一種基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-lr的方法

2023-07-31 21:31:51 1

專利名稱：：一種基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-lr的方法
技術領域：
：—種基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR(MC-LR)的方法，屬於免疫分析化學
技術領域：
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背景技術：
：隨著經濟的發展，含有大量的氮、磷營養物質的汙水進入湖泊、水庫使水體富營養化，致使藻類異常增殖，釋放次級代謝物藻毒素(AlgaeToxins)，威脅人類的飲用水的安全和水體中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins，MCs)分布最廣、危害最大，其結構如下(6)D-Glu(iso)(7)dehydroAla(l)D-AlaOCOOH(2)variableC3)D-Asp(iso)其含有五個固定成分的胺基酸，兩個可變的胺基酸X、Y。即在上述的結構式中其中X和Y分別為Leu和Arg的即為MC-LR。MC-LR是最為常見且毒性又最大的一種微囊藻毒素，世界衛生組織(WHO)推薦的飲用水中的MC-LR的最大殘留限量為1.0yg/L，我國現頒布執行的生活飲用水水質衛生規範(2001，0.OOlmg/L)和地表水環境質量標準(GB3838-2002,微囊藻毒素-LR，O.001mg/L)，因此急需建立針對MC-LR檢測的一種快速、簡單、靈敏、省力的檢測方法。常用的檢測藻毒素的方法主要有儀器分析方法、生物化學法及免疫檢測法等幾大類。儀器分析方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)、質譜、液質聯用等，這些方法雖然靈敏但其需要昂貴的儀器設備，專業的操作人員，對檢材的要求也比較高，並且需要進一步的樣本前處理才能進行，這已經不能達到現代檢測對快速、方便、準確的要求。生物化學法主要是蛋白磷酸酶抑制試驗法，優點是快速，數小時即可實現對大量樣品的檢測，但其最大的不足之處在於特異性蛋白磷酸酶等沒有商品供應、特異性差。免疫分析化學方法具有快速，靈敏度高，操作簡單，專一性好等優點。
發明內容本發明的目的是提供一種基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素(MC-LR)的方法，靈敏度高，操作方便，線性範圍寬。4本發明的技術方案一種基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，包括包被原的修飾，抗體的修飾，修飾的包被原和金納米棒的偶聯，修飾的抗體和金納米棒的偶聯，反應條件的優化，抑制曲線的測定，實際樣本檢測；(1)包被原的修飾將微囊藻毒素-LR包被原與硫辛酸相偶聯得到修飾的包被原；(2)抗體的修飾將抗微囊藻毒素-LR抗體與硫辛酸相偶聯得到修飾的抗微囊藻毒素-LR抗體；(3)用步驟(1)得到的修飾的包被原與金納米棒的端面偶聯得到金納米棒_包被原探針；(4)用步驟(2)得到的修飾的抗微囊藻毒素-LR抗體與金納米棒的端面偶聯得到金納米棒_抗體探針；(5)對抑制反應的各個條件進行優化；(6)標準曲線的建立利用間接競爭免疫檢測原理，將微囊藻毒素-LR和(3)金納米棒-包被原探針同時加入到一個離心管中，而後向離心管中加入(4)金納米棒-抗體探針，混勻，通過微囊藻毒素-LR和金納米棒_包被原探針與金納米棒_抗體探針進行競爭偶聯，通過微囊藻毒素-LR濃度的不同會使形成的粒子形成不同的粒徑分布，通過納米粒度儀檢測粒徑的變化從而檢測微囊藻毒素-LR的濃度，建立粒徑-微囊藻毒素-LR濃度的標準曲線。(7)檢測樣品中微囊藻毒素-LR的濃度。包被原的修飾①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，與0.2mL的微囊藻毒素-LR包被原溶液混合；②將75iiL的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入步驟①所述溶液中後室溫反應4h;③用pH7.4的磷酸鹽緩衝液透析3天，每天換液3次；④將修飾後的包被原放在4t:備用。抗體的修飾①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，與0.4mL抗微囊藻毒素-LR抗體混合；②將75iiL的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入步驟①所述溶液中後室溫反應4h;③用pH7.4的磷酸鹽緩衝液透析3天，每天換3次透析液；④將修飾後的抗體放在fC備用。