一種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑及其製備方法和應用的製作方法

2023-08-01 11:59:26

一種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】一種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，該試劑為應用膠乳增強免疫比濁法的檢測試劑，由試劑1、試劑2和馮維勒布蘭德因子標準品或標準曲線組成，其中試劑1為抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑為抗馮維勒布蘭德因子與膠乳顆粒結合而成的抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑；試劑2為應用液；馮維勒布蘭德因子標準品為含有不同濃度的馮維勒布蘭德因子的反應緩衝液；標準曲線為馮維勒布蘭德因子在人體內含量的標準曲線。相較現有技術，本發明的目的是提供一種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，以實現快速檢測馮維勒布蘭德因子，且具有很高的靈敏度和可靠的重複性，並應用在自動化分析儀器上。
【專利說明】—種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑及其製備方法和應
用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物檢測【技術領域】，具體涉及一種檢測人血清中馮維勒布蘭德因子(vffF, von Willebrand Factor)的試劑盒及其製備方法。
【背景技術】
[0002]馮維勒布蘭德因子(vWF，von Willebrand Factor)，又稱血管性血友病因子，是由第12號染色體上的vWF基因編碼，是一種大分子量的多亞基糖蛋白，由多個220kD的亞基組成。終產物的聚合度不一，分子量最高者可高達20MD。組裝完成後儲存於血小板的a顆粒、血管內皮的Weibel-Palade小體中；其是存在於血液中的一種多功能多價的大型粘附糖蛋白。vWF因子在止血和血栓形成過程中具有極其重要的生理作用:一方面，調節介導血小板粘附反應，並且通過與血小板上的受體和膠原蛋白的結合來調節血小板在血管內皮上的粘附，主要過程是:血管內皮受損一暴露膠原纖維一VffF因子連接膠原纖維一血小板表面糖蛋白I b受體結合vWF因子從而粘附在受損血管上，本功能主要由大分子量的多聚體完成；另一方面，還可與VIII (FVIII)的載體蛋白(VIII因子)非共價結合，從而保護VIII因子免於遭受包括活化的蛋白C在內的蛋白酶的攻擊，防止VIII因子被過早清除，正常的止血過程就不會因VIII因子受酶切而異常。因此，血液中正常的馮維勒布蘭德因子是極為關鍵的，其水平的降低和功能的缺失則會導致血凝功能相關的疾病發生，此類疾病都是由於止血和血栓形成過程異常造成的；其中最常見的是馮維勒布蘭德病和血友病，其中因vffF因子所致的血友病為最常見的血友病，國外報導的患病率高達I %?3%。所以，檢測血液中馮維勒布蘭德因子的含量至關重要，能夠提供對於上述疾病診斷和治療的關鍵性參考數據。
[0003]此外，隨著近年來科研的發展，馮維勒布蘭德因子的一些其他功能逐漸被人們所了解。它在血管生成，平滑肌細胞的增殖，癌細胞的擴散，以及免疫過程中都具有一定的調控作用。因此，它在一些心血管疾病，癌症，肝病和免疫疾病中可以被用作生物標記物來加以研究和使用。總之，檢測血液中馮維勒布蘭德因子的含量不僅在與止血和血栓形成過程有關的疾病，而且在其他很多疾病的診斷和治療中都有很高的價值。
[0004]現有技術中，檢測馮維勒布蘭德因子的方法有多種，例如:馮維勒布蘭德因子多聚體法是將樣品用瓊脂膠來分離從而判斷多聚體是否正常；酶聯免疫法(ELISA)是用包被在塑料板表面的抗體與樣品中的抗原結合從而檢測馮維勒布蘭德因子的含量；膠原蛋白法與酶聯免疫法類似，只不過包被在塑料板表面的不是抗體，而是膠原蛋白，此法利用馮維勒布蘭德因子和膠原蛋白可以天然高效結合的特點來進行它的檢測。其中，酶聯免疫法主要用來檢測馮維勒布蘭德因子的含量，而多聚體法和膠原蛋白法還可在一定程度上檢測其活性。
