用於多聚核苷酸檢測和定量的設備的製作方法

2023-08-12 23:19:26

專利名稱：用於多聚核苷酸檢測和定量的設備的製作方法
用於多聚核苷酸檢測和定量的設備
本申請是申請號為03817245.3之中國專利申請的分案申請，原申請03817245.3 是根據專利合作條約的國際申請(PCT/US03/19518)進入中國國家階段的國家申請。 發明領域
本發明涉及用於檢測和定量多聚核苷酸的自動化設備。
背景技術：
基因組的介入已經在加速藥物發現的步伐方面起作用。基因組技術已經在發現 新的藥物耙點方面證實了它們的價值。該領域的進一步改進將提供更有效的工具， 使更快、更節約成本地開發潛在的藥物。
藥物發現過程包括以下幾個步驟鑑定與疾病相關的潛在生化靶點，篩選活性 化合物，並進一步化學設計，臨床前測試，最後進行臨床試驗。該過程的效率仍離 完美相去甚遠花費在研究和開發過程基金中的金錢估計約75%都是走向失敗。另 外，產品開發中失敗發生地越晚，與該項目相關的損失也就越大。因此，有必要早 期消除將會發生的失敗，以大大節省整個藥物開發過程的成本。這樣，原始分子耙 點的質量就成為了節省成本的藥物開發的決定性因素。
能夠影響靶點鑑定和證實有效性的一個方法是繪製轉錄譜。該方法對特定條件 下的基因表達進行比較例如疾病細胞和正常細胞之間、對照細胞和藥物處理細胞 之間或治療響應細胞和治療耐受細胞之間的基因表達。該方法產生的信息可以直接 鑑別治療所靶向的特定基因，重要的是顯示疾病和治療中涉及的生化途徑。簡要地 說，繪製轉錄圖譜不僅提供生化靶點，還同時提供評估這些靶點質量的方法。另外， 和基於細胞的篩選聯用，繪製轉錄圖譜將大大改變藥物發現領域。使用表型變化作 為功能細胞系統的標記物來篩選潛在藥物歷來都是成功的。例如，監測培養物中腫 瘤細胞的生長來鑑定抗癌藥物。同樣，細菌的生存能力被用於針對鑑定抗生素化合 物的分析中。通常在不知道靶向生化途徑的前提下進行這種篩選。事實上，鑑定到 的有效化合物揭示出這種途徑，並指出真正的分子耙點，使隨後的下一代藥物的合 理設計能夠進行。
可以使用繪製轉錄圖譜的現代化工具來設計新的篩選方法，這些篩選方法將利 用基因表達代替表型變化來評價藥物的有效性。例如，這些方法描述在美國專利 No.5,262,311; 5,665,547; 5,599,672; 5,580,726; 6,045,988和5,994,076;以及Luehrsen et al. (1997)， Biotechniques， 22:168-74; Liang and Pardee (1998, Mol Biotechnol. 10:261-7)。對於諸如痴呆、輕度認知障礙、抑鬱等中樞神經系統(CNS)疾病領域 中的藥物發現來說，這類方法的價值是不可估量的，這些領域中表型篩選是不適用 的，但易於建立期望的轉錄譜，並將之與特定的疾病相聯繫。鑑定到的有效化合物 將揭示出潛在的分子過程。另外，該方法可有助於開發現有藥物的改進形式，這種 改進的藥物能同時作用於多個生化靶點，產生所需的藥理效果。在這種情況下，和 根據對多靶點結合的優化進行篩選相比，轉錄應答的變化對藥物作用是一種更好的 標記物。
在本發明之前，繪製轉錄譜最先進的方法是基於使用DNA微陣列的技術，舉 例來說，這些技術評論在Greenberg， 2001 Neurology 57:755-61; Wu， 2001， J Pathol. 195:53-65; Dhiman et al., 2001， Vaccine 20:22-30; Bier et al" 2001 Fresenius J Anal Chem. 371:151-6; Mills et al" 2001， Nat Cell Biol. 3:E175-8中；並描述在美國專利 No.5,593,839; 5,837,832; 5,856,101; 6,203,989; 6,271,957和6,287,778中。DNA微 陣列是通過評價標記多聚核苷酸樣品與結合在受試陣列表面上的DNA分子的雜交， 同時比較給定樣品中幾千種基因表達的方法，其中所述標記的多聚核苷酸樣品通過 mRNA的逆轉錄獲得。雖然現有技術提供有關轉錄變化的有價值的信息，但離完美 相去甚遠，還存在有一些問題和缺陷。
首先，該技術局限於存在於微陣列中的基因集合。目前的指紋技術能夠在單個 晶片上放置10，000-15,000個基因，該數目基本上是特定細胞類型中所表達的基因數 目。由於細胞類型的多樣性，需要建立對特定細胞類型的特定陣列。雖然理論上是 可能的，但該任務幾乎不可能實現，因為需要在製造微陣列之前了解表達在這些細 胞中的基因集合。
另外，組織樣品中轉錄物的數目要比細胞樣品中的大，並超出微陣列的容量。 並且，基因表達的一些變化緣自替換式剪切，這進一步增加了待分析的轉錄物數。 克服這些困難的唯一可能是開發能夠涵蓋整個基因組，包括替換式剪切基因的多個 陣列。這種方法將大大增加單次實驗的成本，並需要大量生物樣品，可能大於能夠 合理獲得的量。
其次，現有技術DNA微陣列不提供定量的準確數據，必須通過獨立的方法(例 如定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR))來證實所觀察到的基因表達變化。
最後，可能是特別令人感興趣的稀有轉錄物不能通過使用現有技術領域的檢測 技術的微陣列來檢測。
毛細管電泳已被用來定量檢測基因表達。Rajevic等人(2001， Pflugers Arch. 442(6 S叩pl 1):Rl卯-2)公開了使用7個引物對來同時檢測大量癌基因表達的差異， 從而檢測癌基因差異表達的方法。正義引物5，端標記有螢光染料。通過在ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer上進行毛細管電泳對多重螢光RT-PCR結果進行了分析。 Borson等人(1998， Biotechniques 25:130-7)描述了在聯合定量競爭性逆轉錄PCR (QC-RT-PCR)與毛細管電泳(CE)進行產物快速分離和檢測的基礎上，進行低豐 度mRNA轉錄物可靠定量的策略。George等人(1997, J Chromatogr B Biomed Sci Appl 695:93-102)描述了應用毛細管電泳系統(ABI310)鑑定螢光差異顯示生成的 EST模式。Odin等人(1999， J Chromatogr B Biomed Sci Appl 734:47-53)描述了一 種具有多色檢測能力的自動化毛細管凝膠電泳，用於PCR擴增的cDNA的分離和定 量。
用於PCR擴增和CE的獨立裝置是可以得到的。例如，PCR儀可購自Applied Biosystems (Foster City, CA)、 Bio-Rad (Hercules, CA)、 Eppendorf (Westbury, NY), Roche (Indianapolis, IN)。 CE裝置可購自Applied Biosystems (Foster City, CA)、 Beckman Coulter (Ful!erton， CA)和Spectrumedix Corporation (State College, PA)。
美國專利No. 6,126,804公開了使用一次性的小型裝置現場鑑定微生物和DNA 片段的設備，該設備在一個小的手持包裝±/中包含有集成的聚合酶鏈式反應(PCR) 酶反應孔、所附著的毛細管電泳(CE)通道、檢測器和讀取裝置。但是，該設備是
專門為現場使用而設計的。另外，現有技術中尚未有裝置能提供簡單、靈敏的設備 來定量檢測一個或多個樣品中的基因表達譜。
為了克服這些局限性，本技術領域中需要開發替代設備來繪製轉錄譜，其將
(1)不需要在分析前事先了解表達的基因集合的序列，而在分析過程中/後其本身將 提供該信息；(2)測定表達轉錄物水平的定量變化；(3)檢測稀有基因的表達；和
(4)是自動化的。在本技術領域中需要有一種簡單而靈敏的設備來定量檢測一個或 多個樣品中的基因表達譜。

發明內容
本發明提供了一種繪製表達譜的設備，其包括擴增反應混合物中的多聚核苷 酸以產生擴增產物的擴增裝置；通過第一連接裝置連接到擴增裝置的分析裝置，所 述的第一連接裝置能夠將反應混合物中的部分樣品從擴增裝置轉移到檢測和定量擴 增產物的分析裝置，其中所述的第一連接裝置是機器手(robotic arm)。
在一個實施方案中，所述設備還包括通過第二連接裝置連接到擴增裝置的多聚 核苷酸提取裝置，所述第二連接裝置能夠將提取的多聚核苷酸樣品從多聚核苷酸提 取裝置轉移到擴增裝置。
在另一個實施方案中，所述設備還包括級分收集器。
在一個優選的實施方案中，所述的級分收集器通過第四連接裝置與分析裝置相 連，能夠收集定量產物。
在另一個實施方案中，所述設備還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中 序列鑑定儀通過第五連接裝置和分析裝置相連，所述的第五連接裝置能夠將定量產 物從分析裝置轉移到序列鑑定儀。
在另一個實施方案中，所述的設備還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其 中序列鑑定儀通過第五連接裝置和級分收集器相連，所述的第五連接裝置能夠將收 集的產物從級分收集器轉移到序列鑑定儀。
本發明還提供了一種繪製表達譜的設備，其包括擴增反應混合物中的多聚核 苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；通過第一連接裝置連接到擴增裝置的分析裝置，
所述的第一連接裝置能夠將反應混合物中的部分樣品從擴增裝置轉移到檢測和定量
擴增產物的分析裝置；通過第二連接裝置連接到擴增裝置的多聚核苷酸提取裝置，
所述第二連接裝置能夠將提取的多聚核苷酸樣品從多聚核苷酸提取裝置轉移到擴增裝置。
在另一個實施方案中，所述設備還包括級分收集器。
在一個優選的實施方案中，所述的級分收集器通過第四連接裝置與分析裝置相 連，能夠收集定量產物。
在另一個實施方案中，所述設備還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中 序列鑑定儀通過第五連接裝置連接到分析裝置，所述的第五連接裝置能夠將定量產 物從分析裝置轉移到序列鑑定儀。
在另一個實施方案中，所述的設備還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其 中序列鑑定儀通過第五連接裝置連接到級分收集器，所述的第五連接裝置能夠將收 集的產物從級分收集器轉移到序列鑑定儀。
