人源化抗炭疽保護性抗原pa的抗體及應用的製作方法
2023-07-10 04:34:46
人源化抗炭疽保護性抗原pa的抗體及應用的製作方法
【專利摘要】人源化抗炭疽保護性抗原PA的抗體及應用，所述抗體的重鏈可變區具有SEQIDNO:2的胺基酸序列，輕鏈可變區具有SEQIDNO:4的胺基酸序列；重鏈恆定區具有SEQIDNO:6的胺基酸序列，輕鏈恆定區具有SEQIDNO:8的胺基酸序列。該抗體能夠特異性結合炭疽保護性抗原（PA），阻斷致死因子合LF進入細胞內，從而發揮保護性作用。
【專利說明】人源化抗炭疸保護性抗原PA的抗體及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及抗炭疽單抗的基因、基因編碼的多肽、鼠源單抗及人鼠嵌合抗體製備技術，以及所述基因和多肽在製備炭疽治療、預防性藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]炭疽病是一種由炭疽芽孢桿菌引起的人畜共患的急性烈性傳染病，主要通過皮膚、消化道、呼吸道感染動物和人，在世界範圍內廣泛分布。炭疽芽孢桿菌在血液中可產生並釋放三種蛋白:保護性抗原(protective antigen, PA)、致死因子(lethal factor, LF)、水腫因子(edema factor, EF)。實驗證實，炭疽毒素是一種AB (active-binding)的模式。PA即PA83是複合物中的「B」，與細胞膜上的炭疽毒素受體(2型毛細血管形成蛋白CMG2或腫瘤肉皮細胞標誌8TEM8)結合，由位於細胞膜上的Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20，餘下的63kD片段(PA63)發生寡聚化，在膜上形成七聚體((PA63)7)。LF和EF是「A」，能夠結合七聚體形成的複合物通過受體介導的內吞進入細胞。在內吞小體酸性pH的環境下，PA七聚體發生構象改變，形成一個管道，使EF和LF進入細胞液，分別發揮毒性作用。這三種蛋白本身是無毒的，但PA和LF的混合物稱為致死毒素，PA和EF的混合物稱為水腫毒素。在體外實驗研究中，單純使用高純度的致死毒素或水腫毒素可以使動物死亡。通過阻斷PA與受體結合或是與LF及EF，以及影響其寡聚化，都可以有效防止炭疽毒素的致病作用。而且PA能誘導機體的保護性免疫，是目前唯一獲美國食品藥品監督管理局批准的人用炭疽吸附疫苗(anthrax vaccine absorbed, AVA)的主要活性成分。因此,保護性抗原是炭疽病治療的理想靶點。
[0003]炭疽的醫學防護措施主要有預防和治療二大方面。目前有效的預防措施主要是接種炭疽疫苗，接觸前I~2個月進行預防接種，能為人群提供免疫防護。有效的治療措施主要有二大類:一類是炭疽桿菌的抑菌劑和殺菌劑，其中包括抗菌素和噬菌體的溶菌成分；另一類是根據炭疽病理模型設計的毒素抑制劑，主要包括炭疽毒素的中和抗體、可溶性受體、毒素突變體和小分子拮抗劑。
[0004]炭疽感染的治療包括高劑量靜脈注射和口服抗生素，例如青黴素、環丙沙星、四環
黴素、
[0005]紅黴素、和萬古黴素。而以抗生素治療必須及時,且對於已釋放的毒素是沒有效果的，而且目前已發現具抗藥性的菌株。
[0006]國內外的研究表明，在暴露於炭疽芽孢之前使用抗PA抗體，能夠起到預防炭疽感染保護機體的作用。而且，在攻毒後一定時間給藥(24~48h)仍能起到保護作用，即使是在出現體徵後給藥也可以起到一定的治療作用。
