹膜內、皮下、結膜下、球 囊內(intravesicularIy)、黏膜、心包內、臍內、眼內、經口、經吸入、經注射、經灌注、經連續 灌注、經直接浸浴靶細胞的局部灌注、經導管或經灌洗施用DN RTEF-I組合物。如上所述，在 DNRTEF-I組合物向眼睛遞送的一些情況下，施用可以是例如經局部、結膜下、眼周、眼球後、 筋膜囊、前房內、玻璃體內、眼內、視網膜下、後近鞏膜或脈絡膜上施用。在某些方面中，DN RTEF-I組合物可以通過眼內注射、局部施用而向眼睛局部性施用(例如以滴眼劑製劑)。在一些進一步的實施方案中提供包含在瓶中的本發明的藥物組合物，所述瓶包含 能夠使組合物點滴施用的出射口。在一些情況下，瓶中所包含的藥物組合物包含多劑量，然 而在某些方面中，瓶包含用於向一隻或兩隻眼睛施用的單一劑量單位，優選地在1-2滴制 劑中包含單一劑量單位。如本文所使用的術語「瓶」指任何流體容器，諸如安瓿、滴管或注 射器。在本發明方法和/或組合物背景下所討論的實施方案可以用於本文所述的任何 其他方法或組合物。因此，關於一種方法或組合物的實施方案同樣可以應用於本發明的其 他方法和組合物中。如本說明書所使用，「一」可以指一個或一個以上。如權利要求書中所使用，詞「一」 與詞「包含」結合使用時意思是指一個或一個以上。權利要求書中「或」的使用用於指「和/或」，除非明確指出是僅指替代物或者替代 物相互排斥，雖然本公開支持指僅僅替代物和「和/或」的定義。如本文所使用「另一」可 以指至少第二個或者更多。在本申請通篇中，術語「大約」用於指數值包括設備、被採用來測定數值的方法或 者研究受試者當中所存在變化的固有誤差變動。不分明的其他目標、特徵和優勢根據下列詳細描述會變得顯而易見。然而，應當理 解，詳細描述和指示本發明優選實施方案時的特定實例僅以例舉的方式給出，因為根據該 詳細描述，處於本發明精神和範圍之內的各種改變和修改對本領域技術人員而言是顯而易 見的。


下列附圖是本說明書的一部分，並且內含著進一步說明本發明的某些方面。通過 參考附圖並結合著本文所提出的特定實施方案的詳細描述可以更好地理解本發明。圖IA-B =RTEF-ImRNA剪接在低氧時被改變。視網膜和虹膜內皮細胞置於低氧條 件下並且通過RT-PCR分析RTEF-I剪接。圖1A，通過RT-PCR鑑定的RTEF-I剪接變體的示 意圖。顯示了每一剪接變體的非翻譯區(斜影線)和胺基酸編碼區(空柱)的外顯子序 列。也圖示了推定的RTEF-I功能結構域，方格框指示TEA DNA結合結構域(星號顯示預測 的α "螺旋的位置)，實心框指示核定位信號(外顯子4)，垂直影線指示活化結構域(脯氨 酸豐富結構域(PRD))並且水平影線指示外顯子9和10內的兩個STY結構域。圖1Β，瓊脂 糖凝膠電泳的再現，顯示從人視網膜血管內皮細胞(RVEC)原代培養製備的RTEF-I特異性 RT-PCR產物。泳道1和4 =DNA梯帶；泳道2 從正常含氧量條件下的RVEC製備的cDNA，得 到2個產物(1305和936bp大小)；泳道3 從低氧條件下的RVEC製備的cDNA,得到3個產物(1305,936 和 447bp 大小)。圖2 =RTEF-I變體活化或抑制VEGF啟動子。293T細胞以VEGF啟動子報告分子 構建體(VEGF啟動子驅動分泌的鹼性磷酸酶)連同包含所標明RTEF-I變體的表達載體轉 染。結果顯示，以pSEAP-VEGF啟動子加上包含1305bp (柱1)、936bp (柱2)、651bp (柱3)、 ss-651-RMR bp (柱6)或447bp (柱4) RTEF-I變體的pcDNA表達構建體轉染6小時後的培 養基AP活性。柱5顯示與無插入片段的pcDNA對照質粒共轉染的對照VEGF啟動子活性。圖3 =RTEF-I對VEGF啟動子活性的調節依賴於包含4個SPl結合位點的VEGF啟 動子部分。如上所述，細胞以包含1305bp (柱l)、936bp (柱2)、651bp (柱3)、ss-651bp (柱 6)或447bp (柱4) RTEF-I變體的pcDNA表達構建體和包含完整VEGF啟動子(實柱)或帶 有從-113位核苷酸至-57位核苷酸缺失的VEGF啟動子(空柱)的報告載體轉染。柱5顯 示與無插入片段的PcDNA對照質粒共轉染的對照VEGF啟動子活性。