[0005]以上檢測方法各具特點，而它們共同的最大的局限是不能應用於實驗室自動分析檢測儀器如自動血凝儀上，無法進行大量快速且具有高度重複性的檢測。多聚體法需手工製備瓊脂膠，而整個實驗的時間也較長。酶聯免疫法和膠原蛋白法由於包被在塑料板表面時效率的不同導致實驗的重複性不好。
[0006]膠乳免疫比濁法具有操作簡便、快速、檢測靈敏度高、特異、定量準確等優點，在臨床應用上得到廣泛認可。
[0007]早期免疫分析通過觀察沉澱物形成，凝集及溶血現象發生來分析，如免疫擴散、免疫電泳、血凝試驗、補體結合等。上世紀50年代末60年代初，利用AG-AB複合物形成使濁度改變，再用比濁計來比濁，但因其敏感性差未被接受。至70年代初，開始有自動檢測系統，但因其用的是雷射為光源，固定波長，靈敏度較低，而且時間一般要2-3小時，很難滿足臨床需要。70年代未，速率比濁計的出現，使抗原抗體結合的反應在幾十秒內出結果，可以說是免疫化學測定的革命性的發展。
[0008]隨著標記技術的發展，免疫化學納入臨床化學檢驗範疇。免疫濁度測定的基本原理是:抗原抗體在特殊緩衝液中快速形成抗原抗體複合物，使反應液出現濁度。當反應液中保持抗體過量時，形成的複合物隨抗原量增加而增加，反應液的濁度亦隨之增加，與一系列的標準品對照，即可計算出受檢物的含量。
[0009]免疫濁度測定法按照儀器設計的不同可以分為兩種，即比濁儀測定(turbidimetermeasure)和散射比池儀測定(nephelomitermeasure)。比池儀測定是測量由於反射、吸收或散射引起的入射光衰減，其讀數以吸光度A表示。A反映了入射光與透射光的比率。散射比濁儀測定是測量入射光遇到質點(複合物)後呈一定角度散射的光量，該散射光經放大後以散射值表示。
[0010]經典的比濁試驗有4個缺點無法克服，即操作繁瑣、敏感度低(10?100 Ug /ml)、時間長和難以自動化。根據抗原與抗體能在液體內快速結合的原理，70年代出現了微量免疫沉澱測定法，即膠乳增強免疫透射比濁法(PETIA)和免疫散射濁度測定法。這2種技術皆已常規用於臨床體液蛋白的檢測，並已創造出了多種自動化儀器。
[0011]一、傳統免疫透射比濁法
[0012]當光線通過一個渾濁介質溶液時，由於溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法早在1959年Schultre和Schuick等報導應用於血楽;蛋白與其抗體結合後形成複合物，導致濁度的改變，再進行透射比濁測定，一般採用抗體對抗原定量的透射比濁法，稱為免疫透射比濁法。其原理是，利用抗原和抗體的特異性結合形成複合物，通過測定複合物形成量的多少對抗原或抗體進行定量的方法。
[0013]由於免疫複合物的形成有時限變化，當抗原抗體相遇後立即結合成小複合物(〈19S)，幾分鐘到幾小時才形成可見的複合物(>19S)。作為快速比濁測定，這種速度太慢，加入聚合劑(或促聚劑)可加速大的免疫複合物形成。目前促聚劑多用聚乙二醇(MW6000 ?8000)，濃度約為 4%。
[0014]濁度測定亦有其弱點。其一是抗原或抗體量大大過剩時易出現可溶性複合物，造成測定誤差，測定單克隆蛋白時這種更易出現；其二是應維持反應管中抗體蛋白量始終過剩，這個值要預先測定，使儀器的測定範圍在低於生理範圍到高於正常範圍之間；其三是受血脂的影響，尤其是低稀釋度時，脂蛋白的小顆粒可形成濁度，使測定值假性升高。
[0015]二、膠乳增強免疫透射比濁法[0016]在上述比濁法中，少量的小的抗原抗體複合物極難形成濁度，除非放置較長時間；如形成較大的複合物，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化的要求。於是發展了現在廣泛應用於生化分析儀的膠乳增強免疫透射比濁法(PETIA):以多克隆抗體為基礎的改良免疫比濁分析法，利用基因工程方法將抗體與膠乳顆粒結合，當抗原抗體相結合時便形成了抗原-抗體-膠乳顆粒複合物，增強了反應吸光度，反應液在一定波長處比濁，與同樣處理的標準液比較，計算標本中抗原的含量。利用生化分析儀進行比濁測定，整個分析過程只需幾分鐘，該方法與傳統免疫比濁法比較其靈敏度更高。