金納米棒-抗體探針的製備採用晶種生長法合成金納米棒，再經過7500rpm離心15min去除金納米棒溶液中多餘的Vc、AgN03和小的球形粒子金納米棒後，利用pH3.8、含有0.1%聚乙二醇PEG20000的0.005mol/L十六烷基三甲基溴化銨CTAB溶液進行重懸；重懸液用lmol/LHCl調整至pH3.8;重懸液中的金納米棒稱之為金納米棒GNRs，在金納米棒的製備過程中CTAB起著非常關鍵的作用。CTAB主要是分布在金納米棒的側面從而金納米棒的側面帶有正電荷，而金納米棒的端面的分布很少，因此採用硫辛酸修飾的抗體會修飾到金納米棒的端面而非側面上。0.5mL2nmol/L重分散的金納米棒GNRs溶液逐滴滴加到由50iiL稀釋到lmL的硫酸鋅修飾的微囊藻毒素-LR抗體的稀釋液中，室溫攪拌反應4h，反應結束後6000rpm離心10min，運用pH3.8、含有0.1%PEG20000的lmL0.005mol/LCTAB的溶液進行重分散，用該溶液洗滌兩遍，最後用pH3.8、含有0.1%PEG20000的50yL0.005mol/LCTAB的溶液進行重分散，此偶聯物置於4。C保存。金納米棒-包被原探針的製備包被原和金納米棒的偶聯與(3)抗體和金納米棒的偶聯操作相同，只是在包被原的量上有區別，即加入的包被原60yL用pH3.8、含有0.1%PEG20000的940iiL0.005mol/LCTAB的溶液進行稀釋。將pH3.8、0.5mL、2nmol/L重懸後的金納米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修飾的微囊藻毒素-LR包被原的稀釋液中，室溫攪拌反應4h，反應結束後6000rpm離心10min，運用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液lmL中進行重分散，用該溶液洗滌兩遍，最後用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液50yL進行重分散，此偶聯物置於4t:保存；抑制反應條件的優化a)金納米棒-抗體(GNR-Ab)與金納米棒_包被原(GNR-Ag)的配比GNR-Ab與GNR-Ag的配比採用了3:1，2:l，l:l，l:2和1:3進行優化，通過動態光散射儀測定的最大的粒徑作為該條件的最優條件，最終i:i的配比所得到的納米鏈的粒徑最大，因此選擇1:1作為GNR-Ab與GNR-Ag的最佳配比；b)反應時間的優化—般來說，隨著反應時間的延長納米鏈的長度會變長，但是金納米棒的聚合度到了一定的聚合程度，納米鏈的長度隨著反應時間的延長變化就不是非常明顯，並且反應時間過長也會導致檢測不是非常靈敏。因此，選用15min，30min和lh最為抑制反應時間的優化條件，通過測定形成的納米鏈的粒徑可以得出30min的納米鏈的粒徑和lh的粒徑變化程度不是很大並且30min反應時間短故而採用30min作為抑制試驗最佳的反應時間。c)反應溫度的變化溫度對於抗體和抗原反應有比較大的影B向，因此對於反應溫度進行了優化，選用4t:，25t:和37t:反應30min作為反應溫度優化條件。通過實驗結果可知37。C形成的納米鏈的長度最長，因而採用37t:作為最佳反應溫度。標準曲線的建立通過測定納米鏈的粒徑可以建立基於金納米棒探針的端面與端面相互連接的針對微囊藻毒素-LR的檢測方法，步驟為①向離心管中加入20iiL的GNR-Ag後加入用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液稀釋的0.01，0.05，0.1，1，10，50，100ng/mL的微囊藻毒素-LR後混勻，按照與GNR-Ag與GNR-Ab的體積比為1:1加入GNR-Ab混勻，放入37°C反應30min。②反應結束，取10iiL的反應液加入pH3.8、含有0.1%PEG20000的990yL的0.005mol/LCTAB溶液稀釋，混勻。靜置2分鐘，用動態光散射儀DLS測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次。運用MC-LR的濃度作為橫坐標，納米鏈的粒徑作為縱坐標建立抑制標準曲線。檢測樣品中微囊藻毒素-LR的濃度步驟為①向離心管中加入20iiL的GNR-Ag後加入用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液稀釋的含微囊藻毒素_LR的樣品液後混勻，按照與GNR-Ag與GNR-Ab的體積比為1:1加入GNR-Ab混勻，放入37。C反應30min;②反應結束，取10iiL的反應液加入pH3.8、含有0.1%PEG20000的990iiL的0.005mol/LCTAB溶液稀釋，混勻。靜置2min，用動態光散射儀測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次；根據所測得的粒徑值對照標準曲線求出樣品液中微囊藻毒素-LR的含量。