南蛇藤莖的乙酸乙酯提取物在製備治療類風溼關節炎藥物中的應用的製作方法

2023-07-10 06:03:31 7

專利名稱：南蛇藤莖的乙酸乙酯提取物在製備治療類風溼關節炎藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及南蛇藤莖乙酸乙酯提取物在製備治療類風溼關節炎藥物中的應用，特別是對類風溼關節炎滑膜細胞侵襲具有抑制作用，對大鼠膠原誘導型關節炎有治療作用。
背景技術：
類風溼關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種嚴重危害人類健康的慢性自身免疫性疾病，基本病理改變為滑膜的增殖和侵襲，形成侵襲性血管翳，導致骨和軟骨破壞。若不積極有效地治療，70%的病人在起病兩年內發生骨質破壞，最終導致關節畸形。因此，對RA進行研究，尋找有效抗RA藥物，降低致殘率極為必要。目前RA病因及發病機理不完 全明了，可能是環境、遺傳、免疫等多因素作用的結果。現代醫學對本病得治療主要包括傳統的改善病情抗風溼藥物(DMARDs)以及近年來以B細胞、T細胞及促炎症因子等為靶點的生物製劑，但由於傳統DMARDs對機體具有免疫抑制作用，患者往往難以耐受其不良反應，有至少30%的患者對傳統DMARDs和生物製劑治療耐受，因此急需尋找具有多重作用機制的高效低毒的抗RA藥物。滑膜成纖維細胞(fibroblast-like synoviocyte, FLS),作為複雜細胞調控網絡中的一員，是RA的關鍵效應細胞，FLS侵襲在RA的發生、發展中起重要作用。研究發現，FLS侵襲不僅是導致RA關節破壞的主要原因，也是RA關節炎症向遠處關節蔓延的原因。鑑於FLS侵襲的機制尚未明確，缺乏有效的幹預藥物，因此，有必要進一步探討FLS侵襲的調控機制並尋找有效的幹預藥物。傳統中醫理論認為，RA (痺症)主要因「風寒溼三氣雜至」所致，治療上應以祛風除溼、散寒通絡為主。傳統中藥南蛇藤、雷公藤具有祛風除溼、活血通絡、消腫止痛等功效，臨床治療RA的中藥方劑中，有不少含有南蛇藤成分。南蛇藤分布資源極其豐富，在我國用於臨床抗風溼治療已有幾百年歷史，但以往由於缺乏對其藥效物質基礎及機理的研究，影響了它的開發與利用，因此，研究南蛇藤中活性成分治療RA的具體機制具有重要的意義。該專利申請中提到的南蛇藤莖乙酸乙酯提取物，是基於公開號為CN101120960A的專利中公開的製備方法得到。既往研究發現國內他人公開號為CN1823870A的專利製備的南蛇藤的根及藤莖中的提取物，證實其對佐劑誘導性關節炎大鼠具有抗炎、鎮痛、免疫抑制作用，但與我們的製備工藝不同，且南蛇藤莖的乙酸乙酯提取物對於RA-FLS侵襲的作用還未有報導。基於上述目的，本研究旨在觀察南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(COE)對RA-FLS侵襲的作用和機制，以及其在大鼠膠原誘導型關節炎(collagen-1nduced arthritis, CIA)治療中的應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種南蛇藤莖的乙酸乙酯提取物的新用途。本發明研究發現南蛇藤莖的乙酸乙酯提取物對類風溼關節炎滑膜細胞侵襲的抑制作用及在膠原誘導型關節炎大鼠的治療中的應用。因此本發明公開了製備治療類風溼關節炎藥物中的應用。所述類風溼關節炎是由滑膜侵襲引起的或者是膠原誘導型關節炎。本研究通過觀察RA-FLS侵襲能力的變化來驗證COE對RA-FLS侵襲的抑制作用。通過體外實驗，研究不同濃度的COE對炎症因子IL-1 β介導的RA-FLS侵襲的抑制作用，結果發現，非細胞毒濃度的COE (5，10，20yg/mL)預處理24小時，RA-FLS遷徙和侵襲能力顯著下降；非細胞毒濃度的COE (5，10，20 μ g/mL)可呈濃度依賴性的抑制MMP_9mRNA、蛋白、分泌水平及酶活性，而對MMP-2表達無影響，RNA幹擾阻斷MMP-9表達可抑制IL-1 β誘導的FLS侵襲；進一步研究發現，COE通過阻斷NF- K B與ΜΜΡ-9啟動子的結合以及I κ B α的磷酸化和核轉位，進而抑制ΜΜΡ-9的轉錄活性。