[0007]現已有多家公司或研究所機構進行炭疽抗體的研究，國外已有多家公司正在進行臨床前研究。但是中國 專利中關於炭疽抗體的研究顯示抗體的結合力或是動物保護效果還有很大的提升空間。
【發明內容】
[0008]解決的技術問題:本發明提供一種人源化抗炭疽保護性抗原PA的抗體及應用，通過單克隆抗體技術篩選到了對炭疽保護性抗原PA具有高度親和力的單克隆抗體，並獲取了賦予所述抗體異特性的重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列和核苷酸序列，並對所述抗體的重鏈和輕鏈恆定區進行了人源化改造，最終獲得了具有特異的抗原結合性、優異的毒素中和活性以及良好的動物保護功能。
[0009]技術方案:抗炭疽保護性抗原(Protective Antigen, PA)的雜交瘤細胞株PA6。
[0010]抗PA單克隆抗體PA6，由上述雜交瘤細胞株PA6產生。
[0011]一種含有上述抗體重、輕鏈可變區的抗PA的人鼠嵌合單克隆抗體，所述單克隆抗體的重鏈可變區具有SEQ ID NO:2的胺基酸序列，輕鏈可變區具有SEQ ID NO:4的胺基酸序列。 [0012]所述單克隆抗體的重鏈恆定區具有SEQ ID N0:6的胺基酸序列，輕鏈恆定區具有SEQ ID NO:8的胺基酸序列。
[0013]所述重鏈可變區具有SEQ ID NO:1的DNA序列，輕鏈可變區具有SEQ ID N0:3的DNA序列。
[0014]所述重鏈恆定區具有SEQ ID NO: 5的DNA序列，輕鏈恆定區具有SEQ ID NO: 7的DNA序列。
[0015]一種含有編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈的核苷酸編碼的表達載體，重鏈可變區具有SEQ ID NO:1的DNA序列，輕鏈可變區具有SEQ ID NO: 3的DNA序列，重鏈恆定區具有SEQID NO: 5的DNA序列，輕鏈恆定區具有SEQ ID NO: 7的DNA序列。
[0016]所述載體為抗體IgGl亞型分泌型真核表達載體。
[0017]一種含有上述的表達載體的宿主細胞，宿主細胞為FreeStyle?293-F cells。
[0018]所述的單克隆抗體在製備治療炭疽病藥物中的應用。
[0019]有益效果:本發明提供了一種具有高保護性、高特異性、高親和力抗PA的人鼠嵌合單克隆抗體hmPA6。PA是炭疽芽孢桿菌在血液中釋放的蛋白，因此本發明的單克隆抗體hmPA6可應用於有關炭疽病的診斷、治療及預防研究中。
[0020]本發明以保護性抗原PA為靶分子，製備出鼠源單抗PA6，在PA6的基礎上製備出人鼠嵌合抗體hmPA6。對製備的鼠源單抗PA6及人鼠嵌合抗體hmPA6做功能鑑定。免疫學檢測顯示，該鼠源單抗和人鼠嵌合抗體能夠與炭疽保護性抗原PA63和PA83特異性結合，體外中和實驗結果證實，PA6和hmPA6抗體能夠有效的阻斷炭疽毒素的致病作用。以Fischer344大鼠為模型，體內試驗證實hmPA6抗體保護率達100%。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1為重組PA83蛋白的SDS-PAGE檢測結果，M，marker ;1，細菌超聲上清；2，純化的-PA83蛋白。可見蛋白純度達90%以上；
[0022]圖2為純化PA6抗體的SDS-PAGE檢測結果，M，marker ;1，PA6抗體；2，細胞培養上清；3,流穿；可見純化的抗體純度很高；
