Mgb探針多重螢光定量pcr檢測大腸桿菌o157的方法
2023-07-10 11:33:56 2
專利名稱：Mgb探針多重螢光定量pcr檢測大腸桿菌o157的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域的檢測方法，特別是一種MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌O157的方法。
背景技術：
大腸桿菌O157是一種致病力很強的腸道致病菌，主要引起人和動物的出血性腸炎、溶血性尿毒症候群而致較強的死亡率。大腸桿菌O157的感染劑量較低，每克感染載體含菌10個以上即可能引起感染，甚至導致人的死亡。因此，急需建立一種快速、敏感的檢測方法。我國現行食品中檢測O157的行業標準是採用經典的選擇分離培養、生化試驗和血清學的方法，全過程需4--6天，耗時長、操作繁瑣，不能滿足及時、快速、正確評價食品微生物的安全性要求，養殖和進出口企業的生產需要。
大腸桿菌O157特異性基因的檢測是鑑定大腸桿菌O157的必需指標。rfbE基因編碼大腸桿菌O157的特異性表面抗原脂多糖，針對rfbE基因設計引物，可檢測大腸桿菌O157脂多糖，Desmarchelier等人根據rfbE基因設計了一對特異性很高的引物，所有大腸桿菌O157:H7，O157:H7-菌株PCR反應都為陽性，其他任何菌株則為陰性。Vero毒素是大腸桿菌O157的主要毒力因子之一，現已證實VT毒素與溶血性尿毒症候群相關。VT有VT1和VT2，VT2對人的腎臟微血管內皮細胞的細胞毒性作用比VT1強1000倍，因此將VT2基因作為O157的毒力指標。
經對現有技術文獻的檢索發現，運用實時螢光定量PCR方法快速檢測大腸桿菌O157:H7，詳見(Ken J.Yoshitomi，Karen C.Jinneman，StephenD.Weagant，以uid為靶基因3『小溝結合-DNA探針螢光定量PCR快速鑑定大腸桿菌O157:H7的優化，[分子和細胞探針])(Ken J.Yoshitomi，KarenC.Jinneman，StepheD.Weagant，optimization of a 3』-minor groovebinder-DNA probe targeting the uid gene for rapididentification of Escherichiacoli O157:H7 using real-time PCR[J].MOLECULARAND CELLULAR PROBES.2003，17275-280)。此文未能運用螢光定量PCR方法來對樣品進行定量，另外，以上方法只能單一確定細菌的血清型，不能檢測出是否含有重要的毒力因子。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌O157的方法。使其所使用MGB探針具有很高的敏感性和特異性，同時，檢測AT含量高的序列更為方便，可同時檢測大腸桿菌O157的兩個特異性基因。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明設計合成rfbE、vt2引物和Taqman-MGB探針，分別用rfbE、vt2引物進行PCR擴增，獲得兩個目的片斷，將目的片斷分別與PMD 18-T Vector連接，得到重組質粒，將重組質粒轉化DH5α感受態大腸桿菌細胞，擴大培養，提取高濃度的重組質粒，將此高濃度質粒作10倍比稀釋，作為標準樣品，將標準樣品和待測樣品共同作二重螢光定量PCR，標準樣品形成標準曲線，根據標準曲線計算出待檢樣品中大腸桿菌O157的含量。
此二重螢光定量PCR方法檢測拷貝數在100-1010範圍內的樣本都具有較好的動力學範圍，擬合度在0.99以上；在100-1010內重複性好，intra-assayCT值標準偏差(SD)0.07-2.07，變異係數(CV)0.005-0.06之間，inter-assay CT值標準偏差(SD)0.76-1.21，變異係數(CV)0.005-0.09；每個反應體系能檢測到100個細菌；具有很強的特異性(十株陽性菌，檢測結果均為陽性；50株陰性菌，檢測結果均為陰性)；螢光定量PCR結果和細菌計數結果能較好的吻合。
MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌O157的方法，具體步驟如下①設計、合成引物和Taqman-MGB探針通過比對幾株大腸桿菌O157rfbE基因和vt2基因的保守區，找出保守序列，設計引物和Taqman-MGB探針，rfbE探針用FAM螢光報告基團標記，vt2探針用ViC螢光報告基團標記，探針的淬滅基團為IFQ(非螢光淬滅基團)，3『端連接有MGB分子。