本發明還提供了一種繪製表達譜的設備，其包括擴增反應混合物中的多聚核 苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；通過第一連接裝置連接到擴增裝置的分析裝置， 所述的第一連接裝置能夠將反應混合物中的部分樣品從擴增裝置轉移到檢測和定量 擴增產物的分析裝置；通過第三連接裝置連接到分析裝置的數據生成裝置，所述的 第三連接裝置能夠將信號從分析裝置轉移到數據生成裝置。
在一個實施方案中，所述設備還包括通過第二連接裝置連接到擴增裝置的多聚 核苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置能夠將提取的多聚核苷酸樣品從多聚核苷酸 提取裝置轉移到擴增裝置。
在一個實施方案中，所述設備還包括級分收集器。
在一個優選的實施方案中，所述的級分收集器通過第四連接裝置連接到分析裝 置，能夠收集定量產物。
在另一個實施方案中，所述設備還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中 序列鑑定儀通過第五連接裝置連接到分析裝置，所述的第五連接裝置能夠將定量產 物從分析裝置轉移到序列鑑定儀。
在另一個實施方案中，所述的設備還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其 中序列鑑定儀通過第五連接裝置連接到級分收集器，所述的第五連接裝置能夠將收 集的產物從級分收集器轉移到序列鑑定儀。
本發明還提供了一種繪製表達譜的設備，其包括擴增反應混合物中的多聚核 苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；通過第一連接裝置連接到擴增裝置的分析裝置， 所述的第一連接裝置能夠將反應混合物中的部分樣品從擴增裝置轉移到檢測和定量 擴增產物的分析裝置；能夠收集定量產物的級分收集器。
在一個優選的實施方案中，所述的級分收集器通過第四連接裝置連接到分析裝 置，能夠收集定量產物。
在一個實施方案中，所述設備還包括通過第二連接裝置連接到擴增裝置的多聚 核苷酸提取裝置，所述第二連接裝置能夠將提取的多聚核苷酸樣品從多聚核苷酸提 取裝置轉移到擴增裝置。
在另一個實施方案中，所述的設備還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其 中序列鑑定儀通過第五連接裝置連接到級分收集器，所述的第五連接裝置能夠將收 集的產物從級分收集器轉移到序列鑑定儀。
本發明還提供了一種繪製表達譜的設備，其包括擴增反應混合物中的多聚核 苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；通過第一連接裝置連接到擴增裝置的分析裝置， 所述的第一連接裝置能夠將反應混合物中的部分樣品從擴增裝置轉移到檢測和定量 擴增產物的分析裝置；鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中序列鑑定儀通過第五 連接裝置連接到分析裝置，所述的第五連接裝置能夠將定量產物從分析裝置轉移到 序列鑑定儀。
在一個實施方案中，所述設備還包括通過第二連接裝置連接到擴增裝置的多聚 核苷酸提取裝置，所述第二連接裝置能夠將提取的多聚核苷酸樣品從多聚核苷酸提 取裝置轉移到擴增裝置。
在一個實施方案中，所述設備還包括級分收集器。
在一個優選的實施方案中，所述的級分收集器通過第四連接裝置連接到分析裝 置，能夠收集定量產物，其中所述的級分收集器還通過另一個第五連接裝置連接到
序列鑑定儀，所述的第五連接裝置能夠將收集的產物從級分收集器轉移到序列鑑定 儀。
在一個實施方案中，所述的擴增裝置和分析裝置還能夠進行多聚核苷酸的序列鑑定。
本發明還提供了一種繪製表達譜的設備，其包括擴增反應混合物中的多聚核 苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；檢測和定量擴增產物的毛細管電泳儀，其中所述 毛細管電泳儀的毛細管浸在反應混合物中，將反應混合物的部分樣品從擴增裝置轉 移到毛細管電泳儀。
在一個實施方案中，所述設備還包括通過第二連接裝置連接到擴增裝置的多聚 核苷酸提取裝置，所述第二連接裝置能夠將提取的多聚核苷酸樣品從多聚核苷酸提 取裝置轉移到擴增裝置。
在另一個實施方案中，所述設備還包括級分收集器。
在一個優選的實施方案中，所述的級分收集器通過第四連接裝置和毛細管電泳 儀相連，以收集定量產物。
在另一個實施方案中，所述設備還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中 序列鑑定儀通過第五連接裝置連接到毛細管電泳儀，所述的第五連接裝置能夠將定 量產物從毛細管電泳儀轉移到序列鑑定儀。
在另一個實施方案中，所述的設備還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其 中序列鑑定儀通過第五連接裝置連接到級分收集器，所述的第五連接裝置能夠將收 集的產物從級分收集器轉移到序列鑑定儀。
在另一個實施方案中，所述的擴增裝置和毛細管電泳儀能夠進行多聚核苷酸的 序列鑑定。
在本發明的設備中，所述的擴增裝置優選是聚合酶鏈式反應(PCR)擴增裝置。 還優選的是，在每個PCR循環結束時，第一連接裝置能夠將反應混合物的部
分樣品從擴增裝置轉移到分析裝置。
優選的是，反應混合物包含一個或多個PCR擴增引物，所述引物與反應管內
壁或微滴定板的孔內壁化學連接。 在本發明的設備中，所述的擴增裝置還優選能夠進行逆轉錄以產生cDNA。 優選的是，用於逆轉錄的一個或多個引物與反應管內壁或微滴定板孔的內壁化 學連接。
優選的是，所述設備能夠檢測和定量一種或多種螢光標記物所產生的信號。 在本發明的某些實施方案中，第一、第二、第四或第五連接裝置是機器手。 在本發明的其他實施方案中，第一、第二、第四或第五連接裝置是管或通道。 在本發明的某些實施方案中，第一、第二、第四和第五連接裝置為單一的連接
裝置，例如將樣品從一個裝置轉移到另一個裝置的機器手。
在一個實施方案中，在第一、第二、第四或第五連接裝置上施加電流，使之能
夠進行轉移。
在本發明的設備中，分析裝置優選為毛細管電泳儀。
優選的是，所述設備中的多聚核苷酸提取裝置能夠從一種或多種生物材料中分 離總RNA或mRNAo
本發明將在下列方面發現廣泛的用途，如生物學和生物醫藥研究；治療試劑和 診斷標記物的鑑定；經過遺傳修飾的細胞和生物有機體的分析；未知疾病的鑑定； DNA的分析和生物樣品的鑑定。這些應用的非限制性例子包括定量PCR、實時PCR、 DNA測序、繪製轉錄譜和基因型分析。


將參照附圖進一步解釋本發明，其中在多個附圖中相同的結構用相同的附圖標 記來表示。所示的附圖不按比例繪製，其重點通常是為了說明本發明的原理。
圖1是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64和分析裝置68組成，所述的分析裝置68通過第一連接裝置66和擴 增裝置64相連。
圖2是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由多聚核苷酸提取裝置20、擴增裝置64和分析裝置68組成。第一連接裝置66將擴 增裝置64和分析裝置68連接，而第二連接裝置40將多聚核苷酸提取裝置20和擴
增裝置64連接。
圖3是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64、分析裝置68和數據生成裝置120組成。第一連接裝置66將擴增裝 置64和分析裝置68連接，第二連接裝置40將多聚核苷酸提取裝置20和擴增裝置 64連接，第三連接裝置80將分析裝置68和數據生成裝置120連接。
圖4是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64和分析裝置68組成。擴增裝置64能夠在擴增反應之前進行多聚核苷 酸的逆轉錄。第一連接裝置66將擴增裝置64和分析裝置68連接。
圖5是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64和分析裝置68組成。分析裝置68能夠進行數據生成。第一連接裝置 66將擴增裝置64和分析裝置68連接。
圖6是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64和分析裝置68組成，它們都位於同一個機殼60中。機殼60中的第 一連接裝置66將擴增裝置64和分析裝置68連接。
圖7是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由多聚核苷酸提取裝置20、擴增裝置64、分析裝置68和數據生成裝置120組成。 第一連接裝置66將擴增裝置64和分析裝置68連接，第二連接裝置40將多聚核苷 酸提取裝置20和擴增裝置64連接，第三連接裝置80將分析裝置68和數據生成裝 置120連接。
圖8是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64、分析裝置68和級分收集器160組成。第一連接裝置66將擴增裝置 64和分析裝置68連接，第四連接裝置140將分析裝置68和級分收集器160連接。
圖9是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64、分析裝置68和序列鑑定儀200組成。第一連接裝置66將擴增裝置 64和分析裝置68連接，第五連接裝置180將擴增裝置64和序列鑑定儀200連接。
圖10是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64、分析裝置68、級分檢測器和序列鑑定儀200組成。第一連接裝置66
將擴增裝置64和分析裝置68連接，第四連接裝置140將分析裝置68和級分收集器 160連接，第五連接裝置180將級分收集器160和序列鑑定儀200連接。
圖11是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64和分析裝置68組成，其中分析裝置68還充當序列鑑定儀200。第一 連接裝置66將擴增裝置64和分析裝置68連接。
圖12是根據本發明的一個實施方案繪製表達譜的一種設備的示意圖。設備10 由擴增裝置64、分析裝置68、序列鑑定儀200和數據生成裝置120組成。第一連接 裝置66將擴增裝置64和分析裝置68連接，第五連接裝置180將擴增裝置64和序 列鑑定儀200連接，第三連接裝置80將序列鑑定儀200和數據生成裝置連接。
圖13是使用根據本發明的某些實施方案的設備繪製表達譜過程的示意圖。
雖然上述

了本發明的優選實施方案，如討論部分所提到的，本發明的 其他實施方案也可加以考慮。本文通過代表性方式而非限制性方式給出了本發明的 說明性實施方案。本領域的技術人員可以設計許多其他屬於本發明原理的範圍之內 的改動和實施方案。
