反式二苯乙烯衍生物在預防或治療肝纖維化中的用途的製作方法

2023-07-10 05:04:21 1

專利名稱：反式二苯乙烯衍生物在預防或治療肝纖維化中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及反式二苯乙烯衍生物在預防或治療與肝纖維化有關疾病的新用途及含反式二苯乙烯衍生物的藥物組合物。
肝纖維化是肝硬化的早期，是眾多肝病纏綿難愈甚至惡變死亡的主要原因，也是阻止慢性肝病發展的關鍵環節。在我國導致肝纖維化的主要原因是感染肝炎病毒。據報導國內B型肝炎病毒的感染率為42.4～80.77％，最近幾年，由丙型、戊型、庚型等肝炎病毒引起肝炎的病例報導逐漸增多。由於由肝炎病毒引起的肝臟損傷缺乏有效的根除方法，常會緩慢發展成肝纖維化，最後發生肝硬化。可見由肝炎病毒感染導致肝纖維化的危害性。除肝炎病毒感染外，寄生蟲感染、酒精、營養不良和輻射等均可導致肝纖維化。如在我國有飲白酒的習慣，酒精性肝纖維化病例比較多見。近幾十年來人們一直在尋找治療和/或預防肝纖維化的藥物，並已開發出了一些治療肝纖維化的藥物，化學藥物有秋水仙鹼和氧化苦參鹼等；中藥有丹參注射液、軟肝片等；生物製品有幹擾素、促肝細胞生長素等。但這些藥物由於副作用或使用效果不佳等原因，未達到令人滿意的治療效果。因此，研究和開發新型抗肝纖維化的藥物十分需要。據國內外文獻報導，二苯乙烯類化合物具有抗血小板聚集和抗腫瘤等作用。
本發明的目的是提供一類新的預防或治療肝纖維化藥物，其具有優良的療效。
本發明人經過廣泛深入的研究，在篩選抗肝損傷的藥物過程中出人意料地發現反式二苯乙烯衍生物對肝炎病毒和酒精等引起的慢性肝病，尤其是肝纖維化有明顯的預防和治療作用。本發明基於上述發現得以完成。
本發明第一個目的涉及式I的反式三羥基二苯乙烯在製備用於預防或治療與肝纖維化有關疾病的藥物中用途。 本發明的第二個目的涉及式II新的反式二苯乙烯衍生物。 R1-R5、和R』1-R』7可相同或不同，分別為H、OH和甲氧基(OMe)。條件是R2、R4和R』3不能同時為OH。
本發明再一個目的涉及含式I或式II化合物及藥用載體或賦形劑或添加劑的藥物組合物，該藥物組合物具有抗肝纖維化作用。根據本發明，該藥物組合物中可加入有各種藥用賦形劑、添加劑及載體。
根據本發明，本發明的式I或式II化合物或含式I或式II化合物的藥物組合物可用於各種原因引起的肝纖維化。
根據本發明，本發明的藥物組合物可按本領域已知方法配成腸道或非腸道給藥的製劑，如片劑、膠囊、粒劑、注射液等。
根據本發明，本發明的式I或式II化合物，主要來自植物，如決明子。其中式II化合物可通過半合成法對式I化合物進行化學修飾或將其作為中間體合成得到。
根據本發明，反式三羥基二苯乙烯可從豆科植物決明子提取得到，該方法包括決明子先用50％甲醇水溶液提取，過濾後濾液真空乾燥，所得醇提液再用乙酸乙脂萃取，有機相真空乾燥後上矽膠柱梯度，洗脫液為氯仿∶甲醇。收集的組份進一步用HPLC處理，得到單體反式三羥基二苯乙烯。
下面將通過反式三羥基二苯乙烯(以下簡稱為化合物A)製備、反式二苯乙烯衍生物(2，3，4-三甲氧基二苯乙烯)的製備和在動物體內的抗纖維化作用來進一步闡明本發明。實施例1化合物A的製備決明子1.0kg，粉碎後室溫下用50％甲醇水溶液浸提三次，每次3天。濾液合併過濾後真空乾燥，得醇提取物100g，再用乙酸乙脂萃取三次(500ml/次)，有機相合併後真空乾燥後得膏狀物30.0g。膏狀物再經矽膠柱層析，梯度洗脫，洗脫液為氯仿∶甲醇(50∶1～10∶1)。得10個組分，組分5(3.0g)進一步用C18柱HPLC分離，得到單體(100mg)。與標準品光譜比較確定為反式三羥基二苯乙烯。實施例2反式二苯乙烯衍生物(2，3，4-三甲氧基二苯乙烯)的製備反應式如下