圖4:651bp RTEF-I以顯性失活起作用。如上所述，細胞以pSEAP_VEGF和單獨的 (柱 1、3 和 5)或者外加 ss-651-RMR bp RTEF-1 變體(柱 2、4 和 6)的 1305bp (柱 1、2)、 936bp (柱 3、4)或 447bp (柱 5、6)RTEF-1 變體轉染。圖5A-C =RTEF-I多肽的檢測。針對RTEF-1獨特的、但每一天然存在變體共有的氨 基酸序列產生抗體。圖5A是RTEF-I的一個區域與相關轉錄因子之間的胺基酸比對。用於 產生抗體的胺基酸序列加下劃線。圖5B，使用抗RTEF-I抗體的免疫印跡的再現。用於分析 的細胞裂解物來自轉染有PcDNA空載體(泳道2和8)或1305bp (泳道3、9)、936bp (泳道 4、10)、651bp (泳道5、11)或447bp (泳道6、11) RTEF-1變體的pcDNA表達載體的細胞。對 每一 RTEF-I變體的檢測通過橢圓形標明。泳道1和7為分子量標準。泳道1-6代表來自 泳道7-12的過曝光圖像。圖5C，使用抗RTEF-I抗體從轉染有pcDNA 651bp RTEF-I表達載 體的細胞中檢測RTEF-I變體的免疫印跡的再現。預期的 24KDa多肽通過箭頭標明。圖6A-B =RTEF-I變體在眼睛中表達。圖6A，免疫印跡的再現，顯示正常靈長類眼組 織中的RTEF-I表達。免疫印跡分析在來自視網膜(泳道1)、脈絡膜(泳道2)和虹膜(泳 道3)組織裂解物的蛋白質上開展。M指示分子量標準。圖6B，溴化乙錠染色的瓊脂糖凝 膠的再現，用於顯示使用RTEF-I特異性引物產生的半定量RT-PCR產物。泳道1顯示來自 CRAO視網膜的結果而泳道2顯示來自對照視網膜RNA的結果。圖7A-D =RTEF-I在靈長類眼組織中表達的免疫組織化學分析。圖7A-B，RTEF-I強 染色定位於虹膜(I)、睫狀體(CB)、視神經(ON)和視網膜(R)。角膜(C)和晶狀體(L)為 RTEF-I抗體雜交陰性。圖7C-D，最強的RTEF-I染色出現在神經節細胞層(GCL)和內核層 (INL)。染色定位在細胞質和細胞核中。在外層缺乏染色。
具體實施例方式最近，已經開發出許多種抑制血管生成信號的策略，用於治療癌症和血管生成性 病症諸如AMD目的的。具體而言，許多種策略集中於通過抑制VEGF與一種或兩種其表面受 體的結合而阻斷VEGF信號。然而，這些策略不能夠解決啟動異常血管發生的VEGF最初產 生。因此，抑制VEGF產生的新方法和組合物可以提供用於VEGF阻斷的新方法和對所產生 的血管發生的治療。為此目的，在某些方面中，本發明提供在VEGF活化中所必需的顯性失 活轉錄因子。此外，由於本發明涉及靶向細胞內過程，因此本發明的治療可以靶向特定細胞類型，由此減少不良的全身性副作用。因此，本發明提供治療血管生成性病症的新方法和/ 或增強當前VEGF阻斷策略有效性的途徑。RTEF-I是多功能轉錄因子家族的成員，並且已經證明是VEGF轉錄、包括低氧誘導 的VEGF轉錄的激活劑。然而，如本文所顯示，細胞中產生多種RTEF-I剪接變體並且從選擇 性RNA剪接變體產生的RTEF-I多肽包含改變的轉錄功能(圖1A，B)。具體而言，一種大約 651鹼基對的RTEF-I轉錄物產生抑制VEGF啟動子活性的多肽(圖2，比較柱3和5)。此外， 已經證明，當該RTEF-I變體以與分泌信號和細胞內化多肽的融合蛋白提供時，它是VEGF啟 動子的甚至更有效的抑制劑(圖2，柱6)。重要的是，如圖4中所示，來自651bp RTEF-I轉 錄物的多肽以顯性失活方式作用。這就是說，多肽不但降低VEGF啟動子活性，而且還阻斷 其他RTEF-I蛋白質同種型對VEGF啟動子的增強作用。此外，如圖6和7中所示，RTEF表 達於眼組織中，由此暗示其在眼新血管形成病症發展中起重要作用。本文研究表明，RTEF-I 對VEGF產生的活化可能是促成新血管形成病症發展的因素之一。因此，本發明的方法和組 合物可以提供用於預防早期階段新血管形成的手段。本發明提供新DN RTEF-I多肽及其預防或抑制血管生成性病症的用途。DNRTEF-I 多肽可以直接遞送至細胞內環境中或者在所靶向細胞內表達以阻斷VEGF產生。此類顯性 失活多肽不但下調新生VEGF的產生，而且還下調在諸如低氧過程中常常被RTEF-I刺激的 VEGF的產生。