LSECtin的一種新用途的製作方法

2023-08-01 09:08:01 1

專利名稱：：LSECtin的一種新用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及LSECtin的一種新用途。技術背景C型肝炎病毒屬於黃病毒科(flaviviridae)，其基因組為單股正鏈RNA，是非甲、非B型肝炎的主要致病因素。全世界大約有1.7億人感染HCV。在HCV感染者中，大約有55—85%的急性感染轉變成慢性感染，其中一些有症狀的慢性感染能夠發展成肝硬化和肝細胞性肝癌。由於缺少動物模型和有效的HCV體外細胞培養系統，因此關於HCV病毒感染機制還不清楚。研究者推測HCV的高發病率是由於病毒啟動了免疫逃逸機制，機體不能對HCV病毒蛋白產生有效免疫反應造成^。目前還沒有有效的疫苗可以用於HCV感染的預防，而臨床較多應用IFN-a和病毒唑聯合治療，由於受到劑量、治療時間和病毒基因型影響，療效個體差異較大，而且有較大的副作用，因此仍然需要開發疫苗和新的治療藥物。HCV基因組編碼一個長的肽鏈，這個肽鏈被病毒的細胞蛋白酶切割為多個成熟病毒蛋白。這些蛋白分為結構蛋白(core、El、E2和可能存在的p7)和非結構蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。El和E2是高度糖基化蛋白，它們形成異源二聚體並且被N連接的糖原進行廣泛的轉錄後修飾。在感染過程中，HCV病毒顆粒首先與細胞表面特異性受體相互作用，引起HCVEl和E2的構象變化，導致病毒和細胞的膜融合，從而進入細胞。有證據表明E2糖蛋白參與受體的識別，El介導膜融合。在HCV的感染過程中有眾多的粘附因子和受體同時或相繼參與。由於缺少有效的HCV體外細胞培養系統，人們利用表達在昆蟲細胞系統的病毒樣顆粒、假病毒顆粒和可溶性E2蛋白作為替代物鑑定了一些潛在的HCV受體，包括CD81、SR-B1等，最近的研究證實CD81是HCV入胞所必需的共受體。由於HCV是嗜肝性病毒，而CD81、SR-B1是廣泛表達的膜蛋白，因此不能通過它們解釋HCV感染的組織特異性，從而提示必然存在肝臟特異表達的結合HCV的分子。最近的研究指出細胞表面的一些分子雖然不是感染所必需的，但是能夠有效的提高病毒感染效率如C型凝集素家族成員中的DC-SIGN(DC-印ecificICAM-3grabbingnonintegrin,DC-SIGN)和DC-SIGNR(DC-SIGN-relatedprotein,DC-SIGNR)。DC-SIGN和DC-SIGNR作為俘獲受體參與多種病毒的反式感染，包括HIV、伊波拉病毒、SARS冠狀病毒和HCV。DC-SIGN、DC-SIGNR屬於II型C型凝集素，即0&2+依賴型凝集素。它們屬II型穿膜蛋白，N端位於細胞內部，C端位於細胞外，胞外部分含有一個糖識別結構域(CRD)。Ca"是CRD結構整合和保證凝集素活性所必需的，直接參與配體結合。CRD結構域的典型特徵是含有2個反向平行的e摺疊和2個a螺旋，形成一個結合(^2+的口袋，可以識別糖配體。有些在序列上同源的結構域卻不識別糖配體，而是識別多肽或者脂類，它們與配體的結合可以不依賴"2+，這些結構被稱為C型凝集素樣的結構域(C-typelectin-likedomains,CTLD)。II型C型凝集素具有細胞粘附和識別病原體雙重功能，其中識別病原體受多個水平的調節，主要包括以下幾個方面一、微生物表面和病原體相關分子的所有組成成分。大多數C型凝集素通過CRD/CTLD識別甘露糖、半乳糖，從而與糖蛋白上的糖基相互作用，發揮細胞粘附和捕捉抗原的功能，而糖基結合的特異性決定了選擇性識別病原微生物；二、不同免疫細胞存在不同病原體識別受體；三、凝集素在細胞表面的分布影響糖結合能力；四、受體之間的CROSS-TALK形成多分子複合網絡。由於C型凝集素識別病原體受到多個水平的調節，因此就有眾多因素影響C型凝集素識別病原體。首先微生物表面的病原體相關分子模式(Pathogen-AssociatedMolecularPatterns,P腦Ps)，包括LPS、肽聚糖、真菌細胞壁多糖的密度以及配體糖基排列、分枝的微小差異直接影響與C型凝集素的特異性結合。例如DC-SIGN能結合特殊排列的較複雜的甘露糖、非唾液酸化的Lewis-X/A、硫酸化的Lewis-A，而不與硫酸化的Lewis-X結合。其次凝集素在細胞表面的分布、多聚化的程度以及與細胞的脂筏(Lipidrafts)共定位也影響病原體識別。凝集素在細胞表面成簇分布有利於病毒的結合。DC-SIGN在樹突狀細胞(dendritiscells,DCs)上成簇分布，並且定位在某一微區域，為病毒入侵宿主細胞提供停靠"碼頭"。細胞的脂筏膽固醇和鞘糖脂含量高，脂筏與C型凝集素共定位也為病毒進入宿主提供一個停靠"碼頭"。最後，C型凝集素與Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLRs)之間的cross-talk可以通過控制免疫激活和免疫耐受之間的平衡影響對病原體的識別。結核桿菌衍生的甘露糖化的脂阿拉伯甘露糖與DCs上的DC-SIGN結合，能抑制TLR介導的IL-12的產生，使免疫系統從保護性的Thl轉變到Th2，有利於結核桿菌的免疫逃逸。DC-SIGN主要高表達於外周組織中不成熟DC以及淋巴組織中成熟DC的表面。DC-SIGN既是一種粘附分子，又是多種病原微生物的受體。目前已經發現DC-SIGN可以結合HIV、SIV、伊波拉病毒、巨細胞病毒、HCV和登革熱病毒等，而且還可以和多種病原菌、酵母和寄生蟲相互作用。DC-SIGNR特異性地表達在肝和淋巴結竇內皮細胞上，也可以結合多種病原體，包括HIV、HCV、辛德畢斯病毒、伊波拉病毒和馬爾堡病毒，還有一些病原菌。