以甲氧基鈉為鹼，在DMF中經化合物B(可從市售獲得)與化合物C(可從市售獲得)反應可得到反式三甲氧基二苯乙烯的衍生物。用10ml乾燥的DMF溶解B(12mmol)，0℃條件加入到磁力攪拌器攪拌下的0.65g甲醇鈉(溶解於10ml乾燥的DMF中)，攪拌30min。用10ml乾燥的DMF溶解苯甲醛(10mmol)，在0℃條件加入到上述反應體系中。反應體系放置於室溫1.5小時，再在1小時內加熱至95～100℃，在室溫下過夜。反應物在碎冰中降溫，沉澱過濾，水洗後乾燥，乙酸乙脂-己烷中結晶，析出2，3，4-三甲氧基二苯乙烯(2.34g)。溶點79-82℃，IR(KBr)cm-13020，3000，2940，2840，1600，1510，1470，1420，1300，1260，1230，1090，1030，1000，980；1H NMR(CDCl3)δ7.60-7.50(m，2H)，7.40-7.20(m，5H)，6.90(d，J＝16.5HZ，1H)，6.70(d，J＝16.5HZ，1H)，3.91(s，3H)，3.90(s，3H)，3.89(s，3H)；CIMSm/z271(MH+，100)，C17H18O3。實施例3化合物A在動物體內的抗肝纖維化作用1藥物和動物1.1受試藥物藥物名稱反式三羥基二苯乙烯(化合物A)。
配製方法用0.1％羧甲基纖維素鈉混勻懸浮。
保存條件4℃保存。1.2動物動物來源、品種、合格證採用軍事醫學科學院實驗動物中心繁殖的Wistar大鼠，動物合格證編號為醫動字01-3039。
體 重120-140g。
性 別雌雄各半，雌性動物無懷孕。
飼養條件共100隻大鼠領取動物進入實驗室後，適應性飼養1周，每籠1隻，飼以軍事醫學科學院實驗動物中心為大鼠製作的標準飼料，每天上下午定時飼食一次，自由飲水。實驗室定時通風，光照良好，自然室溫。動物實驗條件合格證編號為醫動字第01-2050。2肝纖維化模型與給藥方案2.1大鼠肝纖維化模型依據文獻資料，採用複合因素造模法。造模動物於實驗第1天皮下注射40％CCl4液體石蠟溶液5ml/kg，以後每周兩次皮下注射上述液體3ml/kg。配以高脂低蛋白食物，即以玉米面為飼料，加0.5％膽固醇，加20％的豬油。10％的酒精為飲用水。共6周。將上述造模動物分組並給予受試藥物後各組動物均給以正常飼料。2.2劑量設置及分組於造模開始第43天，分別從造模動物中隨機取3隻動物和正常對照中取3隻。觀察血清肝功能指標和病理組織學檢查，確認造模動物進入明顯的肝纖維化狀態。根據動物的一般狀態和體重均衡的原則，隨機分成4組模型對照組、化合物A的三個劑量組。每組10隻動物。另設正常對照組。
根據預試驗資料，化合物A設小劑量為10mg/kg，中劑量為30mg/kg，大劑量為90mg/kg。2.3給藥方法和時間分組後當天開始，採用灌服給藥途徑，每100g體重為0.3ml。給藥時間為30天。3觀測指標3.1血清肝纖維化相關指標血清III型前膠原(PCIII)，採用放免試劑盒方法。肝組織羥脯氨酸(Hyp)水平採用氯胺T法檢測。方法簡述如下將稱量後的肝組織剪碎，置於磨口試管中用6mol/L HCl水解(125℃)3小時後，稀釋到10ml，過濾。取濾液0.1ml加蒸餾水到1.0ml，充分氧化，加入0.5ml檸檬酸緩衝液和1.0ml氯胺T溶液(0.01mol/L)後6分鐘，用過氯酸終止反應。加入10％p-DMAB1.0ml，於80℃水浴中保溫6分鐘，顯色完全後冷卻，最後在波長560nm處比色，測吸光度(A)，用下式計算Hyp含量肝組織Hyp含量(mg/g)＝(0.5×A樣品/A標準)/肝重量。