本發明的有益效果與傳統的ELISA方法相比，本發明利用晶種生長法合成的金納米棒分別與微囊藻毒素的包被原和抗微囊藻毒素的抗體相連，在液體的環境下金納米棒偶聯抗體和金納米棒偶聯包被原反應形成納米鏈，微囊藻毒素可以和金納米棒偶聯的包被原進行競爭結合金納米棒偶聯抗體的結合位點，因此微囊藻毒素的含量會影響納米鏈的長度。故通過動態光散射測定液體環境中的納米鏈的粒徑分布來測定微囊藻毒素的含量。本發明只在液體環境中反應，不需要清洗的步驟，只需要一步反應，簡化了反應的條件，減輕勞動強度，提高了檢測的靈敏度。圖1微囊藻毒素檢測的標準曲線。具體實施例方式實施例1(1)包被原修飾包被原的修飾採用碳二亞胺法進行硫辛酸和包被原的結合，具體操作步驟如下①0.3mL的硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1.625mg)與0.2mL的包被原溶液混合。②將75iiL的含碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入上述溶液中後室溫反應4h。③用pH值7.4的磷酸鹽緩衝液透析3天，每天換液3次。④將修飾後的包被原放在fC備用。(2)抗體修飾①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液(含硫辛酸1.625mg)與0.4mL的抗體混合。②將75iiL的碳二亞胺在磁力攪拌下逐滴滴入上述溶液中，室溫反應4h。③用pH7.4的磷酸鹽緩衝液透析3天，每天換3次透析液。④將修飾後的抗體放在fC備用。(3)抗體和金納米棒端面偶聯採用晶種生長法合成金納米棒首先要經過7500rpm離心15min去除溶液中多餘的Vc、AgN03和小的球形粒子金納米棒後，利用pH3.8、0.005mol/L十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)含有O.1%聚乙二醇(PEG20000)的溶液進行重懸。重懸液的pH值用lmol/LHC1的進行調整。在金納米棒的製備過程中CTAB起著非常關鍵的作用。CTAB主要是分布在金納米棒的側面從而金納米棒的側面帶有正電荷而金納米棒的端面的分布很少，因此採用硫辛酸修飾的抗體會修飾到金棒的端面而非側面上。0.5mL、2nmol/L重分散的GNRs逐滴滴加到由50iiL修飾後抗體稀釋到lmL的抗體的稀釋液。室溫攪拌反應4h。反應結束後6000rpm離心10min，運用lmL的0.005MCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG的溶液進行重分散。用該溶液洗滌兩遍。最後用50iiL的0.005mol/LCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG20000的溶液進行重分散。此偶聯物置於4t:保存。(4)包被原和金納米棒端面偶聯包被原和金納米棒的偶聯與(3)抗體和金納米棒的偶聯相似，只是在包被原的量上有區別，即加入的包被原60iiL用940iiL的0.005mol/LCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG20000的溶液進行稀釋。將pH3.8、0.5mL、2nmol/L重懸後的金納米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修飾的微囊藻毒素-LR包被原的稀釋液中，室溫攪拌反應4h，反應結束後6000rpm離心lOmin，運用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液lmL中進行重分散，用該溶液洗滌兩遍，最後用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液50yL進行重分散，此偶聯物置於4t:保存；(5)抑制試驗反應條件的優化抑制試驗受到了許多條件的影響，在此我們對影響抑制試驗最大的三個條件進行了優化即GNR-Ab與GNR-Ag的配比，抑制試驗反應時間，反應溫度。a)GNR-Ab與GNR-Ag的配比GNR-Ab與GNR-Ag的配比採用了3:1，2:l，l:l，l:2和1:3進行優化，通過動態光散射儀測定的最大的粒徑作為該條件的最優條件。最終i:i的配比所得到的納米鏈的粒徑最大，因此選擇1:l作為GNR-Ab與GNR-Ag的最佳配比。b)反應時間的優化—般來說，隨著反應時間的延長納米鏈的長度會變長，但是金納米棒的聚合度到了一定的聚合程度，納米鏈的長度隨著反應時間的延長變化就不是非常明顯並且反應時間過長也會導致檢測不是非常靈敏。因此，選用15min，30min和lh最為抑制反應時間的優化條件，通過測定形成的納米鏈的粒徑可以得出30min的納米鏈的粒徑和lh的粒徑變化程度不是很大並且30min反應時間短故而採用30min作為抑制試驗最佳的反應時間。c)反應溫度的變化溫度對於抗體和抗原反應有比較大的影響因此對於反應溫度進行了優化選用4t:，25t:和37t:反應30min作為反應溫度優化條件。