[0017]在抗原抗體特異性反應時，生成結合物的量與反應物的濃度有關。無論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均可發現只有在兩者分子比例合適時才出現最強的反應。以沉澱反應為例，若向一排試管中入一定量的抗體，然後依次向各管中加入遞增量的相應可溶性抗原，根據所形成的沉澱物及抗原抗體的比例關係可繪製出反應曲線(如圖1所示)。從圖中可見，曲線的高峰部分是抗原抗體分子比例合適的範圍，稱為抗原抗體反應的等價帶(zone of equivalence)。在此範圍內，抗原抗體充分結合，沉澱物形成快而多。其中有一支反應最快，沉澱物形成最多，上清液中幾乎無游離抗原或抗體存在，表明抗原與抗體濃度的比例最為合適，稱為最適比(optimal ratio)。在等價帶前後分別為抗體過剩則無沉澱物形成，這種現象稱為帶現象(zone phenomenon)。出現在抗體過量時，稱為前帶(prozone),出現在抗原過剩時,稱為後帶(postzone)具體見圖1o
[0018]但現有技術中，應用膠乳增強免疫透射比濁法來檢測馮維勒布蘭德因子的試劑盒具有一定缺陷。主要是檢測的線性範圍較小，給檢測過程帶來很多不便。

【發明內容】

[0019]針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的之一是提供一種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑盒，以實現快速檢測馮維勒布蘭德因子，且具有很高的靈敏度和可靠的重複性，並且可應用在自動化分析儀器上。
[0020]為實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下:
[0021]一種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，該試劑為應用膠乳增強免疫比濁法的檢測試劑，由試劑I和試劑2組成；其中試劑I為抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑為抗馮維勒布蘭德因子與膠乳顆粒結合而成的抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑；試劑2為應用液。
[0022]優選地，該試劑還進一步包括馮維勒布蘭德因子標準品或標準曲線；馮維勒布蘭德因子標準品為含有不同濃度的馮維勒布蘭德因子的反應緩衝液；標準曲線為馮維勒布蘭德因子在人體內含量的標準曲線。
[0023]優選地，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑是通過將抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基與膠乳顆粒的羧基經二步反應後形成共價鍵而得到；所述二步反應包括:第一步將膠乳顆粒先與結合劑反應，第二步再將膠乳顆粒與抗馮維勒布蘭德因子抗體反應。而現有技術中均是採用一步反應則是將膠乳顆粒和結合劑以及抗馮維勒布蘭德因子抗體同時在一起反應。
[0024]更優選地，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑是通過將抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基與膠乳顆粒的羧基經二步反應後形成共價鍵而得到；首先由將膠乳顆粒的羧基與結合劑在弱酸性下反應成膠乳顆粒-結合劑中間體，再將膠乳顆粒-結合劑中間體在弱鹼性下與抗馮維勒布蘭德因子抗體氨基反應製得抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳試劑。而現有技術中均是採用一步反應則是將膠乳顆粒和結合劑以及抗馮維勒布蘭德因子抗體同時在一起反應，該反應難進行且產率低。而本發明提供的二步反應解決了本領域中膠乳顆粒與抗馮維勒布蘭德因子抗體難以反應成膠乳抗體顆粒這一難題，且反應產率高，易於操作，而且產物更加穩定均一。
[0025]更優選地，膠乳顆粒選自苯乙烯膠乳顆粒，最佳為經羧基修飾的苯乙烯乳膠顆粒。
[0026]更優選地，膠乳顆粒的粒徑為200?lOOOnm。
[0027]更優選地，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑通過將膠乳顆粒懸浮於活化緩衝液中與結合劑反應後，再轉入結合緩衝液中加入抗馮維勒布蘭德因子抗體進行二步反應形成共價鍵而得。
[0028]更優選地，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑通過將膠乳顆粒懸浮於活化緩衝液中與結合劑反應後，再轉入結合緩衝液中加入抗馮維勒布蘭德因子抗體進行二步反應，再加入含有封閉劑的滅活液中反應後加入保存緩存液去除未經反應的膠乳顆粒而得。