具體實施例方式
本文使用了下列術語和定義
本文所用的"樣品"指從其天然環境中分離且包含多聚核苷酸的生物材料。根 據本發明的"樣品"可以由純的或分離的多聚核苷酸組成，或可以包含生物樣品， 如含有多聚核苷酸的組織樣品、生物流體樣品或細胞樣品。生物流體包括但不局限 於血液、血漿、唾液、尿液、腦脊液、灌洗液和白血球電泳法(leukophoresis)樣品。 本發明的樣品可以是包含多聚核苷酸的任何植物、動物、細菌或病毒材料，或源自 它們的任意材料。
本文所用的"製備的樣品"指為了分離或合成多聚核苷酸，即DNA (如基因組 DNA或cDNA)或RNA (如總RNA或mRNA)的目的來源於樣品的製備物。
本文所用的"部分樣品(aliquot)"指從製備的完整樣品或反應混合物中取出的 樣品體積。部分樣品的體積小於樣品或反應混合物的總體積，優選為lnl-5pl的體積。
在本發明的一個實施方案中，對於取出的各部分樣品來說，加入包含反應所必需試 劑(如緩衝液、鹽、核苷酸和聚合酶)的等體積反應緩衝液。
本文所用的"連接裝置"指連接兩個儀器、能夠將流體和/或信號從一個儀器轉 移到另一個儀器的裝置。
本文所用的"機器手"指將樣品、包含樣品的管或板從一個位置物理轉移到另 一個位置的裝置，優選由微處理器控制。每個位置可以是根據本發明有用的模塊設 備中的一個單元。根據本發明一個有用的機器手的例子是Mitsubishi RV-E2 Robotic Arm。控制機器手的軟體通常可從機器手廠商獲得。
本文所用的"反應室"指用於放置正在進行或將要進行反應(例如，擴增反應 或提取過程)的反應物的流體室。"反應室"可以包括任意的合適材料，即表現出最 小非特異性吸收的材料，或處理後表現出最小非特異性吸收的材料，例如包括但不 局限於玻璃、塑料、尼龍、陶瓷或其組合。"反應室"可以和至少一個連接裝置連接， 所述的連接裝置用於轉移材料激出反應室。
本文所用的"表達"指在細胞或無細胞系統中生成蛋白質或核苷酸序列，包括 從編碼所述產物的DNA轉錄成RNA產物，轉錄後修飾和/或翻譯成蛋白質產物或多 肽，以及可能的翻譯後修飾。
本文所用的"繪製表達譜"指檢測多個樣品間表達譜差異。
本文所用的"表達譜差異"指基因表達的量(即豐度)和質的差異。如果在一 個樣品中通過檢測多聚核苷酸的已知方法(例如，電泳)檢測到了某個基因的表達， 而在另一個樣品中未檢測到其表達，則存在有"表達譜差異"。或者，如果兩個樣品 間基因表達量的差異(即增加或降低)為約20%、約30%、約50%、約70%、約 卯％、約100% (約2倍)或更多，直至並包括約1.2倍、2.5倍、5倍、10倍、20 倍、50倍或更多，則存在有"表達譜差異"。兩個樣品間具有表達譜差異的基因是在 兩個樣品中差異表達的基因。
本文所用的"多個"指兩個或多個。根據本發明，多個可以是3個或更多，100 個或更多，或者1000個或更多，例如最多達對應於樣品中所有mRNA的cDNA的 數目。
本文所用的"擴增產物"指部分特定多聚核苷酸序列和/或其互補序列的多拷貝 多聚核苷酸，核苷酸序列對應於模板多聚核苷酸序列和其互補序列。根據本發明的 "擴增產物"可以是DNA或RNA，可以是雙鏈或單鏈。
本文所用的"合成"和"擴增"可以互換使用，指產生特定多聚核苷酸序列的 拷貝或增加特定多聚核苷酸序列的拷貝數或量的反應。可以不加限制地通過聚合酶 鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、特異多聚核苷酸基擴增(NSBA)的體 外方法或本領域所公知的其他方法進行。例如，多聚核苷酸擴增可以是使用聚合酶 和一對寡核苷酸引物生成含量大於起始存在量的任意特定多聚核苷酸序列的過程， 即生成靶多聚核苷酸序列或耙多聚核苷酸的過程。
本文所用的術語"級分收集"指用於收集來自緩慢流動源，如色譜柱或電泳儀 的液體樣品的裝置，其中液體的組成隨時間而變化。 一般來說，級分收集器包括能 夠支持多個分離收集管的支架面，和能夠選擇性將液體樣品導向各個收集管的分配 頭。通過這種方式，樣品的不連續液體級分被收集到各個管中進行後續的分析或使 用。在毛細管電泳中，可以通過將毛細管的末端和電極浸在含有液體的收集管中、 施加電流使多聚核苷酸洗脫到收集管中進行級分收集。
本文所用的術語"序列鑑定儀"指能夠鑑別多聚核苷酸的核苷酸序列的儀器， 即DNA測序儀器。
本文所用的"標記物"或"可檢測標記物"指能夠用來提供可檢測(優選可定 量)信號並可以可操作連接到多聚核苷酸的任意原子或分子。標記物可以提供能夠 通過螢光、放射性、比色、比重測定、X射線衍射或吸收、磁力、酶活性、質譜、結 合親和力、雜交射頻、納米晶體等檢測的信號。本發明的引物可被標記以使擴增反 應產物可通過"檢測"可檢測標記物而被"檢測"。"定性或定量"檢測指在標記物 所產生的信號量(強度)或數目的基礎上進行可視或自動化分析。
本文所用的"分離的"或"純化的"多聚核苷酸指已經從其正常細胞(例如， 染色體)環境取出或在非天然環境中合成(例如人工合成)的天然存在序列。因此， "分離的"或"純化的"序列可以在無細胞溶液中，或在不同的細胞環境中。術語 "純化的"並非意味著序列是僅存在核苷酸，而是指基本不含與之天然結合的非核苷酸或多聚核苷酸材料(約卯-95%純度，直到99-100%純度)，因而區分於分離的 染色體。
本文所用的"cDNA"指在RNA依賴的DNA聚合酶(例如，逆轉錄酶)作用 下從RNA模板生成的互補或拷貝多聚核苷酸。"cDNA克隆"指攜帶在克隆載體中， 與目的RNA分子互補的雙鏈DNA序列。
本文所用的"基因組DNA"指染色體DNA,與拷貝自RNA轉錄物的互補DNA 相對。本文所用的"基因組DNA"可以是單一細胞中存在的所有DNA,或者是單一 細胞中DNA的一部分。
本發明涉及繪製基因表達譜的自動化設備。該設備能夠提供對多個樣品以及一 個樣品的髙通量表達分析。因而單一自動化儀器包括在單一系統中傳統上由技術員 使用移液器、孵箱、多聚核苷酸擴增裝置、分析裝置(例如，凝膠電泳系統)和數 據獲得系統所完成的功能。本發明的設備能夠進行擴增產物的檢測、分析、定量和/ 或可視化。
除非指明，本發明的實施採用分子生物學、微生物學的傳統技術和重組DNA 技術，這些技術是本領域技術人員所公知的，在文獻中作有解釋。例如，參見 Sambrook， Fritsch & Maniatis, 1989， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed.， 1984); Polynucleotide Hybridization (B.D. Harnes & S.J. Higgins， eds.， 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal， 1984);和a series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc); Short Protocols In Molecular Biology, (Ausubel et al" ed.， 1995)。本發明 的實施還涉及美國專利No. 5,965,409; 5,665,547; 5,262,311; 5,599,672; 5,580,726; 6,045,998; 5，994，076; 5,962,211; 6,217,731; 6,001,230; 5,963,456; 5,246,577; 5,126,025; 5,364,521和4,985,129中所公開的技術和組合物。這裡上下文中所提到的所有專利、 專利申請和出版物都通過引用併入本文。
本發明的繪製基因表達譜的設備如圖1中10所示。設備10由擴增裝置64和分 析裝置68組成，所述的分析裝置68通過第一連接裝置66和擴增裝置64相連。從 感興趣樣品中提取的多聚核苷酸在擴增裝置64中擴增。然後通過第一連接裝置66
將擴增多聚核苷酸產物中的部分樣品轉移到分析裝置68中。分析裝置68進行擴增 產物的檢測和定量。
在一個實施方案中，所述設備能夠進行多聚核苷酸的聚合酶鏈式反應(PCR) 擴增，擴增產物通過電泳進行分析。優選釆用毛細管電泳分析擴增產物。
如圖2所示，本發明中繪製表達譜的設備還能夠製備用於擴增反應的DNA模 板。設備10包括多聚核苷酸提取裝置20、擴增裝置64和分析裝置68。第一連接裝 置66將擴增裝置64和分析裝置68連接，第二連接裝置40將多聚核苷酸提取裝置 20和擴增裝置64連接。生物樣品引入到多聚核苷酸提取裝置20中，多聚核苷酸從 生物材料提取。提取的多聚核苷酸通過第二連接裝置40轉移到擴增裝置64中，使 得多聚核苷酸在擴增裝置64中得以擴增。擴增多聚核苷酸產物的部分樣品通過第一 連接裝置66轉移到分析裝置68中。分析裝置68進行擴增產物的檢測和定量。
在優選的實施方案中，多聚核苷酸提取裝置從生物材料中提取RNA。在一個更 優選的實施方案中，在多聚核苷酸提取裝置20中進行mRNA從生物樣品的提取。
所述設備的分析裝置68能夠生成所需的表達譜繪製數據，基本如圖5所示。設 備10由擴增裝置64和分析裝置68組成，所述的分析裝置68通過第一連接裝置66 和擴增裝置64相連。從感興趣樣品提取的多聚核苷酸在擴增裝置64中得以擴增。 然後，擴增多聚核苷酸產物的部分樣品通過第一連接裝置66轉移到分析裝置68中。 分析裝置68進行擴增產物的檢測和定量，生成表達譜繪製數據。
作為替代實施方案，本發明中繪製表達譜的設備還可以包括分離的數據生成裝 置，如圖3所示。設備10由擴增裝置64、分析裝置68和數據生成裝置120組成， 第一連接裝置66將擴增裝置64和分析裝置68連接，第三連接裝置80將分析裝置 68和數據生成裝置120連接。
如圖4所示，繪製表達譜的設備的擴增裝置能夠通過逆轉錄生成cDNA。設備 10由擴增裝置64和分析裝置68組成。第一連接裝置66將擴增裝置64和分析裝置 68連接。將提取的RNA (例如，總RNA或mRNA)引入到擴增裝置64中，在擴 增裝置64中從RNA合成cDNA。然後，合成的cDNA在擴增裝置64中得以擴增。 擴增多聚核苷酸產物的部分樣品通過第一連接裝置66轉移到分析裝置68中。分析
裝置68進行擴增產物的檢測和定量。
多聚核苷酸提取裝置20
如圖2和圖7所示，根據本發明的多聚核苷酸提取裝置20能夠直接從生物樣品 (例如，細胞樣品或組織樣品)中提取多聚核苷酸(即DNA或RNA)。