②PCR擴增rfbE、vt2基因，獲得目的片斷，PCR產物切膠回收；③構建重組質粒，將目的片斷和PMD 18-T Vector連接，連接後轉化DH5 α感受態大腸桿菌細胞，擴大培養，提取質粒，PCR和EcoRI、PstI酶切鑑定目的片斷是否已插入PMD 18-Tvector。
④二重螢光定量PCR反應體系和反應條件的確立通過反覆實驗，確定最優化的反應體系和循環條件⑤建立標準曲線，以5個稀釋度的重組質粒作為標準樣品建立標準曲線。同時，對樣品進行處理，處理後提取基因組DNA作二重螢光定量PCR，根據螢光定量PCR的結果，計算原始樣本中大腸桿菌O157的含量。
所述的引物，是指其序列為rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cat tgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata ta所述的Taqman-MGB探針，是指其序列為rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaarfbE探針的5′端標記FAM螢光報告基團，3′端標記Taqman-MGB基團vt2探針的5′端標記ViC螢光報告基團，3′端標記Taqman-MGB基團。
所述的二重螢光定量PCR，其反應體系如下Mastermix 10ul(2*)rfbE-F 1ul(終濃度為0.5uM)rfbE-R 1ul(終濃度為0.5uM)vt2-F 0.8ul(終濃度為0.4uM)vt2-R 0.8ul(終濃度為0.4uM)Probe-rfbE 0.6ul(終濃度為0.3uM)Probe-vt2 0.6ul(終濃度為0.3uM)水 3.2ul模板 2ul。
所述的二重螢光定量PCR，其反應體系的反應條件為94℃預變性4min94℃變性30s56℃退火30s60℃伸30sPlate readGoto line 2 for 50 cycles。
所述的樣品，待檢時，用鹼裂解法提取基因組DNA具體步驟如下取過夜培養的細菌液3ml，12000rpm，5min；沉澱用567ul的TE(PH 8.0)重懸，加入30ul 10％SDS 和3ul 20mg/ml蛋白酶K，混勻，60℃水浴20min；加入l00ul 5mol/LNacl溶液，充分混勻，再加入80ul CTAB/Nacl溶液，混勻，60℃ 水浴20min；加入780ul酚氯仿，混勻，12000rpm，10min；將上清液移入一個新管中。重複上一步；取400ul上清至一個新管中；加入400ul氯仿，混勻，12000rpm，10min，吸取上清300ul；加入兩倍體積冰冷的乙醇，混勻，-20℃ 放置30 min，12000rpm，20min，沉澱用70％乙醇洗三次，37℃溫箱乾燥，沉澱用100ul水溶解。
在本發明中，術語「探針」，是指一種寡核苷酸探針，它設計為與目的序列上遊引物和下遊引物之間的序列配對。螢光報告基團連接在探針的5′端，而淬滅劑則在3′端，當完整的探針與目標序列配對時，螢光基團發射的螢光因與3′端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5′外切酶活性將探針進行酶切，使得螢光基團與淬滅劑分離，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生螢光信號，所以，每經過一個PCR循環，螢光信號也和目的片斷一樣，有一個同步指數擴增的過程，信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。
探針與目標基因擴增產物特異性雜交保證了擴增過程中螢光的特異性，「淬滅」，當探針未結合時，其結構完整，報告基團被激發時產生的螢光能量通過螢光共振能量傳遞，被鄰近的淬滅基團所吸收。
Taqman-MGB探針，在探針3′端連接有MGB(Minor Groove Binder)修飾基團-二氫環化吲哚卟啉-三肽(DPI3)，DPI3可摺疊進入探針末端5-6bp核苷酸形成的小溝內，形成極為穩定的異源雙鏈。
在本發明中，「FAM螢光報告基團」是指六-羧基螢光素，標記在探針5′端，ViC螢光報告基團是PE Applied Biosystems專有的螢光染料，標記在探針5′端.