3.2肝組織病理學檢查肝大體形態和肝組織HE染色和膠原纖維染色(Masson氏三合染色)後光鏡下檢查。大體觀察內容有是否腫大、顏色、表面、邊緣、質地等。取三塊肝組織置10％中性福馬林固定，石蠟包埋切片，染色後光鏡下檢查。HE染色後檢查包括肝小葉結構、纖維增生情況以及間隔是否形成和匯管區是否擴大、肝細胞索排列、肝細胞變性和壞死、間質炎細胞浸潤和肝細胞再生情況，纖維化程度分級(0-4級)打分。肝組織內膠原纖維定量分析採用Quantimet970圖像分析儀進行，測定有單位目標面積、面密度和積分光密度。4統計與分析各組結果用算術平均數±標準差表示。根據《新藥(西藥)臨床前研究指導原則彙編》的有關新藥藥效研究中統計處理的指導原則，計數資料用Fisher精確檢驗，計量資料選擇方差分析，用Student t檢驗進行各組均數差異顯著性檢驗。5試驗結果5.1肝纖維化模型的形成大鼠皮下注射含40％CCl4的液體石蠟後，餵飼高脂低蛋白食物以及飲含10％酒精的水後，第1周大鼠即出現活動減少，食慾減退，表現為所剩飼料和水增多。第2周動物體毛失去光澤。第3周體毛蓬鬆明顯，活動少，剩餘飼料和水較多，有6隻動物死亡。第4周死亡動物8隻。至第6周共有20隻大鼠死亡。
從同批正常動物和飼以特製飼料的造模型動物中各隨機取3隻，肝組織切片觀察發現，造模動物肝細胞脂肪變性、腫脹和壞死等明顯，匯管區有大量纖維組織增生，呈帶狀。結果表明，造模動物已進入明顯的肝纖維化狀態。5.2血清III型前膠原、肝組織羥脯氨酸給藥1月後，用藥組大鼠血清中III型前膠原水平明顯降低，其中以受試藥大劑量組最為顯著(表1)。肝組織中羥脯氨酸水平可反映膠原纖維的代謝狀況。給藥後大鼠肝臟中Hyp水平下降，其中以大劑量組的效果最明顯。
表1灌服化合物A後大鼠PCIII和Hyp水平的變化組 別 PCIII(μg/L) Hyp(mg/g)正常對照組 80.56±15.22### 0.15±0.04###模型對照組 173.61±12.89 0.61±0.13化合物A 10mg/kg 162.00±9.59* 0.57±0.18化合物A 30mg/kg 150.21±7.30*** 0.55±0.09化合物A 90mg/kg 109.20±3.32*** 0.44±0.08**注正常對照組與模型對照組比較，###P＜0.001用藥組與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.0 1，***P＜0.0015.3肝臟膠原纖維的圖象分析為客觀評價受試藥對大鼠肝纖維程度的影響，採用計算機圖像分析儀器計算肝組織中膠原纖維所佔面積。結果從表2可見，與模型對照組比較，用藥組大鼠肝組織單位目標面積減少，面密度和積分光密度降低，尤其是受試藥大劑量組的積分光密度下降明顯，結果說明用藥組大鼠肝組織內膠原纖維面積減少。
表2灌服化合物A後大鼠肝膠原纖維病理圖像分析結果組 別單位目標面積(μm2/個) 面密度 積分光密度正常對照組26.50±12.47## 0.01342±0.00626###5.15±2.51##模型對照組60.61±25.94 0.04463±0.01639 3.56±9.78化合物A 10mg/kg 41.61±13.68 0.02632±0.00700** 14.78±8.72化合物A 30mg/kg 41.45±20.51 0.02737±0.01308* 13.68±6.96化合物A 90mg/kg 37.55±22.46 0.02547±0.00668***11.89±7.59*注正常對照組與模型對照組比較，##P＜0.01，###P＜0.001用藥組與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0015.4病理組織學檢查於給藥1月麻醉大鼠取肝臟組織塊，固定和常規H.E.