優選的是，多聚核苷酸提取裝置20被設計以提供提取的多聚核苷酸，來用作擴 增裝置64中逆轉錄反應和/或PCR擴增反應的模板。在一個實施方案中，多聚核苷 酸提取裝置20提供製備的多聚核苷酸，其質量和體積對應於用來擴增多聚核苷酸的 現有或將有系統的要求。可通過商業途徑獲得的擴增系統包括但不局限於Applied Biosystems (Forster City, CA)的GeneAmp PCR System 9700; Hercules, CA的 iCycler Thermal Cycler; Eppendorf 的 Eppendorf Mastercycler Gradient; Cepheid(Sunnyvale, CA)的Smart Cycler TD System; Roche (Indianapolis, IN)的 LightCycler; AMPLICORTM自動化PCR系統(Roche, Indianapolis, IN)和這些儀器的 後繼產品。提取裝置可被設計來提供任意適當輸出體積的流體，其包含提取的多聚 核苷酸，例如約100 ml至約750 pi,優選500 ml至約500 pl，較優選約1 pi至約250 Hl，更優選約1 pi至約100 pl。
在一個實施方案中，多聚核苷酸提取裝置20能夠從生物材料中分離mRNA。 在另一個實施方案中，多聚核苷酸提取裝置20能夠從多個生物材料中分離mRNA。
提取多聚核苷酸的技術和試劑是本領域所公知的，例如，在Basic Methods in Molecular Biology, (1986， Davis et al" Elsevier, NY)和Current Protocols in Molecular Biology (1997， Ausubel et al.， John Weley & Sons, Inc.)中所描述的。
使用上述多聚核苷酸提取技術的各種多聚核苷酸提取設備都可以和本發明聯 用。例如，日本專利申請No. 125972/1991描述了一種多聚核苷酸提取設備，其設計 用來預防病毒感染和提高提取效率，包括多關節的工業機器人和DNA提取及純化所 必須的外周元件。日本專利申請No.131076/1992公開了一種提取設備，其通過轉移 多聚核苷酸提取容器至離心機的裝置的緊湊排列，以提高多聚核苷酸從小量血液或 其他生物材料中的提取效率。日本專利申請No.47278/1997公開了一種提取設備，其
採用帶有真空泵而非離心機的過濾系統。為了實現完全自動化的提取裝置，可將離 心機或真空泵和相關的硬體組建成儀器。
在一個實施方案中，多聚核苷酸提取裝置20是一種多聚核苷酸提取設備。本發 明的多聚核苷酸提取設備可以包括(1) 一組提取容器，每個提取容器包括一個反 應管，其中將生物材料、試劑溶液和磁力載體混合併反應、 一個用於收集非必需組 分溶液的放洩杯和一個多聚核苷酸回收管，都固定在支架上；(2)將溶液引入每個 提取容器的分配裝置；(3)混合反應管中溶液和磁力載體的攪拌裝置；(4)使容器 中磁力載體保持靜態的控制裝置；(5)從反應管中排出溶液而使磁力載體保持不動 的排出裝置；(6)加熱反應管中溶液和磁力載體的加熱裝置；和(7)連續轉移容器 到給定位置的轉移裝置。這種設備描述在美國專利No.6，281，008中，其整體內容通過 引用併入本文。
在另一個實施方案中，多聚核苷酸提取裝置20是一種自動化多聚核苷酸分離儀 器。該儀器包括可移動的盒(cassette)，其中所述盒包括可分離的樣品轉移/存儲帶 (strip)。所述的盒可以密封或開放，優選是密封的。優選的盒還具有可移動的輸入 轉移條(transfer bar),並裝在箱中。該儀器還包括具有頂側、外側、內側的中空體、 用於放置所述盒的至少一個狹槽和用於放置樣品容器的至少一個孔。另外，所述盒 包括將盒移出/入箱的裝置，以及活化輸入轉移樣品條的裝置。優選的儀器還包括和 這些裝置相通的、存儲或生成加壓空氣的空氣噴嘴，和密封所述盒的樣品輸入通道 的裝置。另外，該儀器還包括位於內部的閥驅動器，用於開啟或關閉所述盒中的閥， 和一個或多個泵驅動器，用於移動流體出/入所述盒中的流體室。該儀器還優選包括 磁鐵、電源、用戶界面和條碼讀取裝置。優選的是，該儀器還包括位於狹槽或孔中 的感應裝置，當所述盒或樣品容器已經插到其中時，其顯示狹槽或孔已被佔據的信 號。這種儀器公開在美國專利No.6，281，008中，其整體內容通過引用併入本文。
在另一個實施方案中，多聚核苷酸提取裝置20還包括存儲裝置。在另一個實施 方案中，多聚核苷酸提取裝置20還包括將帶與盒的其他部分分離的分離裝置。分離 裝置優選為一種刀，其具有與之相通的加熱裝置，其用途是將帶與盒的其他部分密 封。優選的裝置具有多個孔；更優選的是，所述裝置具有約24個孔，或48個孔，或96個孔，或386個孔。所述裝置優選包括具有下述部分的盒(1)位於輸入轉移 樣品條上的一個或多個樣品輸入埠，其分別連續地與該裝置中相同數目的孔相通， 其中所述埠還與盒的樣品輸入存儲庫相通；(2) —個或多個反應流道，其分別連 續地通過流體交換通道與相同數目的樣品輸入存儲庫相通；(3)與流體交換通道相 通的流體室，其中流體室是反應試劑的供應室、樣品池或反應室；(4)控制流體交 換通道中流體流動的閥；和(5)樣品轉移/存儲條，其具有至少一個與反應流道相通 的流體室。
多聚核苷酸提取裝置20用來從任意生物樣品中製備多聚核苷酸。用於本發明上 下文中的生物樣品可以是包含多聚核苷酸，即RNA或DNA的任意材料。這種樣品 可以是一個完整的生物有機體，如昆蟲；或多個生物有機體，如分析細菌或酵母時； 或者樣品可以是生物有機體的一部分，如組織、體液或分泌物。可以從中獲得多聚 核苷酸組分的適當組織包括但不局限於皮膚、骨、肝臟、腦、葉、根等；即可以是 活的或死亡的生物有機體的任意組織。所述的組織可以基本上不被原生物有機體的 其他組織汙染，或可以被汙染，或甚至被來自不同生物有機體的組織汙染。優選的 是，從中獲得特定生物樣品的生物有機體的來源在實施本發明方法之前是已知的； 但是，並不總是能夠獲得這種知識，如法醫樣品。
生物樣品還可以是臨床樣品或樣本。例如，由外源材料所致的疾病或病症可以 通過測試來自某種臨床樣本中樣品的多聚核苷酸中特定病原體的存在來驗證，例如 通過鑑定該病原體所具有的特徵性多聚核苷酸序列來驗證，所述的樣品如尿液、排 洩物、脊髓液、唾液、血液或血液組分、或任意其他的合適樣本。還可以測試個體 中某些先天性遺傳性疾病或病症的存在或傾向。這些遺傳性疾病包括但不局限於亨 丁頓舞蹈症、TaySach，s症等，檢驗分離自適當臨床樣品，如受試個體任意細胞材料 的多聚核苷酸中的這種遺傳疾病或傾向所特有的多聚核苷酸序列，但需要說明的是， 單獨使用和胚系幹細胞相比具有重排DNA或更少可測DNA的細胞，如紅細胞和抗 體形成細胞可能並不足以進行這種檢驗。
通過多聚核苷酸提取裝置提取,即分離的多聚核苷酸是任意合適的多聚核苷酸， 其中適用性取決於所需測試的類型。例如，測試個體中某種病原體的存在時，優選
測試識別性多聚核苷酸序列或取自臨床樣品的DNA組分中發現的序列，如果受試個 體感染了該病原體的話，病原體和宿主的已知生物學特徵將提示能夠發現病原體。 或者，對於測試特定基因是否在個體中表達時，可以尋找識別性多聚核苷酸序列或 取自組織的RNA組分中的序列來驗證這種表達,其中潛在的生物學/病理學特徵指示 表達應該被發現或不應該被發現，與待測病症或疾病相對應。根據表達受監控的基 因，還可以使用本領域中公知的方法提純RNA組分，使之主要包括多聚腺苷化的或 非多聚腺苷化的RNA物質。作為替代方案，或進一步的方案，還可以在本發明的範 圍內選擇RNA物質的大小類型。
生物樣品可以新鮮取自個體或從自然界分離，或者將這種樣品保存在適當的條 件下，例如在冰上。例如，可以使用標準方法從個體中採集血液樣品，例如用位於 個體靜脈內、與標準排出管相連的皮下針將血液從個體抽到管中。該血液可以直接 使用或保存在冰上。優選的是存在抗凝劑，如肝素、檸檬酸鹽或EDTA。對於長期保 存來說，優選將樣品冷凍、凍幹，或塗到適當的基質上並在其上乾燥，例如DNA的 保存。這種適當的基質包括任何吸收紙，如Whatman濾紙，或可釋放性地結合DNA 的處理膜材料。優選的膜包括在IsoCode.TM. Stix商品中(Schleicher & Schuell， Inc., Keene， N.H.)，除了能夠可逆地結合DNA,其還能夠可逆地結合血色素(某些多聚 核苷酸擴增方法的抑制劑)。根據本發明，基質結合的多聚核苷酸可以從基質中提取， 然後以與新鮮樣品相同的方式純化。
優選的是，多聚核苷酸提取裝置20能夠從一種或多種生物樣品中進行核酸提 取。在一個實施方案中，藉助包括能夠插入儀器狹槽中的可移取盒的裝置來實現這 一點。優選的是，該裝置包括適於同時、先後或以交錯方式運行四個的不同盒(例 如，每個盒對應一個樣品)的狹槽。
樣品製備裝置還可用作擴增反應混合物的容器，從而在每次將擴增產物轉移到 分析裝置之後，向反應混合物補充與部分樣品等量的擴增反應混合物。
擴增裝置64
如圖1所示，根據本發明的擴增裝置64可以是能夠擴增多聚核苷酸的任意儀器， 優選通過多聚核苷酸鏈式反應(PCR)擴增的儀器。通常，PCR反應通過熱循環儀
進行。有用的熱循環儀包括但不局限於Applied Biosystems (Forster City, CA)的 Gene Amp PCR System 9700; Bio-Rad (Hercules, CA)的iCycler Thermal Cycler; Eppendorf的Eppendorf Mastercyder Gradient; Cepheid (Sunnyvale, CA)的Smart Cycler TD System; Roch (Indianapolis, IN)的LightCycler; AMPLICORTM自動化 PCR系統(Roche, Indianapolis, IN)。根據本發明有用的PCR儀包括但不局限於在美 國專利No. 5,475,610; 5,602,756; 5,720,923; 5,779,977; 5,827,480; 6,033,880; 6,326,147; 6,1716,785中公開的儀器，其整體內容都通過引用併入本文。
聚合酶鏈式反應的目的是製備與初始供應的小量"模板"DNA相同的大量 DNA。該反應涉及複製DNA鏈，並在隨後的循環中使用這些拷貝產生其他的拷貝。 理想情況下,每個循環都使DNA的量加倍，從而導致存在於擴增反應混合物中的"靶" 或"模板"DNA鏈的拷貝數以幾何級數增加。