因此，本發明的組合物可以用於降低所靶向細胞和組織募集新血管形成的能 力。這對於例如血管侵入與疾病發病機制直接相關的眼新血管形成病症，諸如AMD具有重 要意義。此外，DN RTEF-I可以用於通過降低腫瘤或腫瘤轉移灶經新血管形成獲得營養物 質的能力來治療腫瘤或腫瘤轉移灶。因此，還提供減慢腫瘤生長和/或引起腫瘤消退的方 法。此外，由於本發明的組合物靶向細胞內轉錄物，因此本發明的組合物可以用於通過使用 特異性細胞靶向/內化部分來靶向受累組織，由此降低在其他非靶向組織中的副作用。I.顯性失活RTEF-I多肽許多RTEF-I變體在本文描述並表徵了其功能。例如，本文特別研究的四個序列包 含下列胺基酸序列。由1305bp RTEF-I人cDNA編碼的SEQ ID NO 1是具有下列序列的434個胺基酸 的蛋白質LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIILS DEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTRTRKQVSSHIQVLARRKAREIQAKLKDQAAKDKALQSMAAMSSAQIISATAFHS SMRLARGPGRPAVSGFWQGALPGQAETSHDVKPFSQQTYAQPPLPLPGFESPAGPAPSPSAPPAPPWQGRRRGSSKL WMLEFSAFLEQQQDPDTYNKHLFVHIGQSSPSYLRPYLEAVDIRQIYDKFPEKKGGLKDLFERGPSNAFFLVKFWAD LNTNIEDEGSSFYGVSSQYESPE匪IITCSTKVCSFGKQWEKVETEYARYENGHYSYRIHRSPLCEYMINFIHKLK HLPEKYMMNSVLENFTILQVVTNRDTQETLLCIAYVFEVSASEHGAQHHIYRLVKE由936bp人cDNA編碼的SEQ ID NO 2是具有下列序列的311個胺基酸的蛋白質LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIIL SDEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTRTRKQVSSHIQVLARRKAREIQAKLKYNKHLFVHIGQSSPSYLRPYLEAVDI RQIYDKFPEKKGGLKDLFERGPSNAFFLVKFWADLNTNIEDEGSSFYGVSSQYESPENMIITCSTKVCSFGKQVV EKVETEYARYENGHYSYRIHRSPLCEYMINFIHKLKHLPEKYMMNSVLENFTILQVVTNRDTQETLLCIAYVFEV SASEHGAQHHIYRLVKE
由651bp人cDNA編碼的SEQ ID NO 3是具有下列序列的216個胺基酸的蛋白質LEGTAGTTTSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIILS DEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTSSFYGVSSQYESPE匪IITCSTKVCSFGKQWEKVETEYARYENGHYSYRIHRS PLCEYMINFIHKLKHLPEKYMMNSVLENFTILQVVTNRDTQETLLCIAYVFEVSASEHGAQHHIYRLVKE由447bp人cDNA編碼的SEQ ID NO 4是具有下列序列的148個胺基酸的蛋白質LEGTAGTITSNEWSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDGEGVWSPDIEQSFQEALAIYPPCGRRKIIL SDEGKMYGRNELIARYIKLRTGKTRTRKQVSSHIQVLARRKAREIQAKLKFWQGALPGQAETSHDVKPFSQHHIYR LVKE如上所述，在本發明的某些方面中，顯性失活(DN)RTEF-I多肽可以包含一個或一 個以上內部胺基酸缺失。例如，在一些情況下，DN RTEF-I可以包含由外顯子3、4、5、6、7、8、 9或10編碼的胺基酸的缺失。例如，在某些方面中，DN-RTEFl包含SEQ ID NO 3胺基酸序 列或其衍生物。表1 由編碼外顯子編碼的RTEF-I胺基酸序列