染色。經光鏡觀察並按孫克偉所報導的肝纖維化分級標準(分為0、1、2、3四級)，對各肝臟形態打分結果如下正常對照組所有10隻動物肝臟均未見門脈區有纖維組織增生。打分結果雄0、0、0、0、0；雌0、0、0、0、0；平均0分。
模型對照組雌、雄鼠各有1隻其門脈區增生的纖維組織已向邊緣延伸，但尚未在肝小葉周圍尚未形成完整的纖維組織包繞外，其餘各鼠均已形成明顯的包繞。打分結果雄3、3、3、3和2；雌3、3、3、3和2；平均2.8分。
小劑量組雄、雌性鼠各有1隻肝小葉周圍尚未形成完整的纖維組織包繞，另1隻雄鼠門脈區增生的纖維組織甚至尚未向小葉周圍延伸，其餘各鼠肝小葉周圍均已形成完整的纖維組織包繞。打分結果雄3、3、3、2和1；雌3、3、3、3和2；平均2.6分。
中劑量組有2隻雄鼠及3隻雌鼠肝小葉周圍尚未形成完整的纖維組織包繞，另有雌、雄各1隻鼠門脈區增生的纖維組織尚未向肝小葉周圍延伸。其餘3隻鼠肝小葉周圍已有完整的纖維組織包繞。打分結果雄3、3、2、2和1；雌3、2、2、2和1；平均2.1分。
大劑量組有2隻雄鼠及3隻雌鼠肝小葉周圍尚未形成完整的纖維組織包繞，另有雄、雌各1隻鼠門脈區增生的纖維組織尚未向肝小葉周圍延伸，其餘3隻鼠肝小葉周圍已有完整的纖維組織包繞。打分結果雄3、3、2、2和1；雌3、2、2、3和1；平均2.1分。
結果發現，化合物A各劑量組對治療肝纖維化均有抑制及減輕作用，其中中劑量和大劑量組效果明顯。
表3灌服化合物A後大鼠肝組織纖維化程度組 別 動物數 纖維化程度(分數)正常對照組 10 0模型對照組 10 2.8±0.4化合物A 10mg/kg10 2.6±0.7化合物A 30mg/kg10 2.1±0.7*化合物A 90mg/kg10 2.1±0.7*陽性藥組 10 2.2±0.6*注用藥組與模型對照組比較，*P＜0.056結論上述結果表明，受試藥化合物A對肝纖維化有明顯的抑制及減輕作用。
權利要求
1.下式的反式三羥基二苯乙烯在製備用於預防或治療與肝纖維化有關疾病的藥物中的用途。
2.下式的反式二苯乙烯衍生物 其中R1-R5、和R』1-R』7可相同或不同，分別為H、OH和甲氧基(OMe)。條件是R2、R4和R』3不能同時為OH。
3.一種用於預防或治療與肝纖維化有關疾病的藥物組合物，其包括作為活性成份的權利要求1的反式三羥基二苯乙烯或權利要求2所要求的反式二苯乙烯衍生物及藥用賦形劑或載體。
4.根據權利要求3的藥物組合物，其中作為活性成份的權利要求1的反式三羥基二苯乙烯或下式的反式3，4』，5三羥基二苯乙烯。
5.權利要求2的反式二苯乙烯衍生物在製備用於預防或治療各種原因引起的肝纖維化疾病的藥物中用途。
6.權利要求3的藥物組合物，其中所述藥物組合物可被製成片劑、膠囊、注射液或其它適宜劑型。
全文摘要
本發明涉及反式三羥基二苯乙烯在預防或治療與肝纖維化有關疾病上的新用途，新的反式二苯乙烯衍生物及含反式三羥基二苯乙烯或新反式二苯乙烯衍生物的藥物組合物。
文檔編號A61K31/09GK1401316SQ0112456
公開日2003年3月12日 申請日期2001年8月10日 優先權日2001年8月10日
發明者呂秋軍, 郭紹明, 溫利青, 董俊興 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所