例如，典型的PCR溫度循環需要反應混合物被精確地控制在每個孵育溫度下 一定時間，相同或相似的循環重複多次。典型的PCR程序開始於將樣品在約94'C下 保持約30秒，以使反應混合物變性。然後，將反應混合物的溫度降至約30'C-約60 'C，保持l分鐘，使引物雜交。然後，反應混合物的溫度升高至約50'C-約72'C的溫 度，保持約2分鐘，以促進延伸產物的合成。這就完成一個循環。再次將反應混合 物的溫度升高至約94'C來對前面循環(變性)中形成的延伸產物進行鏈分離，從而 開始下一個PCR循環。通常，重複所述循環25-30次。本領域中可以理解的是，PCR 反應中PCR循環的溫度和循環數可以根據反應目的和模板特徵加以改變，例如tm。 基本的PCR方案和策略是本領域中所公知的，例如，描述在Basic Me也ods in Molecular Biology, (1986， Davis et al" Elsevier, NY)和Current Protocols in Molecular Biology (1997， Ausubel et al" John Weley & Sons, Inc.)中。
在一個實施方案中，反應混合物保存在用蓋封閉的一次性塑料管中。這種管的 典型樣品體積約為50-100微升。通常，所述儀器使用裝有樣品DNA和反應混合物 的許多管，其插入到金屬模具中稱作樣品孔的孔中。為了進行PCR過程，金屬模具 的溫度根據用戶在PCR方案文件中指定的預定溫度和時間加以控制。電腦和相關的 電子器件根據用戶在PCR方案文件中提供的限定了循環時間、循環溫度和循環次數
等的數據進行控制。金屬模具改變溫度時，各孔中的樣品也隨之發生相同的溫度改 變。
一般說來，希望形成金屬模具內各位置之間均一的溫度，因為模具金屬內存在 的溫度梯度會使在循環的特定時間上一些樣品具有和其他樣品相比不同的溫度。還 希望將從樣品模具向樣品熱傳遞的延遲減到最小，因為這種延遲對於所有樣品來說 並不相同。當設計本發明的PCR儀時應考慮這些因素。
在一個實施方案中，PCR儀的金屬模具足夠大，能夠容納以工業標準微滴定板 形式排列的96個樣品管。微滴定板是生物化學領域和生物技術領域中處理、加工和 分析大量小樣品時廣泛使用的裝置。有用的微滴定板可以包含24孔、48孔、96孔、 196孔或384孔。典型地，微滴定板是寬為35/8英寸、長5英寸、具有96個相同樣 品孔的板，以9毫米的間隔以8孔乘12孔的矩形排列。可以獲得具有各種材料、樣 品孔形狀和體積的微滴定板，優化用於許多不同的用途。優選的是，微滴定板以9 毫米的間隔具有全部外形尺寸和同樣8x12排列的孔。可以獲得能夠以這種標準微滴 定板格式自動處理、加工和分析樣品的各種儀器。本領域中微滴定板是可以通過商 業途徑獲得的，例如得自MWG biotech Inc. (High Point, NC)。可以通過本領域中 公知的方法製造微孔板，例如美國專利 0.5，602,756中描述的方法，其通過引用併入 本文。
優選的是，用於微滴定板的管是薄壁樣品管，以減小樣品模具的樣品溫度變化 和反應混合物的相應溫度變化之間的延遲。與所用的任何熱交換器相接觸的樣品管 部分的壁厚度應儘可能薄,只要能夠承受PCR循環的熱應力和正常使用的應力即可。 通常，樣品管由可以高壓滅菌的聚丙烯如HimontPD701製成，圓錐部分的壁厚度為 0.009-0.012英寸加減0.001英寸。
在另一個實施方案中，PCR儀加熱或冷卻樣品模具導致樣品與樣品之間的均一 性，和快速的熱循環速率、不受控的環境溫度改變，其他操作條件如電源電壓和冷 卻溫度的變化無關。如下文所述，可以使用加熱蓋來防止冷凝和樣品體積損失。
在另一個實施方案中，PCR儀防止樣品在接近其沸點的溫度下孵育時反應混合 物中溶劑的損失。加熱板覆蓋樣品管的頂部，並和提供氣密密封的每個樣品管的各
個蓋相接觸。來自熱板的熱量加熱每個樣品管的上部和蓋至高於冷凝點的溫度，使 任何樣品管中都不發生冷凝和回流。冷凝意味著較多的熱傳遞，因為當水蒸汽冷凝 時散發與蒸發熱等量的熱量。如果冷凝的發生不均一，則會導致樣品與樣品之間較 大的溫度變化。加熱板防止在樣品管中發生任何冷凝，從而可以將潛在的溫度誤差 來源降至最小。使用加熱板還減小了試劑用量。
在一個優選的實施方案中，本發明的擴增裝置64還能夠進行逆轉錄以合成 cDNA。逆轉錄反應指體外酶催化的反應，其中發生與RNA模板互補的DNA鏈的模 板依賴性聚合。逆轉錄通過將退火的寡核苷酸引物延伸至RNA模板進行，最通常使 用病毒逆轉錄酶如AMV (鳥白血病病毒)逆轉錄酶或MMLV (莫洛尼氏小鼠白血 病病毒)逆轉錄酶。逆轉錄條件和方法是本領域所公知的。逆轉錄示例性的條件如 下AMV逆轉錄酶——於37'C下，在包含50 mM Tris-HCI, pH8.3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.8 mM dNTP， 50單位逆轉錄酶和1-5嗎模板RNA
的緩衝液中反應；MMLV逆轉錄酶-^ 37'C下，在包含50 mM Tris-HCl， pH 8.3,
30 mM KC1， 8 mM MgCl2， 10 mM DTT， 0.8 mM dNTP, 50單位逆轉錄酶和1-5嗎 模板RNA的緩衝液中反應。
在另一個優選的實施方案中，逆轉錄使用96孔板進行，其中cDNA使用與微 孔板的孔內壁化學連接的一種或多種寡核苷酸引物加以合成。合成這種化學連接的 寡核苷酸的技術公開在 McGall et al.， International application No, PCT/US93/03767; Pease et al" (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.， 91: 5022-5026; Sou也ern and Maskos， International application PCT/GB89/01114; Maskos and Southern (同 上)；Southern et al., (1992) Genomics, 13:1008-1017;和Maskos and Southern, (1993) Polynucleotides Research, 21:4663-4669中，每個文獻的整體內容都通過引用併入本 文。
在某些實施方案中，使用與微滴定板的孔內壁化學連接的一種或多種寡核苷酸 進行逆轉錄。在其他的實施方案中，使用與微滴定板的孔內壁或反應管的內壁化學 連接的至少一個寡核苷酸引物進行擴增反應。結果是合成的cDNA或擴增的多聚核 苷酸產物與微滴定板的內壁結合，易於分離和純化。
寡核苷酸還可以在單一 (或幾個)固相支持物上合成，如在微滴定板的孔內壁 或反應管的內壁上合成，形成均勻包被有合成寡核苷酸的區域的陣列。合成這種陣 列的技術公開在McGall et al" International application No. PCT/US93/03767; Pease et al" (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.， 91: 5022-5026; Southern and Maskos， International application PCT/GB89/01114; Maskos and Southern (同上)；Southern et al.， (1992) Genomics, 13:1008-1017;和Maskos and Sou仇ern， (1993) Polynucleotides Research, 21:4663-4669中。
在一個實施方案中，擴增裝置生成標記的擴增產物。例如，可以使用標記的引 物生成擴增產物。根據本發明方法標記的多聚核苷酸(例如，寡核苷酸引物)被標 記在5，端、3，端、或兩端、或內部。標記物可以是"直接的"，例如染料，放射性標 記物。標記物還可以是"間接的"，例如抗體表位、生物素、地高辛、鹼性磷酸酶(AP)、 辣根過氧化物酶(HRP)。為了檢測"間接標記物"，必須加入其他組分，如標記的 抗體或酶底物，從而使捕獲的、釋放的、標記的多聚核苷酸片段可視化。在一個優 選的實施方案中，寡核苷酸引物用螢光標記物標記。適當的螢光標記物包括螢光染 料,如若丹明和衍生物(如Texas Red)、螢光素和衍生物(如5-溴甲基螢光素)、Lncifer Yellow、 IAEDANS、 7-Me;rN-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯、 7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、 monobromobhnane、三磺酸芘，如Cascade Blue 和 monobromorimethy- amminobimane ( 例如, 參見 DeLuca， 7m/MM o_/7"omsce ce ^4冊/戸's， in JwriAorfj; fl 7bo/， Marchalonis, et al" eds" John Wiley & Sons, Ltd., (1982),其通過引用併入本文)。
分析裝置68——^^細管電泳儀
毛細管電泳是分析本發明擴增產物的優選方法。如圖l所示，本發明提供了一 種設備，其包括擴增裝置64和分析裝置68，例如毛細管電泳儀。毛細管電泳儀是本 領域所公知的。根據本發明有用的毛細管電泳儀包括但不局限於Applied Biosystems (Foster City, CA)的ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer 、 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer、 ABI PRISM 377 DNA Sequencer、 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer; Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway， NJ)的MegaBACE 100 Capillary Array
Electrophoresis System; Beckman Coulter (Ful!erton， CA)的CEQTM 8000 Genetic Analytic System ; Caliper Technologies (Mountain View, CA)的 Agilent 2100 Bioanalyzer; Convergent Bioscience Ltd. (Toronto, Canada)的iCE280 System。有用 的毛細管電泳重複(r印eat)儀可以如美國專利No.6，217，731！ 6,001，230; 5，963,456; 5,246,577; 5,126,025; 5,364,521; 4,985,129; 5,202,010; 5,045,172; 5,560,711; 6,027,624; 5,228,969; 6,048,444; 5,616,228; 6,093,300; 6,120,667; 6,103,083; 6,132,582; 6,027,627; 5，938,卯8和5,916,428所述，其整體內容都通過引用併入本文。