在本發明中，「標準品」是指已知拷貝數的重組質粒DNA，用分光光度計測定其OD值，當OD值在0.3左右時，此時測得的結果較可信，每管測三次，取平均值，計算重組質粒拷貝數。
螢光定量PCR定量的依據。特定的待擴增基因起始含量越大，則指數擴增過程越短，當擴增速率趨於穩定後，則無論原來樣品中起始模板含量多少，最終擴增片斷的含量是一樣的。理想的擴增結果是Y＝X*2n.其中Y代表擴增產物量，X代表PCR反應體系中的原始模板數，n.為擴增次數，理論上PCR擴增效率為100％，但實際上，DNA的每一次複製都不完全，即每一次擴增中模板不是呈2的倍數增長，實際應為Y＝X*(1+E)nE代表擴增效率，E＝參與複製的模板/總模板。通常E≤1，通常X在1-105拷貝，循環次數n≤30時，E相對穩定，原始模板以相對固定的指數形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數期。
PCR擴增通式Tn＝T0(1+E)n。設定PCR到達指數擴增期時，產生一定的螢光(螢光依賴某一循環擴增產物的總量，即特定的拷貝數K，為常數，大約在1010左右)高於背景為儀器所識別，此時的循環數為cp，也就是k＝T0(1+E)cp。取對數即1gK＝1gT0+cp*lg(1+E)Cp＝-1*1gT0/lg(1+E)+1gK/lg(1+E)對於某特定的PCR而言，E與k均為常數，故上式為循環數(cp)對原始模板拷貝數對數(lgT0)一次方程，其標準形式Y＝kx+b，也是螢光定量PCR的標準曲線。
本發明使用外參照物作定量PCR，以已知濃度的目的基因為模板，按一定的倍比稀釋，然後作出標準曲線圖，未知的樣本按標準曲線找出對應的拷貝數。
螢光閾值通常以10-15個循環的螢光值作為閾值。
CT值擴增產物的螢光信號達到設定的閾值時所經過的循環次數。
本發明具有更高的敏感性和特異性，能快速、準確地檢測樣本中的大腸桿菌O157含量，可同時檢測大腸桿菌O157的兩個特異性毒力基因，是一種快速、準確的大腸桿菌O157檢測方法。本發明所使用MGB探針進行螢光定量PCR，MGB探針是指帶有一個小溝結合物基團的DNA探針，它可與單鏈的靶DNA形成極為穩定的異源雙鏈。其優越性表現在1.背景螢光低，由於MGB探針報告基團與淬滅基團的距離較近，具有更好的淬滅效果，另外，MGB探針的淬滅基團採用非螢光淬滅基團，本身不產生螢光，可以大大降低本底信號的強度。2.提高Tm值，平均15bp可提高18℃，這樣可以使探針的長度更短，尤其對AT含量高的序列，且提高配對與非配對模板間的Tm值差異，即提高了特異性，可進行多重PCR。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，下列事實例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook分子克隆，或按照廠商所建議的條件。
實施例一1設計，合成rfbE、vt2引物和探針引物序列是rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cat tgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata taTaqman-MGB探針序列為rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaa2 rfbE、vt2基因的克隆根據設計的rfbE、vt2引物，分別擴增rfbE、vt2目的基因，PCR產物用2％瓊脂糖凝膠電泳，再用瓊脂糖凝膠成像分析系統分析，在大約100bp和150bp處有可見目的條帶。從PCR產物中回收目的基因。
3標準樣品的製備
DH5α感受態大腸桿菌細胞的製備從大腸桿菌DH5α平板上挑取一個單菌落接於2ml LB液體培養基中，37℃震蕩培養過夜；取2ml菌液轉接到一個含有30ml LB液體培養基錐形瓶中，37℃震蕩培養2-3小時，(此時OD600≤0.4-0.5，細胞數＜108/ml)；將細菌轉移到Eppendorf管中，冰上放置30min，使培養物至0℃；4℃4000rpm，10min；棄上清，倒置1min；加500ul預冷Cacl2 0.1mol/L重懸細胞，冰上放置30min；4℃4000 rpm，10min；棄上清，倒置1min；用200ul 0.1mol/L Cacl2重懸細胞，冰上放置30min。