另外我們進行了整體動物實驗，5-6周齡的雌性Wistar大鼠，右後足趾墊皮內免疫 CII及3周後加強免疫建立CIA大鼠模型，初次免疫後20天，隨機分為如下實驗組(I) CIA對照組；(2) COE (25mg/kg) +CIA組；(3) COE (50mg/kg) +CIA組；(4)正常對照組;(5)MTX(2mg/g/ M)+CIA組，每組有8隻大鼠，COE從第21天開始灌胃每天一次，MTX從第21天開始每周腹腔注射一次，CIA組和正常對照組給予同等劑量的生理鹽水處理。連續治療3周結果顯示，與空白組對比，25mg/kg與50mg/kg COE均能顯著改善CIA大鼠關節炎症與關節破壞程度，50mg/kg COE療效與MTX (2mg/kg)相似。本發明證實了純中藥製劑COE在體外具有顯著的抗RA-FLS侵襲的作用，並且對於CIA大鼠滑膜炎症與關節破壞也具有明顯的抑制作用，避免了傳統抗風溼藥物的毒副作用，並且高劑量組與甲氨蝶呤具有相似的抗RA療效，有利於進一步明確南蛇藤有效成分抗RA的藥效物質基礎及機理，為進一步開發和利用南蛇藤有效成分治療RA提供研究基礎。


圖1COE對IL-1 β誘導的RA-FLS遷徙與侵襲的影響。與正常對照組相比差異有統計學意義，*ρ〈0· 05廣Ρ〈0. 01，與IL-1 β組相比差異有統計學意義廣Ρ〈0. 05， 〈· 01。圖2C0E通過抑制ΜΜΡ-9活性進而抑制IL-1 β誘導的RA-FLS遷徙與侵襲。與正常對照組相比差異有統計學意義，呷〈O. 01，與IL-1 β組相比差異有統計學意義， Ρ〈0· 05，**Ρ<0. 01。圖3C0E通過抑制IL-1 β刺激的NF-κ B活性下調ΜΜΡ-9轉錄活性。與正常對照組相比差異有統計學意義，乍〈O. 05廣Ρ〈0. 01，與IL-1 β組相比差異有統計學意義， Ρ〈0· 05，**Ρ<0. 01。圖4C0E抑制NF- κ B DNA與ΜΜΡ-9啟動子結合活性及NF- κ B信號通路的轉導。圖5C0E抑制大鼠CIA關節破壞及臨床症狀。其中A :正常對照組；B :CIA對照組；C C0E(50mg/kg) +CIA 組；D C0E (25mg/kg) +CIA 組；E MTX (2mg/kg/ 周)+CIA 組。*Ρ〈0· 05versus CIA+ 空白對照組，與CIA+C0E (25mg/kg)組相比差異有統計學意義Λ P〈0. 05。圖6C0E抑制大鼠CIA關節滑膜炎症。其中A :正常對照組；B :CIA對照組；C :COE (25mg/kg) +CIA 組；D C0E (50mg/kg) +CIA 組；E MTX (2mg/kg/ 周)+CIA 組。與 CIA 空白對照組相比差異有統計學意義廣P〈0. 05，與CIA+C0E(25mg/kg)組相比差異有統計學意義，fΡ〈0·05。
具體實施方式
實施例1 :C0E對RA-FLS侵襲的抑制作用與機制1.材料與方法1.1 藥物南蛇藤購自廣州致信藥業有限公司，經中國藥科大學中藥資源研究室秦民堅教授鑑定為衛矛科南蛇藤屬植物南蛇藤的藤莖。將南蛇藤莖切斷、粉碎成粉，烘乾(15kg)，用95%乙醇(150L)提取3h，重複3次，合併提取液，回收乙醇，浸膏(900g)加水分散後，石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯層，水洗滌3次，減壓濃縮，真空凍幹，得南蛇藤莖乙酸乙酯提取物(COE) 250g,含生藥60g/g提取物，貯存於4° C，使用前以DMSO助溶。DMSO作用於細胞的終濃度(體積比)不超過O.1 %。