在毛細管電泳中，包含背景電解液的兩個池通過含有相同溶液的毛細管相連通。 每個池都配有電極。待分析樣品作為一個短的區帶引入毛細管的一端。對於樣品的 引入來說，毛細管的一端通常轉移到一個池中，將所需量的樣品溶液注入毛細管， 然後將該毛細管末端轉移到背景溶液中。藉助池中的電極，對毛細管施加電場，通 常為200-1000 V/cm，使帶電的粒子在毛細管中遷移。如果粒子在電場中具有不同的 速度，則不同的粒子彼此分離。粒子區帶在不同的時間通過毛細管另一端的檢測器， 其信號得以測定。
在一個實施方案中，毛細管電泳儀提供多個毛細管、電紛毛細管陣列、多腔管、 管架、光學檢測區、毛細管束和高壓T裝置。毛細管的樣品端安置在電極/毛細管陣 列中，第二末端由高壓T裝置所接收。
優選的是，電紛毛細管陣列包括電極和毛細管的樣品端，其從毛細管電泳儀的 底部突出。電極和毛細管樣品端的排列應能夠浸入到96孔或384孔微滴定板的相應 樣品孔中。這需要96或384個毛細管，以充分利用微滴定板上的每個孔。
還優選的是，毛細管位於牢固安置在管架上的相應多腔管中。毛細管的暴露部 分並排排列，不受多腔管的保護，然後通過帶有照相機裝置的光學檢測區。照相機 裝置捕獲在暴露的毛細管中遷移的樣品圖像。然後將毛細管暴露的第二末端捆在一 起，安裝到高壓T裝置上。
在一個實施方案中，擴增裝置64和分析裝置68位於相同的機殼60中，如圖6 所示。機殼60中的第一連接裝置66將擴增裝置64和分析裝置68連接。
數據生成裝置120
如圖5所示，本發明的分析裝置68可以進行數據生成。作為替代方案，數據由 圖3所示單獨的數據生成裝置120生成。
數據生成可以通過本領域中公知的方法實現，如美國專利No. 6,217,731; 6,001,230; 5,963,456; 5,246,577; 5,126; 025; 5,364,521; 4,985,129; 5,202,010; 5,045,172; 5,560,711; 6,027,624; 5,228,969; 6,048,444; 5,616,228; 6,093,300; 6,120,667; 6,103,083; 6,132,582; 6,027,627; 5,938，卯8; 5，卯0934; 6，184，9卯和5,916,428中所述，其整體 內容都通過引用併入本文。
在一個實施方案中，所述的數據生成裝置包括信號檢測儀、監視器和連接控制 電路與監視器的計算機處理器。計算機處理器包括配置來與控制電路通信的輸入/輸 出(I/O)界面，和儲存在監視器上顯示圖形用戶界面的顯示程序的第一計算機存儲器。
優選的是，數據生成裝置能夠檢測和定量螢光團所產生的螢光信號。所述的熒 光團包括但不局限於若丹明和衍生物(如Texas Red)、螢光素和衍生物(如5-溴甲 基螢光素)、Lucifer Yellow、 IAEDANS、 7-Me;jN-香豆素-4-乙酸酯、7-OH-4-CH3-香 豆素-3-乙酸酯、7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、 monobromobimane、三 擴酸花，如Cascade Blue和monobromorimethy-ainminobiinane。
在一個實施方案中，所述的裝置安裝有凹面反射鏡，其位於毛細管流動池的一
側，作為第一高數值孔徑(N.A.)收集器；透鏡收集器，其位於流動池的相對側，作 為第二高N.A.收集器；和光學纖維，其緊靠流動池，用於發送激發光，使流動池中 所含的樣品發出發射光。反射鏡具有能反射發射光的凹面，收集器具有接收發射光 的近凸面和校準發射光的遠凸面。這種排列能夠獲得跨越流動池兩側的較大立體收 集角，因此收集效率增加。可以使用兩個或多個光學纖維從不同的光源發送發射光。 光學纖維與反射鏡、收集器的光軸呈平面正交排列，以減小發散的背景光的影響， 從而提高信噪比。校準的發射光可以通過例如光倍增管檢測器檢測。
級分收集器160
在本發明中，所述的設備可以包括與分析裝置相連的級分收集器，以從分析裝 置收集任何所需的多聚核苷酸樣品。如圖8所示，級分收集器160可以通過第四連 接裝置140和分析裝置68相連。另外，如圖10所示，級分收集器160還可以通過 第五連接裝置180和序列鑑定儀200相連。
傳統上，將級分收集器大致分為兩類。在第一類中，收集管以一般的矩形陣列 排列，操作分配頭以選擇性地流入各個收集管。在第二類中，收集管以螺旋模式排 列，安裝在通常為環形的轉盤上。當分配頭放射狀移動時，轉盤轉動，以沿螺旋模 式跟蹤各收集管。本發明中可以使用任何級分收集器。這種級分收集器的例子包括 但不局限於美國專利No. 4,862,932; 3,004,567; 3,945,412; 4,495,975; 4,171,715中 公開的級分收集器，每個專利的整體內容通過引用併入本文。
已經開發了級分收集器來滿足高通量分析系統的需要，這些收集器也可以整合 到本發明的設備中。例如，美國專利No. 6,309,541 (其整體內容通過弓l用併入本文) 公開了自動的級分收集裝置，其將微滴定板維持在固定的位置上，將樣品部分分配 到微孔板中的選定孔中。級分收集裝置包括一個分配針，樣品部分可以通過該分配 針分配到一次性的膨脹室中，然後分配入微滴定板中。分配針安裝在適於延伸至一 次性膨脹室的分配頭上，樣品部分可以冷凝至膨脹室中，然後分配到微滴定板。
本發明中有用的另一種類型級分收集器是藉助電泳的級分收集器，例如，它們 描述在美國專利No. 5,541,420; 5,635,045; 5,439,573; 4,964,961; 4,608,147; 4,049,534; 4,040940; 3,989,612 (每個專利的整體內容通過引用併入本文)中。在一個實施方案 中，根據本發明的級分收集器具有以指定間隔分布的一個或多個電泳泳道，以通過 電泳分離樣品，然後將分離的組分從電泳泳道中洗脫。使一個或多個轉移毛細管樣 品的管的末端以指定的間隔靠近電泳泳道的末端，轉移洗脫自每個電泳泳道的分離 組分。任選的是，使用連接裝置向間隙處提供緩衝液，通過緩衝液的鞘流動 (sheathflow)將分離的組分攜帶至樣品轉移管。
其他有用的級分收集器包括但不局限於美國專利申請No. 6,106,710; 6,004,443; 5,205,154和6,355,164，每個專利的整體內容通過引用併入本文。
序列鑑定儀200
本發明的設備還可以包括序列鑑定儀，以提供所需多聚核苷酸的序列，例如通 過分析裝置鑑定的目的多聚核苷酸的序列。如圖10所示，序列鑑定儀200可以和級 分收集器160相連，以鑑定所收集的每個級分中的多聚核苷酸序列。在如圖9和圖 12所示的另一個實施方案中，序列鑑定儀200通過第五連接裝置180和分析裝置相 連。在如圖ll所示的另一個實施方案中，分析裝置68本身可以充當序列鑑定儀。優 選的是，包含目的多聚核苷酸的樣品加載到分析裝置上進行其序列分析。DNA測序 通常通過Sanger等人(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:5463， 1977)的方法進行，涉及 從單鏈DNA模板與引物以酶法合成單鏈DNA。單鏈DNA模板和與模板相雜交的引 物一起提供。使用DNA聚合酶將引物延伸，通過摻入適當的鏈終止試劑，例如雙脫 氧核苷酸，每個反應都終止於特定的鹼基(鳥嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T或胞 嘧啶C)。然後根據在多聚核苷酸的每個位置上摻入的鏈終止劑，確定多聚核苷酸的 核苷酸序列。但是，還建立了其他的DNA測序儀和方法，也可用作本發明的序列鑑 定儀。
在優選的實施方案中，所述設備中不存在單獨的序列鑑定儀。擴增裝置和分析 裝置(如毛細管電泳儀)行使序列鑑定的功能。可以向擴增反應中加入測序試劑混 合物以進行測序反應，將部分測序反應物轉移到分析裝置(例如，毛細管電泳儀) 中進行序列鑑定。用於測序反應和序列鑑定的方法和試劑是本領域所公知的，例如 參見Short Protocols In Molecular Biology, (Ausubel et al., 1995,同上)。
本發明中有用的序列鑑定儀可以包括但不局限於美國專利No.6，270，961; 6,025,136; 5,955,030; 5,846,727; 5,821,058; 5,608,063; 5,643,798; 5，556，7卯；5,453,247; 5,332,666; 5,306,618; 5,288,644; 5,242,796; 5,221,518和5,122,345中公開的序列鑑 定儀，每個專利的整體內容通過引用併入本文。
鑑定到的目的多聚核苷酸的序列可以和各種資料庫，如Geiibank中的已有序列 相比較。
連接裝置40、 66、 80、 140或180 本發明的連接裝置40、 66、 80、 140或180能夠使兩個儀器之間的流體和/或信
號相通，如圖1-12所示。優選的是，本發明的連接裝置可以水平移動和垂直移動以 轉移流體。連接裝置可以是管或通道，或機器手。連接裝置可以包含兩個或多個管。 所述的兩個或多個管可以結合在一起。連接裝置所結合的區室，如擴增裝置的反應 室可以是封閉的(除了連接裝置存在時)，或者具有一個或多個開放側，同時使可用 體積和本發明的目標和目的相一致。例如，可以使用能夠施加選定電壓水平，包括 接地電壓的電壓控制器將樣品通過連接裝置電動轉移。可以使用多個分壓器和多個 繼電器來行使電壓控制器的功能，以獲得選定的電壓水平。使用電動轉運是樣品操 作的可行方法，作為泵機制發揮作用。本發明還需要使用電滲流、以受控且可重複 的方式混合各種流體。當合適的流體置於由相應合適的材料製成的管中時，管表面 的官能團可以離子化。電滲作用可以用作程序控制的泵機制。
例如，還可以使用蠕動泵來實現泵作用，其機制是一個輥向下推動流體室的可 變形膜以減小室體積，擠壓流體室的可變形膜以減小其體積的活塞和其他泵作用模 式是本領域所公知的。這些機制包括微機電裝置，如Shoji et al.， "Fabrication of a Pump for Integrated Chemical Analyzing Systems," Electronic and Communications in Japan, Part 2， 70， 52-59 (1989)或Esashi et al., "Normally closed microvalve and pump fabricated on a silicon Wafer," Sensors and Actuators, 20， 163-169 (1989沖所 報導的微機電裝置。