[0023]圖3為抗PA單克隆抗體PA6的酶聯免疫吸附試驗檢測結果，可見PA6抗體與PA83蛋白的結合能力較強；[0024]圖4為抗PA單克隆抗體PA6與PA63重組蛋白的抗原免疫印跡鑑定結果，M，marker ;1，PA63重組蛋白表達細菌裂解上清；2，無關蛋白表達細菌裂解上清。可見PA6抗體對PA63重組蛋白有特異性結合能力；
[0025]圖5為抗PA單克隆抗體PA6與減毒株來源的抗原免疫印跡鑑定結果，M, marker ；1，減毒株裂解上清；2，炭疽無關蛋白表達細菌裂解上清。可見PA6抗體對減毒株保護性抗原PA蛋白有特異性結合能力；
[0026]圖6為抗PA單克隆抗體PA6的體外細胞保護性實驗的結果，可見篩選的雜交瘤細胞株中，PA6抗體保護效果最好，在LF達到10 μ g/mL時，PA6保護率達到95%以上；
[0027]圖7為hmPA6重組表達質粒構建的核酸電泳結果，逆轉錄PCR擴增PA6重、輕鏈。M, DL2000 ;1，PA6 重鏈可變區 PA6VH ;2，PA6 輕鏈可變區 PA6VK ；
[0028]圖8為hmPA6重組表達質粒構建的核酸電泳結果，M，DL10000 ;1，重組表達hmPA6重鏈質粒即 pFUSE-CHIg-hGl—hmPA6H ;2，線性化重鏈模板質粒 pFUSE_CHIg_hGl ;3，hmPA6重鏈可變區即hmPA6VH ;4，重組表達hmPA6輕鏈質粒即pFUSE-CLIg-hk_hmPA6K ;5，線性化輕鏈模板質粒pFUSE-CLIg-hk ;6，hmPA6輕鏈可變區即hmPA6VK ；
[0029]圖9為純化抗體hmPA6的SDS-PAGE檢測結果，M，marker ;1，hmPA6純化抗體；2，對照IgG ;3，培養上清；4，流穿；5，未轉染質粒293F培養上清；
[0030]圖10為抗PA單克隆抗體hmPA6的酶聯免疫吸附試驗檢測結果；
[0031 ] 圖11為抗PA單克隆抗體hmPA6免疫共沉澱的SDS-PAGE結果，M，marker ； I，hmPA6與減毒株細菌裂解上清 共孵育；2，hmPA6 ;3，減毒株PA83蛋白；4，陰性對照(無關IgG與減毒株細菌裂解上清共孵育)。可見hmPA6抗體可以拉下蛋白大小為83kDa以及63kDa大小的蛋白，將兩條帶切下做質譜。因為減毒株細菌裡並不表達PA63蛋白，其為PA83蛋白裂解產生，量較少；
[0032]圖12a為83kDa大小蛋白的免疫共沉澱的質譜結果；
[0033]圖12b為63kDa大小蛋白的免疫共沉澱的質譜結果；
[0034]圖13為抗PA單克隆抗體hmPA6的體外細胞保護性試驗的結果，可見抗體hmPA6在濃度只有4 μ g/mL而毒素LF濃度達到10 μ g/mL的時，細胞保護率仍能夠達到80%以上；
[0035]圖14為抗PA單克隆抗體hmPA6動物體內試驗的結果，該抗體在每隻大鼠給予50ug抗體時可以達到100%保護率；
[0036]圖15為抗體可變區序列與抗體庫的蛋白序列比對圖。
【具體實施方式】
[0037]實施例1鼠源單抗PA6的製備及篩選檢測
[0038]I)應用雜交瘤技術製備抗PA單克隆抗體,具體步驟如下:
[0039]一、製備抗原(PA83蛋白)
[0040]構建PA83表達質粒.[0041]將上述質粒轉化大腸桿菌BL-21感受態細胞，篩選陽性轉化子進行原核表達，對表達產物進行SDS-PAGE檢測，獲得了 83kd的重組蛋白，與PA83蛋白的分子量大小相符，用His親和層析柱(美國Amersham公司)對目的蛋白進行純化，獲取帶有His標籤的PA83重組蛋白，命名為PA83蛋白。見圖1。[0042]二、製備抗PA的雜交瘤細胞株(所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤SP2/0細胞系均來源於純系BALB/c小鼠):