經NMR和MS方法分析，COE中 (以重量百分百計)山海棠二萜內酯A39. 5%,13-胡蘿蔔甙31. 6%, (+)-兒茶素6. 6%, 2,4,6-三甲氧基苯酌· -1-0- β -D-葡萄糖苷 5. 3%, (5 β，8 α，9 β，10 α，16 β ) -16-hydroxykauranel8-oic acid4. 7%，水楊酸4. O %，槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖苷(異槲皮素)4. O槲皮素7-0- β -D-葡萄糖苷2.6%，香草酸1.7%。1. 2RA滑膜成纖維細胞分離及培養滑膜組織取自行膝關節鏡滑膜切除術的RA患者，剔除脂肪組織後，將滑膜剪碎至Imm3的小塊，D-Hanks液漂洗三次，lmg/mL膠原酶的DMEM消化2h，70 μ M孔徑的尼龍網過濾後離心，PBS漂洗，沉澱重懸於含10%FBS的DMEM/F12培養液。隔天進行換液，一周後進行鑑定。利用流式細胞術，聯合巨噬細胞表面標記(CD14和CD68〈1%)和成纖維細胞表面標記(⑶90>98%)進行鑑定。原代培養細胞長滿瓶底80%-90%即可傳代培養，取第3代-6代用於實驗。傳代的FLS長至60%左右融合時，換無血清培養基培養24h，進行實驗。1. 3細胞存活力分析使用MTT法進行FLS的細胞存活力分析。將FLS按I X IO4/孔加入96孔板中，加入不同濃度的 C0E(5，10, 20, 40and80 μ g/mL)處理 20h，每孔加入 20 μ LMTT(5mg/mL)孵育4h，繼續加入100 μ L DMSO溶解，使用光度計(Thermo, Waltham, MA, USA)檢測550nm的吸光度值計算細胞存活力。1. 4細胞周期分析使用流式細胞儀(BD，USA)進行細胞周期分析，I X IO6FLS被加入IOOmm培養皿，用不同濃度COE (5，10, 20and40 μ g/mL)處理24h，隨後收穫細胞，PBS漂洗2次，70%乙醇4° C固定 Ih 並離心,加入 RNase (50 μ g/mL)孵育 30min,室溫下 PI (50 μ g/mL)染色 30min, FCM分析每組細胞的sub Gl值。1. 5Transwell小室檢測細胞侵襲力首先用50mg/L 的 Matrigell :8 稀釋液包被 Transwell 小室(BDBiosciences，USA)的上室面，4°C風乾。吸出培養板中殘餘液體，每孔加入50uL含IOg/L BSA的無血清培養液，37°C，30分鐘。將Transwell小室放入24孔培養板中，取5X IO4細胞重懸於2%FBS的DMEM培養液中，並加入到上室，下室加入對應含有10ng/mL人IL-1 β (R&D, Minneapolis, MN, USA)的無血清培養基。常氧或低氧培養24小時，取出Transwell小室，用棉籤擦去微孔膜上層的細胞，5%多聚甲醛固定，蘇木素染色。在倒置顯微鏡下(X 100)隨機選擇5個視野，計數移至微孔膜下層的細胞，每組至少3個復孔重複2次,FLS侵襲力以均數土標準差表示。1. 6小幹擾RNA (SmalI interfering RNA, siRNA)轉染使用脂質體2000轉染針對人基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9, AppliedBiosystems, USA))的 siRNA。人 MMP-9 基因(GenBank 編碼 NM_004994) siRNA 由 ABI 公司合成，取目的基因siRNA和對照組siRNA各lmg，重懸於100 μ L脂質體2000，並與等體積的無血清DMEM培養液混合，加入5 X IO5FLS進行培養，利用脂質體2000瞬時轉染siRNA片段到FLS中，48小時後用Real-time PCR檢測其RNA水平以及Western blot檢測其蛋白水平，同時觀測細胞增殖情況。