用於本發明的連接裝置40、 66、 140或180可以是機器手。機器手有形地將樣 品、包含樣品的管或板從一個位置轉移到另一個位置。易於作為常規程序實施自動 化的取樣過程，並避免人為取樣誤差(即，樣品大小的誤差和跟蹤樣品特性的誤差) 和人為取樣汙染的可能性。能夠從熱循環儀中取出部分樣品的機器手是本領域中可 以得到的。例如，Mitsubishi RV-E2 Robotic Arm可以和SciCloneTM Liquid Handler 或Robbins Scientific Hydra 96 pippttor聯用。優選的是，本發明的機器手可以包括 機動化平臺，其能夠水平移動和垂直移動以轉移樣品。
在一個實施方案中，第一連接裝置66將擴增裝置64和分析裝置68相連，使流 體可以轉運並進行特定的分析。在一個優選的實施方案中，第一連接裝置66能夠自 動將流體樣品加到分析裝置68的加樣孔中。置於加樣孔中的樣品體積或樣品"塞
(phlg)"下降到分析通道中，在此處進行所需的分析。在一個優選的實施方案中，分 析裝置68是毛細管電泳裝置。因此，對於這種操作來說，主通道或分析通道通常包 括篩分基質、置於其中的緩衝液或介質，以優化樣品中組份的電泳分離。但是，通 過閱讀本申請可以理解，所述的分析裝置68還可以是各種非CE儀，可用於對樣品 進行許多不同分析反應中的任意反應。
優選的是，用來轉移樣品的連接裝置66能夠在擴增過程中從擴增反應物中取出 部分樣品。連接裝置66可以包括移液tip頭或針，其在一次取樣後就除掉，或在每 次取樣後引入一個或多個洗滌針或tip頭的步驟。作為替代方案，連接裝置可以將用 於毛細管電泳的毛細管直接和擴增反應物接觸，以將部分樣品加到毛細管中。
在一個實施方案中，在每個PCR循環結束時，第一連接裝置66將PCR擴增 反應混合物的部分樣品從擴增裝置轉移到分析裝置。
在另一個實施方案中，第二連接裝置40將多聚核苷酸提取裝置和擴增裝置相 連。在另一個實施方案中，第二連接裝置還可以用於將包含dNTP、引物、必要試劑 和DNA聚合酶的混合物補充至擴增反應混合物，其濃度與起始反應混合物相同。在 另一個實施方案中，使用不同的連接裝置補充擴增反應混合物。這種連接裝置可以 以本申請中所述的相同方式製造，以轉移流體。
優選的是，本發明的第一連接裝置能夠將擴增反應混合物的部分樣品加到分析 裝置上，如加到毛細管電泳儀上。這種加樣功能可以通過本領域中公知的方法實現， 例如美國專利No. 6,280,589; 6,192,768; 6，1卯，521; 6,132,582和6,033,546中所公開 的方法，其整體內容都通過引用併入本文。
在一個實施方案中，樣品作為樣品塞注入連接裝置中，連接裝置包括至少一個 電解緩衝液通道和樣品供應和排放通道。供應和排放通道在分析裝置68的各個供應 口和排放口處進入電解液通道。供應口和排放口之間的距離在幾何學上限定樣品體 積。樣品塞向電解液通道的注入通過跨供應和排放通道施加電場一段時間而電動完 成，其中所述的時間至少應使具有最小電泳遷移率的樣品組分包含在幾何學上限定 的體積中。每個供應和排放通道都傾向電解液通道。提供了將樣品電動注入樣品體 積的裝置。供應源和排放通道對電解緩衝液的流動阻力至少比電解液通道的流動阻
力低約5%。
在另一個實施方案中，使用本領域中公知的水力方法將樣品引入第一連接裝置。 樣品通過壓力差注入到毛細管中。壓力差通過將毛細管末端置於不同的水平上而產 生，由此產生水力壓力差，或者藉助氣體在可密封的樣品池中產生超壓力，超壓力 將樣品溶液注射入毛細管中。通過選擇壓力差和其有效時間來控制通過毛細管的樣
品量°
在另一個實施方案中，通過將樣品注射毛細管放置在毛細管區帶電泳設備中毛 細管的入口端附近，藉助固定的或可移動的樣品注射毛細管來注射樣品，其方式應 使樣品溶液完全包圍入口端。藉助電泳電流或以其他的方式將樣品轉移到分離毛細 管中，預定的時間後，將溶液從入口端附近取出，其中樣品溶液換為背景溶液。
但是，在一個不同的實施方案中，不使用第一連接裝置將擴增裝置和毛細管電
泳分析裝置連接。相反，通過將電泳儀的毛細管和電極直接浸在PCR反應物中，將 擴增多聚核苷酸樣品的一部分加到電泳儀上。優選的是，可以在電極上施加一定的 電流一段時間，迫使多聚核苷酸樣品在上述電動力的作用下進入毛細管。施加電流 的時間，例如，約0.001秒、0.01秒、0.1秒、1秒或10秒或更長，取決於毛細管需 要取來用於毛細管電泳分析的樣品體積。該實施方案提供了將樣品加到分析裝置上 的更簡單方法。
第三連接裝置80將分析裝置68和位於分析裝置外部的數據生成裝置120連接。 第四連接裝置140用在一個實施方案中，將分析裝置68和級分收集器160連接。
但是，在本發明的另一個實施方案中，在分析裝置和級分收集器之間不使用連接裝置。
第五連接裝置180用在某些實施方案中，將序列鑑定儀200和分析裝置68或級 分收集器160連接，從而可以獲得目的多聚核苷酸的序列鑑定。
在某些實施方案中，第一、第二、第四和第五連接裝置可以是單一的連接裝置， 例如，將流體從一個儀器轉移到另一個儀器的機器手。單一的機器手將流體從一個 儀器轉移到第二個儀器，自我洗滌和清洗，然後將流體從一個儀器轉移到第三個儀 器。
可用於製造本發明連接裝置的適當基材可以由各種材料的任意一種或材料的組 合製成。通常，連接裝置使用本領域中公知的固體基材製成，例如二氧化矽基基材, 如玻璃、石英、矽或多晶矽，以及其他公知的基材，即砷化鎵。作為替代方案，聚 合物基材可以用於製造本發明的連接裝置，包括聚二甲基矽氧烷(PDMS)、聚甲基 丙烯酸甲酯(PMMA)、聚氨酯、聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯、聚碸、聚碳酸酯、 聚甲基戊烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏二氟乙烯、ABS (丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物) 和類似材料。
本發明提供用於繪製轉錄譜的自動化設備。所述設備能夠擴增目標多聚核苷酸， 對目標多聚核苷酸的擴增產物進行定量分析。所述設備還能夠進行多聚核苷酸提取 和逆轉錄。所述設備還能夠鑑定目的多聚核苷酸(例如，在兩個或多個樣品中差異 表達的基因)，並對目的多聚核苷酸進行序列鑑定。
圖13所示為使用本發明的設備繪製表達譜過程的示意圖。例如，該過程可以使 用圖IO所示的設備進行。在一個優選的實施方案中，圖10中所有的儀器都位於一 個機殼中。可以分別提取RNA，或通過如圖2所示與擴增裝置相連的多聚核苷酸提 取裝置進行提取(步驟1)。擴增裝置64能夠進行cDNA合成和擴增(例如，通過 PCR，步驟2)。在每個PCR循環結束時，取出擴增產物的部分樣品，在分析裝置 68上進行分析(例如，毛細管電泳儀，步驟3)。差異表達的多聚核苷酸可以通過級 分收集器160收集(步驟4), 一個或多個差異表達的多聚核苷酸的序列可以通過序 列鑑定儀200鑑定(步驟5)。對於步驟5來說，可以加入測序試劑總混合物，測序 反應混合物可以根據本領域中的公知方法進行孵育。在一個實施方案中，隨後將測 序反應混合物加到分析裝置68 (例如，毛細管電泳儀)上進行序列鑑定。在另一個 實施方案中，級分收集器60所收集的部分級分可以返回到擴增裝置64上進行隨後 的反應。然後將反應產物加到分析裝置68上進行序列鑑定。
在一個實施方案中，本發明的設備用於分析基因組DNA樣品(例如，對基因 的基因組拷貝數進行定量)。這種技術和基於探針的分析或在整個基因組基礎上的染 色體組型分析相比具有更低的成本和更髙的解析度。基因組DNA分析的過程可以與 RNA分析的過程(如上所述)類似，只是使用基因組DNA時不需要進行逆轉錄和
cDNA合成。基因組DNA分析的過程可以自2個或多個待比較的樣品中分離基因組 DNA開始。樣品可以分成多份(如5、 10、 20或30或更多份)。每一份可以用不同 的引物組(例如，對於所有待分析樣品份來說，共5、 10、 20或30或更多個引物組) 擴增。對於每個引物組來說， 一個引物可以與共有重複序列互補，或只是隨機序列， 其具有樣品特異性序列標籤，從而具有樣品特異性。其他引物可以是隨機引物。在 一個實施方案中，兩個或多個樣品在相同的條件下使用相同的引物擴增，隨之形成 PCR產物梯帶，其來自於隨機散布在整個基因組中的基因座位點。然後測定每個PCR 產物的量，在樣品之間進行比較。這樣就可以鑑定到基因組範圍的不同基因座位點 處拷貝數的差異。這些差異指示為局部複製或擴增；三染色體性；和喪失雜合性。
作為替代方案，基因座特異性引物組(即，在耙基因座處識別特異序列的引物) 可用於PCR擴增，確定兩個或多個樣品之間特定基因座位點處的拷貝數變化。
上述實施方案說明了在製造和實施本發明中本發明人所進行的實驗和使用的技 術。應該認為這些實施方案包括報告實施本發明的技術並說明其有用性的技術內容。 本領域的技術人員將理解本文所公開的技術和實施方案僅是優選的實施方案，一 般來說可以採用多種等價的方法和技術來獲得相同的結果。
本文上面所述所有參考文獻的整體內容都通過弓I用併入本文。
權利要求
1.一種繪製表達圖譜的設備，包括擴增反應混合物中的多聚核苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；和通過第一連接裝置與所述擴增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應混合物的部分樣品從所述的擴增裝置轉移到檢測和定量所述擴增產物的所述分析裝置；其中所述的第一連接裝置是機器手。
2. 權利要求1的設備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴增裝置相連的多聚核苷 酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸提 取裝置轉移到所述的擴增裝置。
3. 權利要求l的設備，其還包括級分收集器。
4. 權利要求3的設備，其中所述的級分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝置 相連，以收集定量產物。
5. 權利要求l的設備，其還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序列 鑑定儀通過第五連接裝置和所述的分析裝置相連，所述的第五連接裝置將定量產物 從所述的分析裝置轉移到所述的序列鑑定儀。
6. 權利要求3的設備，其還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序列 鑑定儀通過第五連接裝置和所述的級分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集的 產物從所述的級分收集器轉移到所述的序列鑑定儀。