最近，研究人員發現DC-SIGNR可以結合SARS相關的冠狀病毒上的大S糖蛋白，中國倉鼠卵巢細胞轉染DC-SIGNR後會對SARS相關的冠狀病毒易感。以前只發現DC-SIGNR在肝竇內皮細胞和淋巴結中表達，而近期通過免疫組化發現DC-SIGNR還可以在II型肺泡細胞和肺內皮細胞中表達，為DC-SIGNR作為SARS相關的冠狀病毒受體在肺部感染中發揮作用提供了組織表達譜上的特異性。DC-SIGN、DC-SIGNR不僅能夠增強HIV對CD44T細胞的反式感染，也能夠通過CRD識別HCV膜糖蛋白E2的甘露聚糖，結合HCV，然後通過內化過程送入溶酶體，進行處理並提呈給鄰近的肝實質細胞，引起肝實質細胞反式感染HCV。這個過程能使病毒長時間滯留在機體內而導致慢性感染，因而DC-SIGN、DC-SIGNR可能在病原微生物的慢性感染和免疫逃避中發揮著重要作用。DC-SIGN、DC-SIGNR屬於II型C型凝集素家族，這一家族都含有典型的糖基識別結構域，那麼家族中的其它成員是否也參與一種或多種病原微生物的感染？LSECtin(liversinusoidalendothelialcellsC-typelectin,LSECtin)是一個新的II型C型凝集素家族成員，與DC-SIGN和DC-SIGNR結構相似，其N端含有一個較短的胞內結構域、一個穿膜部分和胞外部分、胞外由一個含coiled-coil結構域的頸部和一個C末端CTLD結構域組成。人源LSECtin基因定位於19pl3.3，與CD23、DC-SIGN、DC-SIGNR基因共同位於一個大約105kb大小的染色體區域。這一個染色體區域從中心粒起，依次為CD23、LSECtin、DC-SIGN和DC-SINGR。四個基因緊密成簇排列，它們的基因結構比較相似，說明它們是由同一個祖先基因經過平行複製而來，進化樹分析已經證實這一結論。LSECtin與DC-SIGNR、DC-SIGN、CD23的胺基酸同源性分別為32%、31%和31%。
發明內容本發明的目的是提供LSECtin的一種新用途。本發明所提供的LSECtin的新用途是LSECtin在作為抗C型肝炎病毒感染藥物作用耙點中的應用。如LSECtin在篩選抗C型肝炎病毒感染藥物中的應用。本發明通過HCV感染患者血清中的病毒顆粒、分泌型表達的HCV糖蛋白E2截短形式和HCV假病毒顆粒結合實驗證實C型凝集素LSECtin是一個新的HCV的結合受體，LSECtin與HCV的黏附是通過LSECtin的CRD結構域和HCV的囊膜上E2糖蛋白之間的相互作用介導的。圖1為LSECtin和DC-SIGNR穩定和瞬時細胞膜表面表達水平ALSECtin和DC-SIGNR穩定表達的細胞膜表達水平BLSECtin瞬時梯度表達的細胞膜表達水平圖2為LSECtin與HCVE2蛋白的特異性結合A穩定表達LSECtin的細胞結合HCVE2蛋白B瞬時表達LSECtin的細胞結合HCVE2蛋白的能力隨著LSECtin的表達水平的提高而增加C分泌型表達的LSECtin抑制LSECtin與HCVE2蛋白的結合DEGTA抑制LSECtin與HCVE2蛋白的結合，Mannan部分降低LSECtin與HCVE2蛋白的結合圖3為LSECtin與HCV假病毒顆粒的結合以及EGTA抑制LSECtin與HCV假病毒顆粒的結合，Mannan部分降低LSECtin與HCV假病毒顆粒的結合圖4為LSECtin與HCV患者血清結合圖5為LSECtin與CD81、DC-SIGNR的相互作用A免疫共沉澱實驗證明LSECtin與DC-SIGNR的相互作用B交互免疫共沉澱實驗證明LSECtin與DC-SIGNR的相互作用C免疫共沉澱實驗證明LSECtin與CD81的相互作用D分泌型LSECtin與DC-SIGNR的細胞粘附實驗E分泌型LSECtin與CD81的細胞粘附實驗具體實施方式下述實驗證實表達LSECtin的細胞能夠以鈣離子依賴的方式通過C末端的CTLD功能域結合HCVE2蛋白，鈣離子螯合劑EGTA可以有效地封閉E2與LSECtin之間的相互作用，而這正是CTLD結構域的典型特徵。HCVE2蛋白是高度甘露糖糖基化的蛋白，DC-SIGN、DOSIGNR通過識別甘露糖識別E2蛋白，甘露聚糖能夠抑制兩者與HCV的結合。但是實驗表明甘露聚糖不能抑制LSECtin結合E2糖蛋白和HCV假病毒顆粒，這提示LSECtin不是通過識別E2蛋白上的甘露糖結合HCV，具有與DC-SIGN、DC-SIGNR不同的特異性糖基識別譜。免疫共沉澱實驗和細胞粘附實驗證實了LSECtin和DC-SIGNR、CD81存在相互作用，這說明HCV的三個受體有可能在肝竇內皮細胞表面形成微區域，從而更有效地增強受體對HCV的親和性。實施例1、LSECtin與HCVE2蛋白的特異性結合l材料質粒pIRES(真核表達載體將2個基因分別克隆到2個多克隆位點並且高表達，能夠在同一條mRNA上翻譯2條連續的開放閱讀框架)購自BDbioscienceclontech，pSECtag2(分泌型真核表達載體)購自Invitrogen公司。相關試劑Fc抗體購自Sigma公司。2方法一、LSECtin和DC-SIGNR穩定和瞬時細胞膜表面表達水平1)pIRES-LSECtin、pIRES-DC-SIGNR、pIRES-DC-SIGNR-LSECtin真核表達載體的構建A、以pcDNA3.1-LSECtin(北京正旦國際科技有限責任公司)為模板，用引物pALl(5'-TCGCTAGCATGGACACCACCAGGTCAGC-p3')和pAL2(5'-CGGAATTCTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTCAC-P3')PCR擴增全長LSECtin基因，分別用^boRI和順el酶切全長LSECtin基因PCR擴增產物和pIRES，將全長LSECtin基因插入pIRES的fcoRI和vWel位點，得到重組載體pIRES-LSECtin。