1. 7 實時定量 PCR(Real-time PCR)利用ABI 公司 Primer Express 軟體(version2. 0-PE Applied Biosystems)進行引物設計，ABI公司進行合成。使用SuperScriptMIII Platinum SYBR Green —步法qRT-PCR 試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)進行 Real-time PCR 法檢測，以 GAPDH 為內參。引物如下 MMP-2F 5 ; -CCG TCG CCC ATC ATC AAG TT-3 ; (SEQ ID NO.1),MMP-2R 5 ; -CTG TCT GGG GCA GTC CAA AG-3 ; (SEQ ID NO. 2);MMP-9F:5 ; -GGG ACG CAG ACA TCG TCA TC-3 ; (SEQ ID NO. 3),MMP-9R:5 ; -TCG TCA TCG TCG AAA TGG GC-3 ; (SEQ ID NO. 4)；GAPDHF:5 ; -ATC CCG CTA ACA TCA AAT GG-3 ; (SEQ ID NO. 5),GAPDHR:5 ; -GTG GTT CAC ACC CAT CAC AA-3 ; (SEQ ID NO. 6)。目的基因RNA 定量用 2_竭法進行計算，Λ Δ Ct=(CtTarget—CtGAPDH)— (Ctcontro1-CtGAPDH).，每組實驗重複三次。1. 8ffestern blot分析各種蛋白的表達各實驗組分別收集FLS，總蛋白抽提試劑盒抽提蛋白(MiIlipore, Billerica, MA, USA), BCA 法進行蛋白定量(Thermo Scientific),冰上放置40min，4°C下離心40min，取上清。取30μ g蛋白樣品，10%SDS_PAGE電泳，轉膜至ECL硝酸纖維素薄膜(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA), 5%BSA37°C封閉 2 小時；一抗 4°C孵育過夜，ant1-1 κ Ba (I 400)，p65 (1:400)，phospho-1 κ Ba (ρ-Ι κ Ba ) (I 500)，ρ_ρ65 (1:500) ,ΜΜΡ-2 (1:400), ΜΜΡ-9 (1:400)與 β-actin (1:1000)均購自 Santa cruz 公司，二抗室溫孵育2小時，β -actin為內參。ECL顯色(GE Healthcare)，膠片掃描後輸入電腦，用Quantity One軟體行進行灰度定量分析，以目的蛋白與內參比值評價目的蛋白的相對表達量。1. 9ELISA收集細胞上清用於檢測分泌的MMP-9的表達量，使用MMP-9ELISA試劑盒(GEHealthcare)分析MMP-9的表達量，建立標準曲線，以激發波長490nm/散發波長520nm表示MMP-9的表達量。1. 10明膠酶譜分析使用明膠酶譜法分析MMP_2、9的酶活性，FLS在無血清培養基培養24h，收集上清，用含有1%的明膠的10%SDS進行電泳分離，2. 5%Triton X-100洗滌2次去除SDS，膠在50mMTris-HCl (pH7. 5), 5mM CaCl2,與 ΙμΜ ZnCl2 中 37。C 下過夜，0. 25% 考馬斯亮藍 R-250 染色30min,蒸懼水中洗漆顯示。