7. —種繪製表達圖譜的設備，包括 擴增反應混合物中的多聚核苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；通過第一連接裝置與所述擴增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應 混合物的部分樣品從所述的擴增裝置轉移到檢測和定量所述擴增產物的所述分析裝 置；和通過第二連接裝置和所述擴增裝置相連的多聚核苷酸提取裝置，所述的第二連接 裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸提取裝置轉移到所述的擴增裝 置。
8. 權利要求7的設備，其還包括級分收集器。
9. 權利要求8的設備，其中所述的級分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝置 相連，以收集定量產物。
10. 權利要求7的設備，其還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序 列鑑定儀通過第五連接裝置和所述的分析裝置相連，所述的第五連接裝置將定量產 物從所述的毛細管電泳儀轉移到所述的序列鑑定儀。
11. 權利要求8的設備，其還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序列 鑑定儀通過第五連接裝置和所述的級分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集的 產物從所述的級分收集器轉移到所述的序列鑑定儀。
12. —種繪製表達圖譜的設備，包括 擴增反應混合物中的多聚核苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；通過第一連接裝置與所述擴增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應 混合物的部分樣品從所述的擴增裝置轉移到檢測和定量所述擴增產物的所述分析裝 置；和通過第三連接裝置和所述分析裝置相連的數據生成裝置，所述的第三連接裝置將 信號從所述分析裝置轉移到所述的數據生成裝置。
13. 權利要求12的設備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴增裝置相連的多聚核 苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸 提取裝置轉移到所述的擴增裝置。
14. 權利要求12的設備，其還包括級分收集器。
15. 權利要求14的設備，其中所述的級分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝 置相連，以收集定量產物。
16. 權利要求12的設備，其還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序 列鑑定儀通過第五連接裝置和所述的分析裝置相連，所述的第五連接裝置將定量產 物從所述的分析裝置轉移到所述的序列鑑定儀。
17. 權利要求12的設備，其還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序 列鑑定儀通過第五連接裝置和所述的級分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集 的產物從所述的級分收集器轉移到所述的序列鑑定儀。
18. —種繪製表達圖譜的設備，包括 擴增反應混合物中的多聚核苷酸以產生擴增產物的擴增裝置； 通過第一連接裝置與所述擴增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應 混合物的部分樣品從所述的擴增裝置轉移到檢測和定量所述擴增產物的所述分析裝 置；和收集定量產物的級分收集器。
19. 權利要求18的設備，其中所述的級分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝 置相連，以收集定量產物。
20. 權利要求18的設備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴增裝置相連的多聚核 苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸 提取裝置轉移到所述的擴增裝置。
21. 權利要求18的設備，其還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序 列鑑定儀通過第五連接裝置和所述的級分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集 的產物從所述的級分收集器轉移到所述的序列鑑定儀。
22. —種繪製表達圖譜的設備，包括 擴增反應混合物中的多聚核苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；通過第一連接裝置與所述擴增裝置相連的分析裝置，所述的第一連接裝置將反應 混合物的部分樣品從所述的擴增裝置轉移到檢測和定量所述擴增產物的所述分析裝 置；和鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序列鑑定儀通過第五連接裝置和所 述的分析裝置相連，所述的第五連接裝置將定量產物從所述的分析裝置轉移到所述 的序列鑑定儀。
23. 權利要求22的設備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴增裝置相連的多聚核 苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸 提取裝置轉移到所述的擴增裝置。
24. 權利要求22的設備，其還包括級分收集器。
25. 權利要求24的設備，其中所述的級分收集器通過第四連接裝置和所述的分析裝 置相連，以收集定量產物，其中所述的級分收集器還通過另一個第五連接裝置和所 述的序列鑑定儀相連，所述的第五連接裝置將收集的產物從所述的級分收集器轉移 到所述的序列鑑定儀。
26. 權利要求1、 7、 12、 18和22中任意一項的設備，其中所述的擴增裝置和所述 的分析裝置還能夠進行多聚核苷酸的序列鑑定。
27. —種繪製表達圖譜的設備，包括 擴增反應混合物中的多聚核苷酸以產生擴增產物的擴增裝置；和 檢測和定量所述擴增產物的毛細管電泳儀，其中所述毛細管電泳儀的毛細管浸在所述的反應混合物中，將所述反應混合物的部分樣品從所述的擴增裝置轉移到所述 的毛細管電泳儀。
28. 權利要求27的設備，其還包括通過第二連接裝置和所述擴增裝置相連的多聚核 苷酸提取裝置，所述的第二連接裝置將提取的多聚核苷酸樣品從所述的多聚核苷酸 提取裝置轉移到所述的擴增裝置。
29. 權利要求27的設備，其還包括級分收集器。
30. 權利要求27的設備，其中所述的級分收集器通過第四連接裝置和所述的毛細管 電泳儀相連，以收集定量產物。
31. 權利要求27的設備，其還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序 列鑑定儀通過第五連接裝置和所述的毛細管電泳儀相連，所述的第五連接裝置將定 量產物從所述的毛細管電泳儀轉移到所述的序列鑑定儀。
32. 權利要求27的設備，其中向毛細管電泳儀的電極上施加電流，使浸在所述反應 混合物中的所述毛細管電泳儀的毛細管將所述反應混合物的部分樣品從所述的擴增 裝置轉移到所述的毛細管電泳儀。
33. 權利要求27的設備，其中所述的擴增裝置和所述的毛細管電泳儀還能夠進行多 聚核苷酸的序列鑑定。
34. 權利要求29的設備，其還包括鑑定定量產物序列的序列鑑定儀，其中所述的序 列鑑定儀通過第五連接裝置和所述的級分收集器相連，所述的第五連接裝置將收集 的產物從所述的級分收集器轉移到所述的序列鑑定儀。
35. 權利要求1、 7、 12、 18、 22和27中任意一項的設備，其中所述的擴增裝置是 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增裝置。
36. 權利要求35的設備，其中所述的第一連接裝置在每個PCR循環結束時將反應 混合物的部分樣品從所述的擴增裝置轉移到所述的分析裝置。
37. 權利要求1、 7、 12、 18、 22和27中任意一項的設備，其中所述的擴增裝置能 夠進行逆轉錄，生成cDNA。
38. 權利要求37的設備，其中用於逆轉錄的一個或多個引物與反應管內壁或微滴定 板的孔內壁化學連接。
39. 權利要求1、 7、 12、 18、 22和27中任意一項的設備，其中所述的設備能夠檢 測和定量一種或多種螢光標記物所產生的信號。
40. 權利要求l、 7、 12、 18、 22和27中任意一項的設備，其中所述的第一、第二、 第四或第五連接裝置是機器手。
41. 權利要求l、 7、 12、 18、 22和27中任意一項的設備，其中所述的第一、第二、 第三、第四或第五連接裝置是管或通道。
42. 權利要求l、 7、 12、 18、 22和27中任意一項的設備，其中所述的第一、第二、 第四和第五連接裝置是單一的連接裝置。
43. 權利要求1、 7、 12、 18、 22和27中任意一項的設備，其中電流施加在所述的 第一、第二、第四或第五連接裝置上，以進行轉移。
44. 權利要求1、 7、 12、 18和22中任意一項的設備，其中所述的分析裝置是毛細 管電泳儀。
45. 權利要求2、 7、 12、 20、 23和28中任意一項的設備，其中所述的多聚核苷酸 提取裝置從一種或多種生物材料中分離總RNA或mRNA。
全文摘要
用於表達譜分析、將生物材料進行多聚核苷酸提取、擴增和分析的設備。該設備包括擴增多聚核苷酸的擴增裝置和對擴增的多聚核苷酸產物進行定量的分析裝置。設備中的擴增裝置還可以提取多聚核苷酸以製備擴增用模板，或對定量多聚核苷酸產物進行序列鑑定。級分收集器可以包括在所述設備中，以在序列鑑定前收集定量的多聚核苷酸產物。分析裝置還能夠進行數據生成，或者作為替代方案，通過與所述設備聯用的分離的數據生成裝置來生成數據。所述設備中的裝置通過連接裝置相連，這些連接裝置能夠傳輸用作擴增和分析的流體或信號。
文檔編號C12N15/09GK101348763SQ20081009471
公開日2009年1月21日 申請日期2003年6月19日 優先權日2002年6月20日
發明者弗拉基米爾·I·斯列普尼奧夫 申請人:普裡梅拉生物系統有限公司