B、以pcDNA3-DC-SIGNR(北京正旦國際科技有限責任公司)為模板，用引物pADl(5'-GCGCTAGCGAAAACATGAGTGAC-p3')和pAD2(5'-CGGAATTCTCATTCGTCTCTGAAGCA-p3')PCR擴增全長DC-SIGNR基因，分別用fcoRI和順el酶切全長DC-SIGNR基因PCR擴增產物和pIRES，將全長DC-SIGNR基因插入pIRES的fcoRI和順el位點，得到重組載體pIRES-DC-SIGNR。C、以pcDNA3.l-LSECtin(北京正旦國際科技有限責任公司)為模板，用引物pALll(5'-CGTCTAGAATGGACACCACCAGGTACAGC-p3)和pAL21(5'-TAGCGGCCGCTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTCAC-p3')PCR擴增全長LSECtin基因，分別用Xfel和#"1酶切全長LSECtin基因PCR擴增產物和pIRES-DC-SIGNR，將全長LSECtin基因插入pIRES-DC-SIGNR的X力al和yfefl位點，得到重組載體pIRES-DC-SIGNR-LSECtin。2)穩定表達pIRES-LSECtin、pIRES-DC-SIGNR、pIRES-DC-SIGNR-LSECtin的NIH-3T3細胞的篩選NIH-3T3細胞鋪六孔板，24小時後，用脂質體Lipofectamine2000和pIRES-LSECtin、pIRES-DC-SIGNR、pIRES-DC-SIGNR-LSECtin質粒分別轉染NIH-3T3細胞，轉染後48小時，換含G418(800ng/ml)的DMEM，10%FBS的培養基，兩周後，挑選單細胞克隆轉入24孔板培養，一周後，擴大培養，並用LSECtin單抗(北京蛋白質組研究中心)和DC-SIGNR多抗(SantaCruzBiotechnology公司)為一抗，羊抗鼠IgG—HRP和兔抗羊IgG—HRP(中山公司)為二抗，WesternBlot檢測LSECtin和DC-SIGNR的表達，表達最高的細胞株擴大培養，液氮保存。3)穩定表達的流式分析表達pIRES-LSECtin、pIRES-DC-SIGNR、pIRES-DC-SIGNR-LSECtin的NIH-3T3細胞穩定株用EDTA消化，PBS洗滌三次，細胞用4X的多聚甲醛固定，流式緩衝液(PBS，pH7.4，1%BSA，0.1%歸3)洗滌三次，分別加l:50稀釋的LSECtin單抗室溫30min，流式緩衝液洗滌三次，分別加FITC標記的羊抗鼠IgG(1:50),室溫30min，流式緩衝液洗滌4次，流式細胞儀分析；或者用標記FITC的DC-SIGNR抗體室溫30min，流式緩衝液洗滌4次，流式細胞儀分析。以pcDNA3.1-LSECtin(北京正旦國際科技有限責任公司)為模板，用引物pl(5,一GCGMTTCAATGGACACCAGGTACAG—3')禾口p2(5'-CGGGATCCTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTCAC-3')PCR擴增全長LSECtin基因，分別用EcoRI和BamHI酶切全長LSECtin基因PCR擴增產物和pFLAG-CMV2(Sigma)，將全長LSECtin基因插入pFLAG-CMV2(Sigma)的EcoRI和BamHI位點，得到重組載體pFLAG-CMV2-LSECtin。用Effectene(Qiagen)分別轉染O.1、0.2、0.4ugpFLAG-CMV2-LSECtin至服K293T細胞，30小時後收穫細胞。EDTA消化，PBS洗滌三次，細胞用4%的多聚甲醛固定，流式緩衝液(PBS，pH7.4，1%BSA，0.1%線)洗滌三次，分別加l:50稀釋的LSECtin單抗室溫30min,流式緩衝液洗滌三次，分別加FITC標記的羊抗鼠IgG(1:50)，室溫30min，流式緩衝液洗滌4次，流式細胞儀分析。結果如圖l所示，流式細胞檢測穩定表達LSECtin、DC-SIGNR的細胞株的表達水平分別為59.37%、56.23%。圖1中A左側兩張圖片以DC-SIGNR多抗為一抗的檢測結果，圖1中A右側兩張圖片和B圖以LSECtin單抗為一抗的檢測結果，其中圖1A中從左數1、3分別為左數2、4的陰性對照(NIH-3T3細胞)。NIH-3T3-DC-SIGNR表示穩定表達pIRES-DC-SIGNR的NIH-3T3細胞，NIH-3T3-LSECtin表示穩定表達pIRES-LSECtin的NIH-3T3細胞。圖1中A，Ml表示與蛋白黏附的細胞；圖1中B的0、0.1、0.2、0.4Hg分別表示轉染pFLAG-CMV2-LSECtin質粒的量，0.83%、15.91%、25.56%和35.64%分別表示HEK293T細胞相應表達LSECtin的流式水平，R2表示與蛋白黏附的細胞。二、LSECtin與HCVE2蛋白的特異性結合1、可溶性E2-myc融合蛋白表達載體構建pBRTM-HCV1-3011(北京正旦國際科技有限責任公司)為模板，擴增HCVE2364-661aa區域，Fl:5'-CGCGGATCCTGGTGGGGAACTGGGCG-3'(劃線部分為5a/dn位點)，Rl:5'-CCGCTCGAGACTCGGACCTGTCCCTGTC-3'(劃線部分為位點)，用LATaq酶(TaKaRa)PCR擴增，循環條件為先94。C5min;然後94。C45s，58°Clmin，72°Clmin，20次循環；最後72t:，10min。產物用PCR純化試劑盒純化，5a/dl1和i7ot雙酶切，產物回收後，與同樣處理的C端帶Myc-His標籤的pSecTag2/Hygro(Invitrogen)連接轉化JM109感受態細胞，挑選菌落，搖菌，提取質粒，J力oI和^a/zffl雙酶切鑑定重組子和測序。