1. 11雙螢光素酶報告基因分析使用雙螢光素酶報告基因分析系統(Promega，Madison, WI, USA)檢查目的基因轉錄活性。首先分別構建目的基因MMP-9, NF- κ B與活化蛋白-1 (activator proteinl, AP-1)與突變NF- κ B (mNF- κ B)和MMP-9mAP_l的螢火蟲螢光素酶質粒(pGL2_basic)和對照組海腎螢光素酶質粒(Renilla Iuciferase)。I X IO5的FLS接種於24孔板，待細胞80%_90%融合時，使用脂質體2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)共轉染目的基因螢火蟲突光素酶和對照組海腎螢光素酶質粒，24小時後加入COE並使用10ng/mL人IL-1 β刺激。實驗結束收穫細胞，超聲裂解，離心後收集上清，光密度計(Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, USA)檢測光密度值。以目的基因螢光素酶值/海腎螢光素酶值為相對螢光強度表示轉錄活性。1. 12凝膠遷移實驗(EMSA) 設計針對AP-1與NF-KB32P標記的寡核苷酸探針(Promega, Madison, WI, USA), AP-1 寡核苷酸探針(5 ' -CGC TTG ATG AGT CAG CCGGAA-3 ;，SEQ ID NO. 7) ;NF_kB 寡核苷酸探針(5 ; -AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGGC-3 ;，SEQ ID NO. 8)。收穫各實驗組細胞，提取細胞核蛋白並定量(Novagen，GerTmany)。核抽提產物重懸於細胞裂解液(含有0.5mM DTT和0.2mM PMSF)。取核蛋白IOyg與探針及結合緩衝液37°C孵育30分鐘，混合物在O. 5XTBE緩衝液(0. 4M Tris, O. 45M boricacid, 0. 5M EDTA, pH8. 0)中進行5%聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，發光顯色後將膠片掃描輸入電腦，用Quantity One分析軟體分析條電泳條帶面積及灰度值，以面積灰度值表示DNA結合活性。1. 13染色質免疫共沉澱(ChIP)使用ChIP 檢測試劑盒(Upstate Biotechnology, NY, USA)檢查核蛋白與人 MMP-9基因啟動子的相關性，Primer Express軟體設計包含2個NF- κ B結合位點的CXCR4啟動子引物，公司合成。根據試劑盒說明進行操作，首先收穫各實驗組細胞進行裂解，I X IO7細胞用ImL的SDS裂解液裂解，沉澱細胞，細胞沉澱用ImL含有5 μ L蛋白酶抑制劑CocktailII的SDS細胞裂解液重懸，冰浴孵育10分鐘；摸索超聲條件，找到可以使大部分基因組DNA斷裂成200-1000bp大小的超聲次數，進行超聲剪切基因組DNA ;取出以上樣品，置於冰浴中，每管加入含有4. 5μ L Cocktail II的稀釋緩衝液900 μ L，免疫複合物中加入p65及對照組抗體；MMP-9啟動子PCR引物(373bp包括NF- κ B, GenBank編碼AF538844)如下sense (5 ' -CAC TTC AAA GTG GTA AGA-3 ;，SEQ ID NO. 9), ant1-sense (5 ; -GAA AGTGAT GGA AGA CTC C_3 ;，SEQ ID NO. 10)，DNA純化後，進行PCR擴增32循環，產物進行瓊脂糖凝膠電泳，成像系統顯示結果。2.結果結果顯示，與對照組相比，高劑量的COE (40 μ g/mL與80 μ g/mL)減少細胞活力，FACS檢測細胞周期顯示COE (40 μ g/mL)導致sub_Gl的增加；非細胞毒濃度的COE(5，10，20 μ g/mL)預處理24小時，RA-FLS遷徙和侵襲能力顯著下降(見圖1);非細胞毒濃度的COE (5，10，20 μ g/mL)可呈濃度依賴性的抑制MMP_9mRNA、蛋白、分泌水平及酶活性，而對MMP-2表達無影響，RNA幹擾阻斷MMP-9表達可抑制IL-1 β誘導的FLS侵襲(見圖2);進一步研究發現，COE通過阻斷NF- κ B與ΜΜΡ-9啟動子的結合以及I κ B α的磷酸化和核轉位，進而抑制ΜΜΡ-9的轉錄活性(見圖3-4)。