[0029]更優選地，活化緩衝液選自甘氨酸緩衝液或磷酸緩衝液，最佳為濃度為0.05M的KH2PO4，其pH為4.5。其酸性的pH是為了保證羧基處於羧基配位穩定狀態，更有利於二步反應的進行。
[0030]更優選地,結合劑選自濃度為0.1?5%的碳二亞胺,最佳為I %碳二亞胺；用於與膠乳顆粒的羧基形成中間體，進而與抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基進行反應形成共價鍵。
[0031]更優選地，結合緩衝液選自三羥甲基氨基甲烷緩衝液或硼酸緩衝液，最佳為0.2M硼酸緩衝液，且pH為8.5 ;其弱鹼性的pH是為了保證氨基處於氨基配位穩定狀態，將更有利於二步反應的進行。
[0032]更優選地，抗馮維勒布蘭德因子抗體選自羊抗、鼠抗或兔抗馮維勒布蘭德因子抗體。
[0033]更優選地，封閉劑選自血清白蛋白或卵清蛋白，濃度為0.1%?5%，最佳為1%牛血清白蛋白；封閉劑用於吸附在未結合抗體的膠乳顆粒表面，而降低檢測過程中的非特異性反應。
[0034]更優選地，滅活液選自乙醇胺或甘氨酸，濃度為5?20mM，最佳為IOmM甘氨酸；用於中和反應中過量的活性中間體。
[0035]更優選地，保存緩衝液選自甘氨酸緩衝液，硼酸緩衝液或磷酸緩衝液，最佳由濃度為0.1M pH8.0甘氨酸，濃度分別為0.2%疊氮鈉、0.2%牛血清白蛋白和0.05%吐溫-20組成。
[0036]優選地，應用液按質量百分比由表面活性劑0.05%?0.5 %、防腐劑0.05%?I %、高分子加速劑0.01 %?5 %、和濃度為0.1 %?10 %的氯化鈉組成，上述各組分的質量百分比之和為100%。
[0037]更優選地，表面活性劑選自吐溫-20或Triton-XlOO，最佳為吐溫-20 ;防腐劑選自Proclin300或疊氮鈉，最佳為疊氮鈉，高分子加速劑選自牛血清白蛋白或卵清蛋白，緩衝劑選自三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽或甘氨酸，最佳為三羥甲基氨基甲烷。
[0038]優選地，含有不同濃度的馮維勒布蘭德因子的反應緩衝液選自PBS緩衝液、Hepes緩衝液、甘氨酸緩衝液、硼酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液或氯化銨緩衝液中的一種或以上組合物；反應緩衝液優選為PBS緩衝液、Hepes緩衝液、甘氨酸緩衝液中的一種或以上組合物。
[0039]更優選地，反應緩衝液的濃度為20?200mM。
[0040]本發明的另一目的是提供一種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑的應用，即將上述任一用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑作為檢測試劑用於製備馮維勒布蘭德因子檢測試劑盒，試劑盒其包括盒體和上述任一檢測試劑的試劑瓶。
[0041]優選地，試劑瓶放置與盒體內。
[0042]本發明的另一目的是提供一種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑的製備方法，包括以下步驟:
[0043]步驟a)製備抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳:將抗馮維勒布蘭德因子抗體與膠乳顆粒經二步反應後交聯成抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳；
[0044]步驟b)製備應用液或稀釋液。
[0045]優選地，步驟a)的具體操作如下:將膠乳顆粒用純淨水清洗後懸浮於活化緩衝液中；加入結合劑在溫度小於50°C下攪拌反應，從而活化膠乳顆粒；再加入抗馮維勒布蘭德因子抗體在結合緩衝液中在溫度小於50度下攪拌反應；再懸浮於含有封閉劑的滅活液中反應，經清洗後懸浮於保存緩衝液中，得抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳懸液，置於4°C環境放置。
[0046]更優選地，步驟a)中攪拌反應溫度優選為室溫，最佳為18?25V。
[0047]更優選地，步驟a)中加入結合劑後攪拌反應時間為10?30分鐘，最佳為15分鐘；
[0048]更優選地，步驟a)中在結合緩衝液中攪拌反應時間為0.5?6小時，優選為I?2小時，最佳為2小時。