測序正確的重組子大量提取質粒，並定量。將該正確的重組質粒命名為pSec-E2-rayc。2、可溶性Fc-sE2融合蛋白表達載體構建pBRTM-HCV1-3011(北京正旦國際科技有限責任公司)為模板，擴增HCVE2364-661aa區域，Fl:5'-CGCTCTAGAAACCCACGTCACCGG-3'(劃線部分為J&I位點)，Rl:5'-CCGGGGCCCTCACTCGGACCTGTCCCTGTC-3'(劃線部分為4^1位點)，用LATaq酶(TaKaRa)PCR擴增。PCR產物用Xbal和Apal雙酶切，產物回收後，與同樣處理的C端帶Fc標籤的Signalplus/G418(北京正旦國際科技有限責任公司)連接轉化JM109感受態細胞，挑選菌落，搖菌，提取質粒，J&I和^Ml雙酶切鑑定重組子和測序。測序正確的重組子大量提取質粒，並定量。將該正確的重組質粒命名為pS-Fc-sE2。3、可溶性sE2-myc和Fc-sE2融合蛋白表達CH0細胞鋪六孔板，24小時後用脂質體Lipofectamine2000和pSec-E2-myc或pS-Fc-sE2質粒轉染CH0細胞，轉染後48小時，換Hygromycin(200ug/ml)或G418(800"g/ml)的DMEM，10XFBS的培養基，兩周後，挑選單細胞克隆轉入24孔板培養，一周後，擴大培養，並用Myc或Fc單抗(invitrogen)為一抗，羊抗鼠IgG—服P(中山公司)為二抗，WesternBlot檢測E2的表達，表達最高的細胞株擴大培養，液氮保存。收集細胞上清液，12000g,4'C，30分鐘，棄沉澱，上清-7(TC保存。製備大量融合蛋白時，用無血清的CHO培養基Hygromycin(200ug/ml)或G418(800yg/ml)替代含血清的DMEM培養基，培養4天，收集上清，離心去沉澱，30kDa超濾濃縮、定量，得到sE2-myc(可溶性的myc標籤的E2蛋白)和Fc-sE2(Fc標籤的可溶性E2蛋白)。其中，Hygromycin(200ixg/ml)用於篩選轉染pSec-E2-myc的細胞，G418(800ug/ml)用於篩選轉染pS-Fc-sE2的細胞。4、真核表達E2-myc和Fc-sE2融合蛋白與細胞粘附實驗步驟一中的單獨表達LSECtin的穩定株、單獨表達DC-SIGNR的穩定株、和共表達LSECtin和DC-SIGNR的穩定株各2X105個細胞，樣品用結合緩衝液洗漆一次，離心去上清，加入200y1的sE2-myc(5yg/ml),冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次；加入50u1的Myc單抗(20wg/ml)冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次；再加50u1的FITC標記的羊抗鼠IgG(10ug/ml),冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次，重懸於500u1的含4%多聚甲醛的PBS中，流式檢測。或者加入Fc-sE2蛋白200li1(5ug/ml),冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次；加入FITC標記的Fc單抗(10ug/ml),冰上30分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次，重懸於500nl的含4y。多聚甲醛的PBS中。進行流式分析。其中，結合緩衝液為20mMTris-HC1,pH8.0，15mMCaCl2,lMmMgCl2,0.5%TritonX-IOO,150MmNaCl。結果如圖2中A所示，以NIH-3T3細胞作陰性對照，檢測Fc-sE2蛋白與LSECtin、DC-SIGNR分別穩定表達的細胞結合。流式結果顯示粘附率分別為28.37、25.39%、(陰性對照NIH-3T3細胞為1.91%)，說明與DC-SIGNR相同，LSECtin能夠結合E2糖蛋白；而且與DC-SIGNR結合比較，兩者的結合能力沒有差別。NIH-3T3-DC-SIGNR表示轉pIRES-DC-SIGNR的NIH-3T3細胞，NIH-3T3-LSECtin表示轉pIRES-LSECtin的NIH-3T3細胞。用Effectene(Qiagen)分別轉染0.1、0.2、0.4ugpFLAG-CMV2-LSECtin至HEK293T細胞，30小時後收穫細胞，分為兩份樣品。一份樣品EDTA消化，PBS洗滌三次，細胞用4%的多聚甲醛固定，流式緩衝液(PBS，pH7.4，1%BSA，0.l%NaN,)洗滌三次，分別加l:50稀釋的LSECtin單抗室溫30min，流式緩衝液洗滌三次，分別加FITC標記的羊抗鼠IgG(1:50)，室溫30min，流式緩衝液洗滌4次，流式細胞儀分析。結果如圖2中B左圖所示，表明隨著LSECtin質粒轉染量的增加，膜表面表達LSECtin的細胞數也相應增加。橫坐標表示是轉染pFLAG-CMV2-LSECtin的量。另一份樣品用結合緩衝液洗滌一次，離心去上清，加入200nl的sE2-inyc(5yg/ml)，冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次；加入50u1的Myc單抗(20ug/ml)冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次；再加50u1的FITC標記的羊抗鼠IgG(lOyg/ml)，冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次，重懸於500111的含4%多聚甲醛的PBS中，流式檢測。