實施例2 C0E治療CIA大鼠雌性的Wistar大鼠(5_6周齡，170± IOg)由揚州大學動物實驗中心提供，按標準條件進行飼養(23° C±3° C，55%土 10%溼度，12小時日夜周期)，符合揚州大學的動物實驗倫理學要求。CII (Sigma-Aldrich, MO, USA)溶解於O. 5mol/L醋酸(5mg/mL),與等體積的不完全弗氏佐劑(Sigma-Aldrich，MO，USA)冰上進行乳化。在O天，大鼠右後足趾墊皮下注射100 μ L乳化的CII，21天後免疫加強，對照組在同樣的時間點給予等量的生理鹽水注射。COE在大鼠的半數致死量(LD50)為1. 03g/kg，經過前期使用不同劑量的C0E(10_50mg/kg),結合LD50確定25mg/kg與50mg/kg為實驗劑量。初次免疫後20天，大鼠隨機分為如下實驗組(I) CIA 對照組;(2) COE (25mg/kg) +CIA 組;(3) COE (50mg/kg) +CIA 組；(4)正常對照組；(5)MTX(2mg/kg/周)+CIA組，每組有8隻大鼠，COE從第21天開始每天灌胃一次，MTX從第21天開始每周腹腔注射一次，CIA組和正常對照組給予同等劑量的生理鹽水處理。CIA關節炎指數(Al)採用關節評分法(O 4級)。評定依據為關節紅腫程度和範 圍以及關節腫大和變形情況。O分無關節炎；1分有紅色斑點或輕度腫脹；2分關節部位中度腫脹；3分嚴重腫脹；4分嚴重腫脹且不能負重。每隻大鼠四肢最高總分為16分。在第43天,大鼠的右後足採用齒科X-線(Planmeca 0y, Helsinki, Finland)進行放射學評估，工作條件設定(ls，60kV與3mA)。滑膜病理學評分包括滑膜襯裡層增生、襯裡下層炎症程度及血管生成情況。襯裡層增生評分少於3層為O分，3 4層為I分，5 6層為2分，6層以上為3分。炎症程度評分無炎症細胞浸潤為O分，炎症細胞散在分布為I分，瀰漫分布為2分，形成淋巴濾泡或生發中心為3分。連續治療3周結果顯示，與空白組對比，25mg/kg與50mg/kg COE均能顯著改善CIA大鼠關節炎症與關節破壞程度，50mg/kg COE療效與MTX (2mg/kg)相似(見圖5_6)。這說明COE對大鼠CIA關節破壞及滑膜炎症具有明顯的抑制作用。
權利要求
1.南蛇藤莖的乙酸乙酯提取物在製備治療類風溼關節炎藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述類風溼關節炎是由滑膜侵襲引起的。
3.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述類風溼關節炎是膠原誘導型關節炎。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及南蛇藤莖乙酸乙酯提取物在製備治療類風溼關節炎藥物中的應用，特別是對類風溼關節炎滑膜細胞侵襲具有抑制作用，對大鼠膠原誘導型關節炎(collagen-inducedarthritis,CIA)有治療作用。本發明南蛇藤乙酸乙酯提取物為純中藥製劑，避免了傳統抗風溼藥物的毒副作用，並且高劑量組與甲氨蝶呤具有相似的抗RA療效，有利於進一步明確南蛇藤有效成分抗RA的藥效物質基礎及機理，為進一步開發和利用南蛇藤有效成分治療RA提供研究基礎。
文檔編號A61P19/02GK103006747SQ201310008310
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月10日 優先權日2013年1月10日
發明者劉延慶, 李國青, 錢亞雲, 張華 申請人:揚州大學