[0043]用PA83重組蛋白作為免疫原在小鼠腹部皮下注射進行免疫接種，每次IOOyg/mL，共五次，在最後一次免疫接種前三天進行腹腔內加強免疫。融合當天取小鼠脾臟，用RPM1-1640不完全培養基(美國GIBCO公司)製備成單細胞懸液，在50%PEG (pH8.0)存在下，將脾細胞和SP2/0小鼠骨髓瘤細胞進行融合，用HAT選擇性培養基(RPM1-1640培養基98mL, HT貯存液lmL，A貯存液ImL)培養7天，換用HT培養基(RPM1-1640培養基99mL，HTlmL)培養。
[0044]三、抗PA陽性單克隆抗體的篩選
[0045]根據雜交瘤細胞生長情況行常規ELISA檢測篩選，取檢測陽性孔的細胞再次克隆化，經過5次克隆化，待所有的孔內單克隆細胞檢測都為抗PA陽性後，取數孔擴大培養並部分凍存。最終選取4株穩定分泌抗PA抗體的雜交瘤細胞，分別命名為PA5、PA6、PA7、和PA8,它們分泌的單抗分別命名為PA5、PA6、PA7、和PA8。
[0046]四、單克隆抗體的亞型鑑定
[0047]用美國Sigma公司的單克隆抗體亞型鑑定試劑盒(IS0-2KT)進行抗體的亞型,結果示抗PA抗體？45、？46、？八7、和PA8的亞型都為IgGl。
[0048]五、單抗的大量培養並純化
[0049]用雜交瘤專用無血清培養基(Hybridoma,Gibico)大量培養四株雜交瘤細胞株。5天後收集培養上清，用Protein G親和層析柱(美國Amersham公司)純化抗體，測定濃度後分裝，-70°C凍存。
[0050]純化結果見圖2所示抗體純度達到95%以上。
[0051]2)抗PA單克隆抗體PA6的功能活性鑑定
[0052]一、ELISA
[0053]用酶聯免疫吸附試驗對實施例1的PA6和PA83蛋白的結合進行鑑定。具體方法為:用包被液(0.1M碳酸鹽緩衝液，pH9.6)稀釋PA83蛋白至2μg/mL包被ELISA96孔板，每孔加入100 μ L，4°C過夜；PBST (PBS含0.5%Tween20)5%脫脂牛奶-洗滌緩衝液封閉，37°C孵育2h ；PBST洗滌5次後，每個孔中加入100 UL PA6 (2μ g/mL起始濃度，15個濃度梯度稀釋)4°C過夜；以1:4000稀釋的羊抗鼠二抗(北京中杉公司)100 μ L/孔加入到孔內，37°C孵育Ih ;過氧化物酶底物顯色液100 μ L/孔,室溫下15分鐘後用2Μ硫酸中止反應,上機檢測比色採用雙波長450nm/690nm。
[0054]結果見圖3示:該純化的單克隆抗體PA6與減毒株PA83蛋白有較好的結合活性，且能識別蛋白抗原的構象表位。
[0055]二 WB
[0056]對實施例1的PA6進行免疫印跡鑑定。具體方法為:以表達其他蛋白的大腸桿菌株為陰性對照，分別將PA63重組蛋白表達細菌、減毒株和炭疽無關蛋白細菌株裂解上清進行10%SDS-PAGE電泳並電轉到硝酸纖維膜上，將此膜與2 μ g/mL PA6室溫孵育lh，1:2000稀釋的羊抗鼠IgG 二抗(北京中杉公司)和ECL發光試劑盒(美國Pierce公司)曝光於凝膠成像系統(Bio-Rad公司)。
[0057]結果如圖4、圖5所示:PA6抗體與PA63重組蛋白以及PA6抗體與PA83蛋白有特異性結合。
[0058]三細胞保護性試驗