結果如圖2中B右圖所示，說明隨著膜表面表達LSECtin的細胞數增加，能夠結合E2蛋白的細胞也相應增多，從而說明E2蛋白的結合是依賴於細胞膜表面表達的LSECtin。圖2中B的數值為3次重複實驗的平均值土標準差。圖2中B表達水平為流式細胞術測定的數據，表示表達LSECtin的細胞數佔總細胞數的比例；HCVE2結合率指表達LSECtin的細胞中能夠結合HCVE2的細胞所佔的比例。用Effectene(Qiagen)分別轉染0.1、0.2、0."gpFLAG-CMV2-LSECtin至HEK293T細胞，30小時後收穫細胞分為兩份。一份樣品用結合緩衝液洗滌一次，離心去上清，加入200u1的sE2-myc(5ng/ml),冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次；加入50ii1的Myc單抗(20yg/ml)冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次；再加50u1的FITC標記的羊抗鼠IgG(lOPg/ml)，冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次，重懸於500y1的含鎘多聚甲醛的PBS中，流式檢測。另一組200ul的sE2-myc(5ug/ml)與分泌性的LSECtin蛋白孵育30分鐘後再與細胞進行結合實驗，實驗步驟同上。結果如圖2中C所示，表明分泌性的LSECtin蛋白能夠特異性的抑制E2蛋白與表達LSECtin的細胞結合，說明LSECtin與E2蛋白結合的特異性。橫坐標標題中的control表示轉染pFLAG-CMV2的HEK293T細胞，LSECtin表示轉染pFLAG-CMV2-LSECtin的HEK293T細胞與E2蛋白結合、LSECtin+sLSECtin表示E2蛋白與分泌型的LSECtin蛋白孵育後，與轉染pFLAG-CMV2-LSECtin的HEK293T細胞結合。圖2中C的數值為3次重複實驗的平均值士標準差；HCVE2結合率指表達LSECtin的細胞中能夠結合HCVE2的細胞所佔的比例。5、EGTA和甘露聚糖的抑制實驗步驟一中的單獨表達LSECtin的穩定株、單獨表達DC-SIGNR的穩定株、和共表達LSECtin和DC-SIGNR的穩定株各2乂105個細胞，用結合緩衝液洗滌一次，離心去上清，加入200ul的sE2-myc(5ng/ml)，再加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)或甘露聚糖，使EGTA的終濃度為15mM，甘露聚糖的終濃度為20ug/ml。同時設不加EGTA或甘露聚糖的對照。冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次；加入50P1的Myc單抗(20ug/ml)冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次；再加50u1的FITC標記的羊抗鼠IgG(10ug/ml)，冰上60分鐘，結合緩衝液洗滌離心三次，重懸於500ul的含4。/。多聚甲酸的PBS中。進行流式分析。其中，結合緩衝液為結合緩衝液為20raMTris-HC1，pH8.0，15mMCaCl2,lMmMgCl2.0.5%TritonX-100，150MmNaCl。結果如圖2中D所示，表明流式檢測LSECtin組、DC-SIGNR組和NIH-3T3組粘附率分別為48.45、47.19、3.7%;加入甘露聚糖後各組結合E2蛋白的粘附率分別是29.11、18.63、8.21%;加入EGTA後其粘附率為14.13、18.17、4.02%。結果i兌明和DC-SIGNR相同，LSECtin與HCVE2的結合可以被EGTA抑制。與DC-SIGNR不同的是，在甘露聚糖的存在下DC-SIGNR的粘附率由47.19%降低到18.63%，而LSECtin的粘附率由48.45%降到29.11%，提示甘露聚糖不能完全抑制LSECtin與E2蛋白的結合。圖2中D，medium表示對照，mannan表示加入甘露糖的處理，EGTA表示加入EGTA的處理；NIH-3T3-DC-SIGNR表示轉pIRES-DC-SIGNR的NIH-3T3細胞，NIH-3T3-LSECtin表示轉pIRES-LSECtin的畫-3T3細胞。圖2中D的數值為3次重複實驗的平均值土標準差；HCVE2結合率指表達LSECtin的細胞中能夠結合HCVE2的細胞所佔的比例。本實驗用的LSECtin-NIH3T3、DC-SIGNR-NIH3T3都是穩定表達細胞株(圖2B則是瞬時表達)，因此LSECtin、DC-SIGNR表達水平幾乎是每個細胞都有，所以粘附HCVE2的值也比較高。實施例2、LSECtin與HCV假病毒顆粒的結合以及抑制實驗1、HCVE1E2真核表達載體的構建以pBRTM-HCVl-3011(北京正旦國際科技有限責任公司)為模板，用如下引物擴增HCVE1E2364-1096aa區域，雙酶切克隆到pcDNA3.1(+)(購自Invitrogen公司)載體的HindIII和EcoRI位點，得到重組載體pcDNA-HCVE1E2。57_GCTAAGCTTGGATGGCCGACCTCATGGGGTAC-3'5'-CGAGAATTCCGCCTCCGCTTGGGATAT-3'2、產生HCV假病毒用293T細胞8xlOV孔鋪六孔板，24h後用脂質體2000共轉染pNL4-3.Luc.R-E-(螢光素酶基因取代N端/e/基因而且e/K閱讀框架被破壞的HIV前病毒DNA載體，北京正旦國際科技有限責任公司)和pcDNA-HCVE1E2，48-72小時後收集上清，通過p24抗原ELISA檢測試劑盒(購自bioMerieubv，Boxtel,NL公司)進行p24抗原ELISA定量，濃度為67ug/ul，假病毒-8(TC凍存。