4重組質粒的構建將PMD 18-T Vector和目的DNA以1∶3的比例連接，16℃ 11小時，連接產物轉化DH5α感受態大腸桿菌細胞。將已轉化的感受態大腸桿菌細胞塗布在含有氨苄青黴素(100ug/ml)的培養基上，37℃培養12-16小時。挑取陽性菌落，於含有氨苄青黴素(100ug/ml)的LB中震蕩培養37℃ 12-16小時。用培養的菌液提取質粒，採用PCR和EcR I、pst I酶切鑑定，PCR鑑定結果100bp和150bp處有可見的目的條帶。酶切鑑定結果150bp和200bp處有可見的目的條帶。可以確定目的片斷已插入PMD 18-T Vector，將提取的質粒作10倍比稀釋，測OD值，取平均值，計算拷貝數。
實施例二1臨床樣本的預增菌將1克肉樣剪碎，將1克肉樣剪碎，放入9毫升含新生黴素(20mg/ml)的改良肉湯中，37℃，200rpm，振蕩8 h。
2基因組DNA的提取取振蕩培養的細菌液3ml，12000rpm，5min；沉澱用567ul的TE(PH 8.0)重懸，加入30ul 10％SDS 和3ul 20mg/ml蛋白酶K，混勻，60℃ 水浴20 min；加入100ul 5mol/LNacl溶液，充分混勻，再加入80ul CTAB/Nacl溶液，混勻，60℃ 水浴20min；加入780ul酚氯仿，混勻，12000rpm，10min；將600ul上清液移入一個新管中。重複上一步；取400ul上清至一個新管中；加入400ul氯仿，混勻，12000rpm，10min，吸取上清300ul；加入兩倍體積冰冷的乙醇，混勻，-20℃放置30min，12000rpm，20min，沉澱用70％乙醇洗三次，37℃溫箱乾燥，沉澱用100ul水溶解，即可得到細菌基因組DNA.
3 PCR體系的優化Mastermix 10ul(2*)rfbE-F 1ul(終濃度為0.5uM)rfbE-R 1ul(終濃度為0.5uM)vt2-F 0.8ul(終濃度為0.4uM)vt2-R 0.8ul(終濃度為0.4uM)Probe-rfbE 0.6ul(終濃度為0.3uM)Probe-vt2 0.6ul(終濃度為0.3uM)水 3.2ul模板 2ul4最佳的反應條件為94℃預變性4min94℃變性30s56℃退火30s60℃延伸30sPlate readGoto line 2 for 50 cycles.
5根據螢光定量PCR結果，計算細菌原液的濃度-X(copies/ul)根據基因組提取以及螢光定量PCR的過程，可推導出以下公式(X*3000*300/780)/100＝螢光定量PCR結果(copies/2ul)即X＝(螢光定量PCR結果)*78/1800注公式的說明3000，是指基因組提取過程中，取振蕩培養的細菌液3ml，即3000ul。
300，是指基因組提取過程中，吸取上清300ul。
780，是指基因組提取過程中，(567ul的TE，30ul 10％SDS，3ul 20mg/ml蛋白酶K，100ul 5 mol/Lnacl，80 ul CTAB/Nacl，體積一共是780ul)100，是指基因組提取過程中，沉澱用100ul水溶解。螢光定量PCR結果，螢光定量PCR儀會自動顯示樣品的濃度，單位是copies/2ul。
權利要求
1.一種MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌0157的方法，其特徵在於，設計合成rfbE、vt2引物和Taqman-MGB探針，分別用rfbE、vt2引物進行PCR擴增，獲得兩個目的片斷，將目的片斷分別與PMD 18-T Vector連接，得到重組質粒，將重組質粒轉化DH5α感受態大腸桿菌細胞，擴大培養，提取高濃度的重組質粒，將此高濃度質粒作10倍比稀釋，作為標準樣品，將標準樣品和待測樣品共同作二重螢光定量PCR，標準樣品形成標準曲線，根據標準曲線計算出待檢樣品中大腸桿菌0157的含量。
2.根據權利要求1所述的MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌0157的方法，其特徵是，具體步驟如下①設計、合成引物和Taqman-MGB探針；②PCR擴增rfbE、vt2基因，獲得目的片斷，PCR產物切膠回收；③構建重組質粒，將目的片斷和PMD 18-T Vector連接，連接後轉化DH5α感受態大腸桿菌細胞，擴大培養，提取質粒，PCR和EcoR I、Pst I酶切鑑定目的片斷是否已插入PMD 18-Tvector；④二重螢光定量PCR反應體系和反應條件的確立；⑤建立標準曲線，以5個稀釋度的重組質粒作為標準樣品建立標準曲線；同時，對樣品進行處理，處理後提取基因組DNA作二重螢光定量PCR，根據螢光定量PCR的結果，計算原始樣本中大腸桿菌0157的含量。