[0059]將被試細胞(J774A.1)培養在含有10%小牛血清(FBS)和1%抗生素(P/S)的DMEM (Dy Lbecco Modified Eagle Medium)培養基中，37°C 5% 二氧化碳條件下培養。待細胞培養良好後轉種在96微孔細胞培養板上，過夜培養當細胞生長在96微孔細胞培養板上達70%時，無菌條件下按不同劑量加按比例稀釋好的炭疽致死毒素(ΡΑ:0.1 μ g/mL，LF: 10 μ g/mL)和PA6抗體(50 μ g/mL),繼續培養3小時，顯微鏡下觀察細胞死亡情況並照相，然後加 Cell Titer96aqueous nonradioactive cell Proliferation assay(PromegaMI)檢查LDH，計算分析細胞死亡百分數，實驗重複三次。
[0060]結果見圖5所示:PA6的保護率高，在LFlO μ g/mL的時候保護率仍能達到80%以上。
[0061]實施例2hmPA6抗體的製備
[0062]經上述鼠源單抗的檢測，我們選擇PA6雜交瘤細胞株製備人鼠嵌合抗體hmPA6。
[0063]1)抗體可變區基因片段的擴增及驗證:
[0064]PA6抗體雜交瘤細胞培養至對數生長期，Trizol-氯仿-異丙醇法抽提細胞總RNA ；將乾燥後的細胞總RNA溶於20yL水中，測定0D260/0D280，值為1.9。取14yL的RNA進行逆轉錄，以總RNA中的mRNA為模板，以OligodT15為引物，反轉錄擴增獲得單鏈cDNA。
[0065]設計19條VH上遊引物和17條Vk上遊引物，4條VH下遊引物和3條V k下遊引物引物:
[0066]Vk 5』上遊引物:
[0067]
【權利要求】
1.抗炭疽保護性抗原(ProtectiveAntigen, PA)的雜交瘤細胞株PA6。
2.抗PA單克隆抗體PA6，由權利要求1所述雜交瘤細胞株PA6產生。
3.一種含有權利要求2所述抗體重、輕鏈可變區的抗PA的人鼠嵌合單克隆抗體，其特徵在於，所述單克隆抗體的重鏈可變區具有SEQ ID N0:2的胺基酸序列，輕鏈可變區具有SEQ ID NO:4的胺基酸序列。
4.根據權利要求3所述的人鼠嵌合單克隆抗體，其特徵在於，所述單克隆抗體的重鏈恆定區具有SEQ ID NO:6的胺基酸序列，輕鏈恆定區具有SEQ ID NO:8的胺基酸序列。
5.編碼權利要求3所述人鼠嵌合單克隆抗體的核酸序列，其特徵在於，所述重鏈可變區具有SEQ ID NO:1的DNA序列，輕鏈可變區具有SEQ ID NO: 3的DNA序列。
6.編碼權利要求4所述人鼠嵌合單克隆抗體的核酸序列，其特徵在於，所述重鏈恆定區具有SEQ ID NO: 5的DNA序列，輕鏈恆定區具有SEQ ID NO: 7的DNA序列。
7.一種含有編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈的核苷酸編碼的表達載體，其特徵在於重鏈可變區具有SEQ ID NO:1的DNA序列，輕鏈可變區具有SEQ ID NO: 3的DNA序列，重鏈恆定區具有SEQ ID NO: 5的DNA序列，輕鏈恆定區具有SEQ ID NO: 7的DNA序列。
8.根據權利要求7所述的表達載體，其特徵在於，所述載體為抗體IgGl亞型分泌型真核表達載體。
9.一種含有權 利要求8所述的表達載體的宿主細胞，宿主細胞為FreeStyle ? 293-Fcellso
10.權利要求2~4任一所述的單克隆抗體在製備治療炭疽病藥物中的應用。
【文檔編號】C12N5/10GK103789270SQ201410023684
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月20日 優先權日:2014年1月20日
【發明者】朱進, 熊四平, 唐奇, 馮振卿 申請人:中國人民解放軍南京軍區軍事醫學研究所, 南京醫科大學