3、HCV假病毒與結合實驗實施例1步驟一中的單獨表達LSECtin的穩定株、單獨表達DC-SIGNR的穩定株、和共表達LSECtin和DC-SIGNR的穩定株各2X105個細胞，用粘附緩衝液洗滌三次，離心去上清，加入HCV假病毒lng，37'C作用60分鐘，粘附緩衝液洗滌離心三次，裂解細胞，通過p24抗原ELISA檢測試劑盒(購自bioMerieubv,Boxtel，NL公司)進行p24抗原ELISA定量。其中，p24抗原的濃度為67ug/ul。粘附緩衝液為20mMTris-HCl，pH8.0，15mMCaCl2,lMmMgCl2,150MmNaCl。4、EGTA和甘露聚糖的抑制實驗用HCV假病毒與穩定株細胞的結合實驗按步驟3操作，但在加入假病毒的同時，再加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)或甘露聚糖，使EGTA的終濃度為15raM，甘露聚糖的終濃度為20ug/ml。其他同步驟3。ELISA檢測結合在細胞上的HCV假病毒中p24抗原含量，並計算與加入的p24抗原量之比，高出陰性對照2倍的認為是陽性。結果如圖3所示，陰性對照、LSECtin、DC-SIGNR陽性對照細胞的p24抗原回收率分別為2.17、11.57、26.23%。結果顯示LSECtin結合HCV假病毒，但其結合能力要弱於DC-SIGNR。EGTA、甘露聚糖抑制後，粘附率分別為4.58、9.56、5.47、2.74、1.06、5.79%。與DC-SIGNR相同，LSECtin與HCV假病毒顆粒的結合可被鈣離子拮抗劑EGTA抑制；不同的是DC-SIGNR結合能被甘露聚糖抑制，而LSECtin不能。圖3中，medium表示步驟3中的結果，mannan表示加入甘露糖的處理，EGTA表示加入EGTA的處理；NIH-3T3-DC-SIGNR表示轉pIRES-DC-SIGNR的NIH-3T3細胞，NIH-3T3-LSECtin表示轉pIRES-LSECtin的NIH-3T3細胞。圖3中，p24AntigenRecovered(%)表示p24抗原回收率，圖3中的數值為3次重複實驗的平均值士標準差。實施例3、LSECtin與HCV患者血清結合l材料HCV患者血清和無HCV感染血清均來自解放軍301醫院生化科。HCV陽性血清診斷均在RT-PCR檢測大於104個拷貝/1111。質粒pcDNA3.1-DC-SIGNR(北京正旦國際科技有限責任公司)。2、病毒的結合實驗實施例1步驟一中的NIH-3T3細胞、表達LSECtin的NIH-3T3穩定株各2X105個細胞，用粘附緩衝液洗滌三次，加入HCV患者血清(含HCV病毒)或無HCV感染血清37°C60分鐘，粘附緩衝液洗滌離心三次；用HCV螢光實時定量PCR試劑盒(購自深圳匹基生物技術有限公司)進行檢測結合在細胞表面的C肝病毒的RNA。粘附緩衝液配方為20mMTris-HC1,p朋.0,15raMCaCl2,lMmMgCl2,150MmNaCl。3、病毒結合的抑制實驗抑制試驗中HCV患者血清(含HCV病毒)或無HCV感染血清和分泌型表達的LSECtin蛋白4°(3孵育30分鐘後，與細胞進行結合(步驟同2)。4、EGTA和甘露聚糖的抑制實驗用血清與穩定株細胞的結合實驗按步驟2操作，但在加入血清的同時，再加入乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)或甘露聚糖，使EGTA的終濃度為15mM，甘露聚糖的終濃度為20ug/ml。其他同步驟2。結果如圖4和表1所示，以HCV陰性血清結合NIH-3T3細胞、穩定表達LSECtin細胞為陰性對照，檢測的拷貝數均小於500。在與三份HCV陽性患者的血清(>105)結合中，NIH-3T3細胞結合拷貝數分別為500、500和4300;而穩定表達LSECtin的細胞結合拷貝數分別為6.237X103、L375X104、1.044X104。說明LSECtin能夠結合HCV病毒顆粒。抑制試驗顯示鈣離子螯合劑乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)、分泌型LSECtin蛋白(sLSECtin)能夠抑制LSECtin與HCV患者血清中HCV病毒的結合；而甘露聚糖(marman)不能夠抑制兩者的結合，說明LSECtin能夠特異性的與HCV結合，但不是與HCV病毒的甘露糖結合。這些結果與LSECtin和HCV的E2蛋白、HCV的假病毒顆粒的實驗結果相同。表1中，血清滴度列的數值是用於實驗的血清樣品HCV的RNA拷貝數，而NIH-3T3列、NIH-3T3-LSECtin列的HCV的RNA拷貝數則是與細胞結合的HCVRNA拷貝數；HCV-是指無HCV感染血清，#1、#2和井3表示HCV患者血清；ND表示沒有測定。圖4中，NIH-3T3列的數值是HCV陰、陽性血清結合到NIH-3T3細胞拷貝數與HCV陰性血清結合NIH-3T3細胞拷貝數的比值；NIH-3T3-LSECtin列的數值是HCV陰、陽性血清結合到穩定表達LSECtin的NIH-3T3細胞株的拷貝數與HCV陰性血清結合NIH-3T3細胞拷貝數的比值;HCV-、HCV+分別表示HCV陰、陽性血清。圖4中的數值為3次實驗、4個個體樣品的平均值。表ltableseeoriginaldocumentpage15實施例4、LSECtin與CD81、DC-SIGNR的相互作用材料質粒真核表達載體pcDNA3.1(+)(購自Invitrogen公司)。相關試劑anti-Myc單克隆抗體購自Clontech公司，ami-DC-SIGNR多克隆抗體購自SantaCruzBiotechnology公司，proteinA/G-Agarose購自SantaCruzBiotechnology公司，CHO無血清培養基、G418購自Gibco公司，谷胺醯胺購自Hyclone公司，FITC-anti-Fc(ab),抗體購自Sigma公司，超濾管(30kDa)購自Millipore。