3.根據權利要求1或者2所述的MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌0157的方法，其特徵是，所述的引物，是指其序列為rfbE-F cta gga ccg cag agg aaa gag arfbE-R ttc cga gta cat tgg cat cgtvt2-F acc aca tcg gtg tct gtt att aac cvt2-R aac gaa ccc ggc cac ata ta。
4.根據權利要求1或者2所述的MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌0157的方法，其特徵是，所述的Taqman-MGB探針，是指其序列為rfbE-probe att aag gaa tca cct tgc aga tvt2-probe ttt gct caa taa tca gac gaarfbE探針的5′端標記FAM螢光報告基團，3′端標記Taqman-MGB基團vt2探針的5′端標記ViC螢光報告基團，3′端標記Taqman-MGB基團。
5.根據權利要求1或者2所述的MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌0157的方法，其特徵是，所述的二重螢光定量PCR，其反應體系如下Mastermix 10ul(2*)rfbE-F 濃度為0.5uMrfbE-R 濃度為0.5uMvt2-F 濃度為0.4uMvt2-R 濃度為0.4uMProbe-rfbE 濃度為0.3uMProbe-vt2 濃度為0.3uM水 3.2 ul模板2ul。
6.根據權利要求5所述的MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌0157的方法，其特徵是，所述的二重螢光定量PCR，其反應體系的反應條件為94℃預變性4min94℃變性30s56℃退火30s60℃延伸30sPlate readGoto line 2 for 50 cycles。
7.根據權利要求1或者2所述的MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌0157的方法，其特徵是，所述的樣品，待檢時，用鹼裂解法提取基因組DNA具體步驟如下取過夜培養的細菌液3ml，12000rpm，5min；沉澱用567ul的TE(PH 8.0)重懸，加入30ul 10％SDS和3ul 20mg/ml蛋白酶K，混勻，60℃ 水浴20min；加入100ul 5mol/LNacl溶液，充分混勻，再加入80ul CTAB/Nacl溶液，混勻，60℃ 水浴20min；加入780ul酚∶氯仿，混勻，12000rpm，10min；將上清液移入一個新管中。重複上一步；取400ul上清至一個新管中；加入400ul氯仿，混勻，12000rpm，10min，吸取上清300ul；加入兩倍體積冰冷的乙醇，混勻，-20℃ 放置30min，12000rpm，20min，沉澱用70％乙醇洗三次，37℃ 溫箱乾燥，沉澱用100ul水溶解。
全文摘要
一種MGB探針多重螢光定量PCR檢測大腸桿菌O157的方法，構建重組質粒，設計合成引物和Taqman－MGB探針，進行二重螢光定量PCR，將大腸桿菌O157的rfbE、vt2的一段保守序列進行PCR擴增，獲得目的片斷，再將目的片斷與PMD 18－T Vector連接，得到重組質粒，將重組質粒轉化DH5a感受態大腸桿菌細胞，擴大培養，獲得高濃度的質粒，將此高濃度質粒作10倍比稀釋，作為標準樣品，將標準樣品和待測樣品共同作二重螢光定量PCR，標準樣品形成標準曲線，根據標準曲線可計算出待檢樣品中大腸桿菌O157的含量。本發明使用MGB探針，具有更高的敏感性和特異性，能快速、準確地檢測樣本中的大腸桿菌O157含量，可同時檢測大腸桿菌O157的兩個特異性毒力基因，是一種快速、準確的大腸桿菌O157檢測方法。
文檔編號C12Q1/10GK1952647SQ20061002832
公開日2007年4月25日 申請日期2006年6月29日 優先權日2006年6月29日
發明者嚴亞賢, 朱向玲, 孫建和, 陸承平 申請人:上海交通大學