外顯子編碼的胺基酸序列1N/A2LEGTAGTITSNEffSSPTSPEGSTASGGSQALDKPIDNDAEGVffSPDIE QSFQEALAIYPPCGRRKIILSDEGKMYG* (SEQ ID NO 5)3RNELIARYIKLRTGKTRTRKQ(SEQ ID NO 6)4VSSHIQVLARRKAREIQAKLK(SEQ ID NO 7)5DQAAKDKALQSMAAMSSAQIISATAFHSSMALARGPGRPAVSG (SEQ ID NO 8)6FWQGALPGQAGTSHD* (SEQ ID NO 9)7VKPFSQQTYAVQPPLPLPG* (SEQ ID NO 10)8FESPAGPAPSPSAPPAPPWQGRSVASSKL WMLEFSAFLEQQQDPDT (SEQ ID NO 11)9YNKHLFVHIGQSSPSYSDPYLEAVDIRQIYDKFPEKKGGLKDLFERGP SNAFFLVKFff(SEQ ID NO 12)
權利要求
包含具有一個或一個以上內部缺失的RTEF 1胺基酸序列的分離的RTEF 1顯性失活多肽，其中所述多肽降低VEGF啟動子活性，RTEF 1胺基酸序列包含由RTEF 1外顯子2、3、10、11和12編碼的胺基酸並且缺失由RTEF 1外顯子3、4、5、6、7、8、9和10編碼的胺基酸。
2.權利要求1的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中RTEF-I胺基酸序列包含至少16個 由外顯子3編碼的胺基酸。
3.權利要求1的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中RTEF-I胺基酸序列包含至少36個 由外顯子10編碼的胺基酸。
4.權利要求1的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中RTEF-I胺基酸序列與SEQID NO 3至少大約95%相同。
5.權利要求4的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中多肽具有SEQID NO 3中給出的 序列。
6.權利要求1的分離的RTEF-I顯性失活多肽，還包含分泌信號序列。
7.權利要求1的分離的RTEF-I顯性失活多肽，還包含細胞內化部分。
8.權利要求7的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中內化部分是肽、多肽、適體或者高親 合性多聚體。
9.權利要求8的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中內化部分包含來自HIVtat、HSV-I 間層蛋白VP22或果蠅屬觸角蛋白的內化序列。
10.權利要求8的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中內化部分包含聚精氨酸、聚甲硫氨 酸和/或聚甘氨酸肽。
11.權利要求7的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中內化部分包含胺基酸序列 RMRRMRRMRR(SEQ ID NO :23)。
12.權利要求7的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中內化部分是抗體。
13.權利要求12的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中抗體內化部分是IgA、IgM、IgE、 IgG、Fab、F(ab，)2、單鏈抗體或互補位肽。
14.權利要求1的分離的RTEF-I顯性失活多肽，還包含細胞分泌信號和細胞內化部分。
15.權利要求14的分離的RTEF-I顯性失活多肽，其中分泌信號序列包含人IL-2分泌 信號序列(SEQ ID NO 22)。