通過實驗結果可知37。C形成的納米鏈的長度最長，因而採用37t:作為以後進一步實驗的反應條件。(6)標準曲線的建立微囊藻毒素-LR(995.2Da)作為一個小分子不可能被兩個抗體分子進行識別。當GNR-Ab和GNR-Ag混合時，由於抗體抗原反應導致金納米棒發生自組裝形成長的納米鏈。當加入微囊藻毒素MC-LR時。MC-LR就會與包被原競爭抗體的結合位點導致GNR-Ab不能兩端同時與GNR-Ag發生免疫反應，因此MC-LR的濃度會影響納米鏈的長度，通過測定納米鏈的粒徑可以建立基於金納米棒探針的端面端面相互連接的針對MC-LR的檢測方法，具體的步驟為①向離心管中加入20iiL的GNR-Ag後加入用0.005mol/LCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG20000的溶液稀釋的0.01，0.05，0.1，1，10，50，100ng/mL的微囊藻毒素後混勻，按照與GNR-Ag與GNR-Ab的體積比為1:1加入GNR-Ab混勻，放入37。C反應30min。②反應結束，取lOiiL的反應液加入990iiL的0.005mol/LCTAB(pH3.8)含有0.1%PEG20000的溶液稀釋，混勻。靜置2分鐘，用DLS測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次。運用MC-LR的濃度作為橫坐標，納米鏈的粒徑為縱坐標建立抑制標準曲線。(7)實際樣本的檢測。實際樣本是來自無錫不同區域的太湖水。我們通過對實際樣本的添加回收率實驗來驗證本方法的可靠性。太湖水中的含有的原始的微囊藻毒素通過傳統的ELISA進行測定。在攪拌的條件下添加微囊藻毒素MC-LR標準品至預先採集的實際樣本太湖水中，添加的濃度為0.05，0.l，O.5，1，2.5，5ng/mL。添加後將太湖水在4攝氏度靜置兩個小時以達到水中藻毒素的含量達到一致。而後通過本專利建立的檢測方法測定MC-LR的濃度計算回收率。通過對數據分析得到回收率在92.21%和109.38%之間。兩組平行試驗的變異係數均小於3.73%。通過這個結果可以得出本專利建立的檢測方法是可行的並且簡單、快速和省力的一種方法。表1實際樣本檢測即添加回收率實驗。tableseeoriginaldocumentpage91原始濃度採用傳統的ELISA方法測定。2檢測濃度通過標準曲線計算得到。權利要求一種基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特徵在於包括包被原的修飾，抗體的修飾，修飾的包被原和金納米棒的偶聯，修飾的抗體和金納米棒的偶聯，反應條件的優化，抑制曲線的測定，實際樣本的檢測；(1)包被原的修飾將微囊藻毒素-LR包被原與硫辛酸相偶聯得到修飾的包被原；(2)抗體的修飾將抗微囊藻毒素-LR抗體與硫辛酸相偶聯得到修飾的抗微囊藻毒素-LR抗體；(3)用步驟(1)得到的修飾的包被原與金納米棒的端面偶聯得到金納米棒-包被原探針；(4)用步驟(2)得到的修飾的抗微囊藻毒素-LR抗體與金納米棒的端面偶聯得到金納米棒-抗體探針；(5)對抑制反應的各個條件進行優化；(6)標準曲線的建立利用間接競爭免疫檢測原理，將微囊藻毒素-LR和(3)金納米棒-包被原探針同時加入到一個離心管中，而後向離心管中加入(4)金納米棒-抗體探針，混勻，通過微囊藻毒素-LR和金納米棒-包被原探針與金納米棒-抗體探針進行競爭偶聯，通過微囊藻毒素-LR濃度的不同會使形成的粒子形成不同的粒徑分布，通過納米粒度儀檢測粒徑的變化從而檢測微囊藻毒素-LR的濃度，建立粒徑-微囊藻毒素-LR濃度的標準曲線；(7)檢測樣品中微囊藻毒素-LR的濃度。2.根據權利要求1所述的基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特徵是包被原的修飾①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，與0.2mL的微囊藻毒素-LR包被原溶液混合；②將75i！L的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入步驟①所述溶液中後室溫反應4h;③用pH7.4的磷酸鹽緩衝液透析3天，每天換液3次；④將修飾後的包被原放在4t:備用。3.根據權利要求1所述的基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特徵是抗體的修飾①0.3mL的含硫辛酸的乙醇溶液，含硫辛酸1.625mg，與0.4mL抗微囊藻毒素-LR抗體混合；②將75iiL的碳二亞胺在磁力攪拌的條件下逐滴滴入步驟①所述溶液中後室溫反應4h;③用pH7.4的磷酸鹽緩衝液透析3天，每天換3次透析液；④將修飾後的抗體放在4t:備用。4.