[0049]更優選地,步驟a)中懸浮於含有封閉劑的滅活液中反應I?3小時,最佳為I小時。
[0050]優選地，步驟b)製備應用液是將表面活性劑、防腐劑、高分子加速劑、氯化鈉和緩衝劑一併完全溶解於水中，製得應用液。
[0051]更優選地，步驟b)的具體操作如下:將緩衝劑用鹽酸調節至pH值為8.0,再加入表面活性劑、防腐劑、高分子加速劑和氯化鈉。
[0052]更優選地，步驟b)中應用液pH值為7.4?8.0，最佳為8.0 ;表面活性劑所佔的質量百分比為0.05 %?0.5 %，最佳為0.05%，防腐劑所佔的質量百分比為0.05 %?I %，最佳為0.2 %，高分子加速劑所佔的質量百分比為0.0I %?5 %，最佳為0.2 %;氯化鈉所佔的質量百分比為0.1%?10%，最佳為1%，緩衝劑的質量百分比為10?IOOmM,最佳為50mM。
[0053]優選地，在未提供馮維勒布蘭德因子在人體內的標準曲線的前提下，該製備方法還包括步驟c)配製馮維勒布蘭德因子標準品。
[0054]更優選地，步驟c)中選用馮維勒布蘭德因子標準品，使用試劑2，即應用液，進行系列稀釋:S7:40 μ g / ml, S6:20 μ g / ml, S5:10 μ g / ml, S4:5 μ g / ml, S3:2.5 μ g /ml, S2:1 μ g / ml, S1:0.5 μ g / ml, SO:應用液，分裝即可。[0055]更優選地，在步驟c)中，馮維勒布蘭德因子標準品可選用商品化高純度馮維勒布蘭德因子標準品。
[0056]更優選地，步驟c)中分裝可採用0.5ml /瓶分裝。
[0057]本發明亦提供了採用該檢測馮維勒布蘭德因子的顆粒增強免疫透射比濁試劑盒在生化分析儀上進行檢測的具體條件:
[0058]在生化分析儀上設定參數:
[0059]反應溫度:37°C ;
[0060]分析方法:2點終點法；
[0061]主波長:570nm,副波長:800nm(可不用)。
[0062]選擇多點定標後，由儀器自動完成定標，然後進行常規血漿樣本的馮維勒布蘭德因子檢測，結果經儀器自動換算直接以Ug / ml為單位報告數值。在使用不同的自動檢測儀(血凝分析儀或生化分析儀)時，具體參數應根據儀器不同進行相應調整。
[0063]本發明首創的將目前逐漸得到廣泛的應用的顆粒增強免疫透射比濁法應用到馮維勒布蘭德因子的檢測中。上述檢測試劑的檢測原理為把交聯了抗體的膠乳顆粒與被檢測血漿樣品混合，血漿中含有的多價馮維勒布蘭德因子會因與抗體的結合而導致膠乳顆粒的聚集。引起的聚集則會引起樣品的渾濁和吸光度的變化，其吸光度與馮維勒布蘭德因子的濃度成正比，與同樣處理的校準液比較，可由吸光度推算計算樣本中馮維勒布蘭德因子濃度。本發明採用顆粒增強免疫透射比濁法來檢測馮維勒布蘭德因子；可以避免傳統的酶聯免疫法中抗原和抗體的結合反應是在固相條件下(塑料板反應孔)進行的，二者之一被固定而無法自由移動；而實現抗體和膠乳的反應是在液相條件下進行，反應迅速徹底，更加接近自然狀態，通過顆粒增強的方式，放大了抗原抗體反應，彌補了普通透射比濁法靈敏度不高的不足，同時又繼承了透射比濁法穩定性好、方便快速的優點，克服ELISA和RIA方法操作複雜、重複性不好等的缺點，實現人血馮維勒布蘭德因子在生化儀上大批量快速檢測血馮維勒布蘭德因子水平。
[0064]實驗結果表明本發明提供的且具有以下幾個方面的顯著優點:(I)操作簡單；(2)靈敏度較高；(3)不易受人為操作和外界因素幹擾，檢測穩定性和重複性好，能較真實地反映被測物質的含量；(4)能利用生化分析儀進行檢測，容易實現自動化，適於臨床推廣應用；相比較多聚體法、酶聯免疫法和膠原蛋白法，本發明可以應用在自動血凝儀上，並且具有操作簡便，靈敏度高和重複性好的特點。因此，本發明可用來進行大量和快速的臨床體外檢測，有很好的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0065]圖1為現有技術中膠乳顆粒免疫增強透射比濁法的反應曲線圖。
【具體實施方式】
[0066]下面結合實施例對本發明作進一步詳細完整的說明。如無特殊說明，以下實施例中所用試劑或儀器均為市售產品，並按照其說明書操作使用。
[0067]實施例1
[0068]a)試劑I的製備[0069]試劑I為將表面含有羧基基團的膠乳顆粒在結合劑作用下與抗體的氨基基團反應而得抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑；具體製備方法如下:
[0070]配製0.05M KH2P04pH4.5的活化緩衝液，取粒徑為500nm的羧基修飾的膠乳顆粒用純淨水清洗三遍後懸浮於IOml活化緩衝液中，膠乳顆粒終濃度質量體積百分比以g / ml計為I %。活化緩衝液的酸性PH是為了保證羧基處於羧基配位穩定狀態，這有利於反應的進行。
[0071]再新鮮配製2%碳二亞胺，取IOml加入等體積膠乳顆粒中，在室溫下(18_25°C )攪拌反應15分鐘；從而活化膠乳顆粒。
[0072]配製0.2M硼酸緩衝液pH8.5的結合緩衝液；用純淨水清洗三遍活化的膠乳顆粒，懸浮於IOml結合緩衝液中；然後加入等體積的鼠抗馮維勒布蘭德因子單克隆抗體，在結合緩衝液中在室溫(18-25°C)下攪拌反應2小時，完成二步反應。結合緩衝液的弱鹼性pH是為了保證氨基處於氨基配位穩定狀態，這有利於反應的進行。
[0073]用純淨水清洗三遍膠乳顆粒後懸浮於含有封閉劑的滅活液中反應I小時；其中的封閉劑為1%牛血清白蛋白，是為了吸附在未結合抗體的膠乳顆粒表面，而降低檢測過程中的非特異性反應；滅活液為IOmM甘氨酸，是為了中和掉反應中過量的活性中間體。保存緩衝液為0.1M甘氨酸pH8.0,0.2%疊氮鈉，0.2%牛血清白蛋白和0.05%吐溫-20。清洗後懸浮於保存緩衝液中。
[0074]b)試劑2的製備
[0075]試劑2為應用液，其製備方法為:三羥甲基氨基甲烷(Tris)濃度為50mM，用鹽酸調節後PH值為8.0。再加入如下成分，其終濃度分別為:氯化鈉1%，疊氮鈉0.2%，牛血清白蛋白0.2%和吐溫-200.05%。
[0076]c)配置馮維勒布蘭德因子標準品，使用應用液進行系列稀釋:S7:40μ g / ml，S6:20 μ g / ml, S5:10 μ g / ml, S4:5 μ g / ml, S3:2.5 μ g / ml, S2:1 μ g / ml, S1:0.5 μ g /ml, SO:應用液。
[0077]檢測所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性範圍見如下實驗。
[0078]實施例2
[0079]本實施例與實施例1的差別僅在於所述膠乳顆粒的粒徑為lOOOnm，其他操作及配比與實施例1 一致。
[0080]檢測所得試劑盒的特異性、靈敏度及線性範圍見如下實驗。
[0081]試劑盒的特異性、靈敏度及線性範圍的檢測
[0082]1.在自動檢測儀上的檢測操作程序，具體如下:
[0083](I)新鮮抽取的靜脈血按9:1的比例與枸櫞酸抗凝液混勻後離心，分離得到血漿；
[0084](2)在自動檢測儀上設定參數:反應溫度37°C ;分析方法:2點終點法；主波長:570nm，副波長:800nm;樣品量/試劑I /試劑2:20 μ I / 100 μ I / 100 μ I;反應方向:上升;
[0085](3)選用馮維勒布蘭德因子標準品，使用應用液進行系列稀釋:S7:40μ g / ml,S6:20 μ g / ml, S5:10 μ g / ml, S4:5μ g / ml, S3:2.5μ g / ml, S2:1 μ g / ml, SI:
0.5μ g / ml, SO:應用液。[0086](4)在自動檢測儀中加入不同濃度的標準品，試劑I和試劑2(標準品/試劑I /試劑2:20 ill / IOOiU / IOOu I)並啟始反應。自動檢測儀將自動測量吸光度並製作「濃度-吸光度」標準曲線。
[0087](5)取待測血漿樣品，按上述方法測量吸光度。自動檢測儀將依照「濃度-吸光度」標準曲線將結果經自動換算直接以Ug / ml為單位報告樣本的馮維勒布蘭德因子數值。
[0088](6)在使用不同的自動檢測儀(血凝分析儀或生化分析儀)時，具體參數應根據儀器不同進行相應調整。
[0089]2.試劑盒特異性的檢測
[0090]表1檢測馮維勒布蘭德因子含量方法特異性
【權利要求】
1.一種用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，其特徵在於:所述用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑為應用膠乳增強免疫比濁法的檢測試劑，由試劑I和試劑2組成，其中試劑I為抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑，抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑為抗馮維勒布蘭德因子與膠乳顆粒結合而成的抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑；試劑2為應用液。