2.1Co-IP實驗驗證LSECtin與DC-SIGNR的相互作用1)pcDNA3.1A-DC-SIGNR、pFLAG-CMV2-LSECtin真核表達載體的構建A、以pcDNA3.1-LSECtin(北京正旦國際科技有限責任公司)為模板，用引物pi(5'—GCGAATTCAATGGACACCAGGTACAG—3')禾口p2(5'—CGGGATCCTCAGCAGTTGTGCCTTTTCTCAC-3')PCR擴增全長LSECtin基因，分別用EcoRI和BamHI酶切全長LSECtin基因PCR擴增產物和pFLAG-CMV2(Sigma)，將全長LSECtin基因插入pFLAG-CMV2(Sigma)的EcoRI和BamHI位點，得到重組載體pFLAG-CMV2-LSECtin。B、以pcDNA3-DC-SIGNR(北京正旦國際科技有限責任公司)為模板，用引物pDl(5'-TCGGATCCGAAAACATGAGT—3')和pD2(5'—CAGAATTCCAACTATTCGTCTCT-3')PCR擴增全長DC-SIGNR基因，分別用EcoRI和KpnI酶切全長DC-SIGNR基因PC財廣增產物和pcDNA3.1(+)(Invitrogen)，將全長DC-SIGNR基因插入pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的EcoRI和KpnI位點，得到重組載體pcDNA3.1A-DC-SIGNR。2)免疫共沉澱實驗pcDNA3.1A-DC-SIGNR和pFLAG-CMV2-LSECtin共轉染HEK293T細胞，24小時後，收穫、裂解細胞，提取細胞總蛋白。1mg細胞總蛋白，加入0.25Pg對照IgG(兔IgG),20Wprotein-A/Gagarose4°C搖30min，4。C離心5min(2，500r/min)，小心收取上清(沉澱的agarose待用，作為對照)，加入2Wflag抗體(Sigma)或者Myc抗體(Clonetech),4°C搖4h，加入50Wprotein—A/Gagarose,4°C搖過夜，4°C離心5rain,收取agarose沉澱(小心棄去上清)，加細胞裂解液，40C搖30min，離心(2，500r/min)，洗3-4次，(與上面的待用沉澱的agarose同時做)，洗過的agarose沉澱重懸於40Wlx上樣緩衝液，100°C，5-lOmin;然後進行SDS-PAGE禾口Westernblotting。其中，Westernblotting中所用的一抗為flag抗體(Sigma)或者Myc抗體(Clonetech)。2.2穩定株篩選1)穩定表達DC-SIGNR的CH0細胞的篩選CH0細胞鋪六孔板，24小時後，用脂質體Lipofectamine2000和pc腿3.1A-DC-SIGNR質粒共轉染到CH0細胞，轉染後48小時，換含G418(800yg/ml)的10%FBSDMEM培養基，兩周後，挑選單細胞克隆轉入24孔板培養，一周後，擴大培養，並用DC-SIGNR多抗為一抗，兔抗羊IgG—HRP為二抗，WesternBlot檢測DC-SIGNR的表達，表達最高的細胞株擴大培養，液氮保存。2)穩定表達的流式分析表達pcDNA3.1A-DC-SIGNR的CH0細胞穩定株用EDTA消化，PBS洗滌三次，細胞用4%的多聚甲醛固定，流式緩衝液(PBS，pH7.4，1%BSA，0.l%NaN3)洗滌三次，用標記Fluorescein的DC-SIGNR抗體室溫30min，流式緩衝液洗漆四次，流式細胞儀分析。2.3細胞粘附實驗1)構建穩定表達LSECtin胞外區域的CHO細胞，獲得Fc-sLSECtin融合蛋白CHO細胞鋪六孔板，pIG-sLSECtin(北京正旦國際科技有限責任公司)質粒用Lipofectamine2000，轉染CHO細胞，轉染後48小時，換含G418(800lVml)的DMEM，10XFBS的培養基，兩周後，挑選單個細胞克隆轉入24孔板培養，一周後，擴大培養，並用Fc單抗為一抗，羊抗鼠IgG—冊P(中山公司)為二抗，WesternBlot檢測細胞培養上清液sLSECtin的表達，ELISA法測Fc含量，表達最高的細胞株，擴大培養，用含G418(400Pg/ml)的DMEM培養穩定表達LSECtin胞外區域蛋白的細胞，擴大培養。細胞長至90Q/。時，用更換CHO無血清培養基(含G41840(^g/ml)替代含血清的DMEM培養基，培養4天，收集上清並離心去沉澱。用截留分子量為30kDa超濾管濃縮100倍，得到Fc-sLSECtin融合蛋白，低溫保存。2)穩定表達DC-SIGNR的CHO細胞的黏附培養穩定表達DC-SIG服的CH0細胞2xl05，收集細胞，用結合緩衝液(20mMTris-HC12,pH8.0，15raMCaCl"1MmMgCl2,l%TritonX-100，150mMNaCl)洗滌一次，離心去上清，加入Fc-sLSECtin蛋白200W(5iVml)，冰浴60分鐘，結合緩衝液離心洗滌三次；加5(MFITC-anti-Fc(ab')2抗體(5Pg/ml)，冰浴30分鐘，結合緩衝液離心洗滌三次；細胞重懸於500W的結合緩衝液中，立即流式細胞儀分析。對照組Fc蛋白(將pIG(北京正旦國際科技有限責任公司)按照步驟l)的方法轉入CH0細胞表達得到Fc蛋白)替代Fc-sLSECtin融合蛋白，其它步驟相同。1、免疫共沉澱實驗證明LSECtin與DC-SIGNR的相互作用瞬時轉染pcDNA3.1A-DC-SIGNR和pFLAG-CMV2-LSECtin至293T細胞，30小時後裂解細胞，進行預免疫沉澱後，用anti-myc單抗免疫沉澱，anti-Flag單抗(invitrogen)和anti-myc單抗Western印記檢測，結果如圖5中A所示，單獨轉染pcDNA3.1A-DC-SIGNR和共轉染的細胞免疫沉澱產物中可以檢測到DC-SIGNR，表明免疫沉澱正確。