根據權利要求1所述的基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特徵是金納米棒_抗體探針的製備採用晶種生長法合成金納米棒，再經過7500rpm離心15min去除金納米棒溶液中多餘的Vc、AgN03和小的球形粒子金納米棒後，利用pH3.8、含有0.1%聚乙二醇PEG20000的0.005mol/L十六烷基三甲基溴化銨CTAB溶液進行重懸；重懸液用lmol/LHC1調整至pH3.8;0.5mL、2nmol/L重分散的金納米棒GNRs溶液逐滴滴加到由50L稀釋到lmL的硫酸鋅修飾的微囊藻毒素-LR抗體的稀釋液中，室溫攪拌反應4h，反應結束後6000rpm離心10min，運用pH3.8、含有0.1%PEG20000的lmL0.005mol/LCTAB的溶液進行重分散，用該溶液洗滌兩遍，最後用pH3.8、含有0.1%PEG20000的50yL0.005mol/LCTAB的溶液進行重分散，此偶聯物置於4。C保存。5.根據權利要求1所述的基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特徵是金納米棒-包被原探針的製備包被原60iiL用pH3.8、含有0.1%PEG20000的940iiL、0.005mol/LCTAB的溶液進行稀釋；將pH3.8、0.5mL、2nmol/L重懸後的金納米棒溶液GNRs逐滴滴加到硫辛酸修飾的微囊藻毒素-LR包被原的稀釋液中，室溫攪拌反應4h，反應結束後6000rpm離心10min，運用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液lmL中進行重分散，用該溶液洗滌兩遍，最後用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液50yL進行重分散，此偶聯物置於4t:保存。6.根據權利要求1所述的基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特徵是抑制反應條件的優化a)金納米棒_抗體GNR-Ab與金納米棒-包被原GNR-Ag的配比選擇1:1作為GNR-Ab與GNR-Ag的最佳配比；b)反應時間的優化採用30min作為抑制試驗最佳的反應時間；c)反應溫度的變化採用37t:作為最佳反應溫度。7.根據權利要求1所述的基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特徵是標準曲線的建立通過測定納米鏈的粒徑可以建立基於金納米棒探針的端面與端面相互連接的針對微囊藻毒素-LR的檢測方法，步驟為①向離心管中加入20iiL的GNR-Ag後加入用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液稀釋的0.01，0.05，0.1，1，10,50，100ng/mL的微囊藻毒素-LR後混勻，按照與GNR-Ag與GNR-Ab的體積比為1:1加入GNR-Ab混勻，放入37°C反應30min;②反應結束，取10iiL的反應液加入pH3.8、含有0.1%PEG20000的990yL的0.005mol/LCTAB溶液稀釋，混勻。靜置2分鐘，用動態光散射儀測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次；運用MC-LR的濃度作為橫坐標，納米鏈的粒徑作為縱坐標建立抑制標準曲線。8.根據權利要求1所述的基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，其特徵是檢測樣品中微囊藻毒素-LR的濃度步驟為①向離心管中加入20iiL的GNR-Ag後加入用pH3.8、含有0.1%PEG20000的0.005mol/LCTAB溶液稀釋的含微囊藻毒素_LR的樣品液後混勻，按照與GNR-Ag與GNR-Ab的體積比為1:1加入GNR-Ab混勻，放入37。C反應30min;②反應結束，取10iiL的反應液加入pH3.8、含有0.1%PEG20000的990yL的0.005mol/LCTAB溶液稀釋，混勻。靜置2min，用動態光散射儀測定該反應液的粒子的粒徑，重複兩次；根據所測得的粒徑值對照標準曲線求出樣品液中微囊藻毒素-LR的含量。全文摘要一種基於金納米棒端面自組裝檢測微囊藻毒素-LR的方法，屬於免疫分析化學
技術領域：
。本發明以金納米棒的端面與微囊藻毒素包被原及抗微囊藻毒素抗體分別偶聯形成金納米棒的探針，利用合成的金納米棒探針與微囊藻毒素-LR進行免疫反應從而由於金納米棒端面的抗原抗體反應形成納米鏈，通過納米鏈的粒徑的變化達到檢測微囊藻毒素-LR的目的。本發明是在液體環境中反應，不需要清洗的步驟，只需要一步反應，簡化了反應的條件，減輕勞動強度，提高了檢測的靈敏度。文檔編號G01N33/531GK101699288SQ20091003579公開日2010年4月28日申請日期2009年10月16日優先權日2009年10月16日發明者劉麗強,徐麗廣,徐乃豐,朱穎越,胥傳來,許定華,陳偉,馬偉申請人:江南大學