2.根據權利要求1所述的用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，其特徵在於:所述用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑還包括馮維勒布蘭德因子標準品或標準曲線；所述馮維勒布蘭德因子標準品為含有不同濃度的馮維勒布蘭德因子的反應緩衝液；標準曲線為馮維勒布蘭德因子在人體內含量的標準曲線。
3.根據權利要求1所述的用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，其特徵在於:所述抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑是通過將抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基與膠乳顆粒的羧基經二步反應後形成共價鍵而得到；所述二步反應包括:第一步將膠乳顆粒先與結合劑反應，第二步再將膠乳顆粒與抗馮維勒布蘭德因子抗體反應。
4.根據權利要求3所述的用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，其特徵在於:所述抗馮維勒布蘭德因子的抗體膠乳試劑是通過將抗馮維勒布蘭德因子的抗體的氨基與膠乳顆粒的羧基經二步反應後形成共價鍵而得到；首先由將膠乳顆粒的羧基與結合劑在弱酸性下反應成膠乳顆粒-結合劑中間體，再將膠乳顆粒-結合劑中間體在弱鹼性下與抗馮維勒布蘭德因子抗體氨基反應製得抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳試劑。
5.根據權利要求1所述的用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，其特徵在於:所述膠乳顆粒為苯乙烯膠乳顆粒。
6.根據權利要求1所述的用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，其特徵在於:所述膠乳顆粒的粒徑為200?lOOOnm。
7.根據權利要求8所述的用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑，其特徵在於:所述結合劑選自濃度為0.1?5%的碳二亞胺。
8.一種製備權利要求1?7任一所述的用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑的方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟a)製備抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳:將抗馮維勒布蘭德因子抗體與膠 乳顆粒經二步反應後交聯成抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳； 步驟b)製備應用液或稀釋液。
9.根據權利要求8所述的製備用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑的方法，其特徵在於，步驟a)的具體操作如下:將膠乳顆粒用純淨水清洗後懸浮於活化緩衝液中；加入結合劑在溫度小於50°C下攪拌反應，從而活化膠乳顆粒；再加入抗馮維勒布蘭德因子抗體在結合緩衝液中在溫度小於50度下攪拌反應；再懸浮於含有封閉劑的滅活液中反應，經清洗後懸浮於保存緩衝液中，得抗馮維勒布蘭德因子抗體膠乳懸液，置於4°C環境放置。
10.一種製備權利要求1?7任一所述的用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑的應用，其特徵在於:將權利要求1?7任一所述的用於檢測馮維勒布蘭德因子的試劑作為檢測試劑用於製備馮維勒布蘭德因子檢測產品。
【文檔編號】G01N33/68GK103760358SQ201310562657
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年11月12日 優先權日:2013年11月12日
【發明者】趙鐵銘, 李小林, 王枕亞, 喜慶 申請人:趙鐵銘, 喜慶