16.權利要求15的分離的RTEF-I顯性失活多肽，進一步限定為具有SEQIDNO :3、SEQ ID NO 22 和 SEQ ID NO 23 的序列。
17.分離的核酸序列，包含編碼權利要求1-16任意一項的RTEF-I顯性失活多肽的序列。
18.權利要求17的分離的核酸序列，進一步限定為核酸表達盒。
19.權利要求18的分離的核酸序列，進一步限定為病毒表達載體。
20.權利要求19的分離的核酸序列，其中病毒表達載體是腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病 毒、SV-40、反轉錄病毒或痘苗病毒載體。
21.權利要求20的分離的核酸序列，其中病毒表達載體是腺伴隨病毒。
22.權利要求20的分離的核酸序列，其中病毒表達載體是慢病毒表達載體。
23.權利要求22的分離的核酸序列，其中慢病毒表達載體是HIV載體。
24.權利要求23的分離的核酸序列，其中表達盒包含細胞類型特異性或可誘導啟動子。
25.權利要求24的分離的核酸序列，其中可誘導啟動子是低氧可誘導啟動子。
26.權利要求24的分離的核酸序列，其中可誘導啟動子是血管發生可誘導啟動子。
27.權利要求17的分離的核酸序列，還包含第二抗血管發生基因。
28.用於治療患有血管生成性病症患者的方法，包括向患者施用有效量的治療組合物， 所述治療組合物包含權利要求1-16任意一項的RTEF-I顯性失活多肽或者權利要求17-27 任意一項的編碼RTEF-I顯性失活多肽的核酸表達載體。
29.權利要求28的方法，其中血管生成性病症是眼新血管形成、動靜脈畸形、冠狀動脈 再狹窄、外周血管再狹窄、腎小球腎炎或風溼性關節炎。
30.權利要求29的方法，其中血管生成性病症是眼新血管形成。
31.權利要求28的方法，其中病症是黃斑變性、角膜移植排斥、角膜新血管形成、早產 兒視網膜病變(ROP)或糖尿病視網膜病變。
32.權利要求31的方法，其中病症是年齡相關的黃斑變性(AMD)。
33.權利要求28的方法，還包括施用第二抗血管生成治療。
34.權利要求33的方法，其中第二抗血管生成治療是結合VEGF、VEGF受體、FGF、FGF受 體、貝伐單抗、蘭尼單抗或哌加他尼鈉的抗體。
35.權利要求28的方法，其中血管生成性病症是癌症。
36.權利要求35的方法，其中癌症是轉移癌。
37.權利要求35的方法，其中癌症是膀胱癌、血液癌、骨癌、骨髓癌、腦癌、乳腺癌、結腸 癌、食道癌、眼睛癌、腸胃道癌、牙齦癌、頭癌、腎癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、頸癌、卵巢癌、前列 腺癌、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、舌癌或子宮癌。
38.權利要求37的方法，其中癌症是眼黑素瘤。
39.權利要求35的方法，還包括施用第二抗癌治療。
40.權利要求39的方法，其中第二抗癌治療是化學療法、手術療法、免疫療法或放射療法。
41.權利要求28的方法，其中患者是人。
42.權利要求28的方法，其中治療組合物包含權利要求1-17任意一項的RTEF-I顯性 失活多肽。
43.權利要求28的方法，其中治療組合物包含權利要求18-27任意一項的編碼RTEF-I 顯性失活多肽的核酸表達載體。
44.權利要求28的方法，治療組合物全身施用。
45.權利要求28的方法，其中治療組合物局部施用。
46.權利要求28的方法，其中治療組合物施用至眼睛。
47.權利要求46的方法，其中治療組合物局部地或者眼內注射施用至眼睛。
48.權利要求47的方法，其中治療組合物作為滴眼劑施用。
全文摘要
描述了轉錄增強因子1相關(RTEF-1)的顯性失活(DN)變體。DN RTEF-1多肽可以直接靶向至細胞或者在核酸表達載體中遞送，以改變細胞轉錄。描述了用於抑制VEGF產生並由此治療血管生成性病症，諸如癌症的方法。例如，在某些方面中，DN RTEF-1可用於治療眼睛的血管生成性病症，諸如年齡相關的黃斑變性(AMD)。
文檔編號C07K14/435GK101970472SQ200880100483
公開日2011年2月9日 申請日期2008年6月6日 優先權日2007年6月6日
發明者J·蒂莫西·斯託特, 本諾伊·阿普庫坦, 特雷弗·麥可法蘭德 申請人:研究發展基金會