同時在共轉染的細胞免疫沉澱產物中檢測到LSECtin，表明LSECtin能夠被DC-SIGNR免疫共沉澱。圖5中A,1、2道轉染pcDNA3.1(+)和pFLAG-CMV2，3、4道轉染pcDNA3.1A-DC-SIGNR和pFLAG-CMV2，5、6道轉染pcDNA3.1(+)和pFLAG-CMV2-LSECtin,7、8道轉染pcDNA3.1A-DC-SIGNR(pcDNA3.1A-DC-SIGNR表達的蛋白為Myc標籤的DC-SIGNR,在圖中表示為Myc-DC-SIGNR)和pFLAG-CMV2-LSECtin。Lysate代表細胞裂解物，IP代表免疫沉澱產物，IB代表immunoblotting，也稱為Westernblot;從左至右依次為泳道1、2、3、4、5、6、7、8。2、交互免疫共沉澱實驗證明LSECtin與DC-SIGNR的相互作用為了進一步排除其它幹擾因素，避免標籤抗體導致的假陽性，又進行了交互免疫共沉澱，用anti-Flag單抗免疫沉澱，anti-myc單抗和anti-Flag單抗Westernblot檢測，結果如圖5中B，表明LSECtin能夠免疫共沉澱DC-SIGNR，說明LSECtin和DC-SIGNR之間確實存在相互作用。圖5中B，7、8道轉染pcDNA3.1(+)和pFLAG-CMV2，5、6道轉染pcDNA3.1A-DC-SIG服和pFLAG-CMV2，3、4道轉染pcDNA3.1(+)和pFLAG-CMV2-LSECtin,1、2道轉染pcDNA3.1A-DC-SIGNR和pFLAG-CMV2-LSECtin。Lysate代表細胞裂解物，IP代表免疫沉澱產物，IB代表immunoblotting,也稱為Westernblot;從左至右依次為泳道1、2、3、4、5、6、7、8。3、免疫共沉澱實驗證明LSECtin與CD81的相互作用瞬時轉染pCMV-MYC-CD81(北京正旦國際科技有限責任公司)和pFLAG-CMV2-LSECtin至293T細胞，30小時後裂解細胞，進行預免疫沉澱後，用anti-flag單抗免疫沉澱，anti-flag單抗和anti-myc單抗Western印記檢測，結果如圖5中C所示，表明單獨轉染pFLAG-CMV2-LSECtin和共轉染的細胞免疫沉澱產物中可以檢測到LSECtin，表明免疫沉澱正確。同時在共轉染的細胞免疫沉澱產物中檢測到CD81,表明CD81能夠被LSECtin免疫共沉澱。圖5中C，1、2道轉染pCMV-MYC(購自Clontech公司)和pFLAG-CMV2，3、4道轉染pCMV-MYC-CD81和pFLAG-CMV2，5、6道轉染pCMV-MYC和pFLAG-CMV2-LSECtin,7、8道轉染pCMV-MYC-CD81和pFLAG-CMV2-LSECtin;Lysate代表細胞裂解物，IP代表免疫沉澱產物，IB代表immunoblotting，也稱為Westernblot;從左至右依次為泳道1、2、3、4、5、6、7、8。4、分泌型LSECtin與DC-SIGNR的細胞粘附實驗用Fc-LSECtin蛋白與穩定表達DC-SIGNR的CH0細胞株進行細胞粘附實驗，結果如圖5中D所示，Fc-LSECtin和CHO細胞當作陰性對照，檢測Fc-LSECtin結合DC-SIGNR穩定株實驗組粘附率，分別為19.66%和80.16%。表明Fc-LSECtin蛋白能夠粘附穩定表達pcDNA3.1A-DC-SIGNR的CH0細胞株，進一步證實兩者存在相互作用。圖5中D，control表示Fc-LSECtin與CH0細胞的黏附率，DC-SIGNR表示Fc-LSECtin結合穩定表達DC-SIGNR的CH0細胞株的黏附率。圖5中D的數值為3次重複實驗的平均值±標準差。5、分泌型LSECtin與CD81的細胞粘附實驗用Effectene(Qiagen)轉染試劑分別瞬時轉染0.4ugpCMV-MYC、pCMV-MYC-CD81至HEK293T細胞，24小時後收集細胞，用結合緩衝液(20mMTris-HC12,pH8.0，15mMCaCl2,IMmMgCl2,l%TritonX-100，150raMNaCl)洗滌一次，離心去上清，加入Fc-sLSECtin蛋白200W(5Pg/ml)，冰浴60分鐘，結合緩衝液離心洗滌三次；加50WFITC-anti-Fc(ab')2抗體(5Pg/ml)，冰浴30分鐘，結合緩衝液離心洗滌三次；細胞重懸於500W的結合緩衝液中，立即流式細胞儀分析。結果如圖5中E所示，Fc-LSECtin和轉染pCMV-MYC的HEK293T細胞當作陰性對照，檢測Fc-LSECtin結合轉染pCMV-MYC-CD81的HEK293T細胞實驗組粘附率，分別為8.89%和27.72%(如圖5)。表明Fc-LSECtin蛋白能夠粘附表達pCMV-MYC-CD81的HEK293T細胞，進一步證實兩者存在相互作用。圖5中E的數值為3次重複實驗的平均值士標準差。權利要求1、LSECtin在作為抗C型肝炎病毒感染藥物作用靶點中的應用。2、LSECtin在篩選抗C型肝炎病毒感染藥物中的應用。全文摘要本發明公開了LSECtin的一種新用途。該新用途是LSECtin在作為抗C型肝炎病毒感染藥物作用靶點中的應用。如LSECtin在篩選抗C型肝炎病毒感染藥物中的應用。文檔編號A61K38/16GK101152558SQ20071017552公開日2008年4月2日申請日期2007年9月30日優先權日2007年9月30日發明者麗唐,張令強,怡李,楊俊濤,蒯學章,賀福初,邢桂春,郝冰濤申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所