細胞微粒子-siRNA複合物的製備及其在愛滋病治療中的應用的製作方法

2023-07-31 21:56:41 1

細胞微粒子-siRNA複合物的製備及其在愛滋病治療中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及治療愛滋病的藥物，其在細胞微粒子上攜有抗HIV特異性的siRNA。本發明還涉及所述藥物的製備方法。
【專利說明】細胞微粒子-siRNA複合物的製備及其在愛滋病治療中的應用
[0001]分案說明
[0002]本申請是 申請人:於2010年12月9日申請的名稱為「細胞微粒子-siRNA複合物的製備及其在愛滋病治療中的應用」，申請號為201010601506.X的中國發明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0003]本發明屬於愛滋病治療藥物領域，具體採用RNA幹擾的方法進行愛滋病的治療。提供高效、特異性的siRNA及作為運送載體的細胞微粒子。兩者的複合物可以作為藥物進行愛滋病及HIV感染者的治療。
現有技術
[0004]愛滋病
[0005]愛滋病的醫學名稱為"獲得性免疫缺陷綜合症"(英文縮寫AIDS)，是一種病死率很高的嚴重傳染病。它是由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的，以T細胞免疫功能缺陷為主的一種綜合免疫缺陷病。它把人體免疫系統中最重要的T4淋巴細胞作為攻擊目標，破壞T4淋巴細胞，從而使整個人體免疫系統遭到破壞。當人體處於正常狀態時，體內免疫系統可以有效抵抗各種病毒的襲擊。一旦愛滋病病毒侵入人體體內，這種良好的防禦體系便會土崩瓦解，各種病毒乘機通過血液、破損傷口長驅直入。此外，人體內一些像癌細胞之類的不正常細胞，也會迅速生長、繁殖，最終發展成各類癌瘤。通俗地講，愛滋病病毒是通過破壞人的免疫系統和機體抵抗能力，最終導致人體喪失對各種疾病的抵抗能力而導致死亡的。`
[0006]HIV是帶有包膜的RNA逆轉錄病毒，在分類上屬逆轉錄病毒科中的慢病毒亞科，目前已發現HIV-1型和HIV-2型。HIV呈球型或卵型，直徑100-150nm，系雙層結構。病毒的核心位於病毒體的中央或偏心，核心由RNA及核衣殼蛋白質(P7、P9)、逆轉錄酶(ReverseTranscriptase,RT)、核糖核酸酶H(Ribo H)及整合酶(INT)所組成；核心外為病毒衣殼，呈20面體立體對稱，由蛋白質(P17/P18、P24/P25)組成。病毒最外層為膜蛋白。包膜上有72個刺突(Spike)，含糖蛋白gpl20，並在雙層脂質中有gP41蛋白。
[0007]愛滋病病毒侵入人體後直接侵犯人體免疫系統，攻擊和殺傷的是人體免疫系統中最重要、最具有進攻性的T4淋巴細胞，使機體一開始就處於喪失防禦能力的地位。愛滋病病毒一旦進入人體,就寄生於T4淋巴細胞內最核心的部位，並與細胞核的遺傳物質DNA整合為一體，並利用T4淋巴細胞進行自身遺傳物質的複製。病毒的繁殖和複製使免疫細胞遭到破壞和毀滅，並放出更多的病毒。新增殖病毒再感染更多的細胞。就這樣，病毒一代代地複製、繁殖，免疫細胞不斷死亡。
[0008]愛滋病通過性、血液和母嬰三種接觸方式傳播，是一種嚴重危害健康的傳染性疾病。愛滋病從發現至今不過幾十年，但它在全球所引起的廣泛流行，已使3000多萬人受到感染，1000多萬人失去了生命，世界上每天有萬餘人新感染上愛滋病病毒。
[0009]愛滋病治療現狀
[0010]目前，抗愛滋病病毒治療的藥物包括:核苷類逆轉錄酶抑制劑、非核苷類逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等。
[0011]核苷類逆轉錄酶抑制劑的作用是通過阻斷病毒RNA基因的逆轉錄，即阻斷病毒的雙股DNA的形成，使病毒失去複製的模板。這些藥物首先進入被感染的細胞，然後磷酸化形成具有活性的三磷酸化合物。AZT和d4T是病毒核酸複製天然底物脫氧胸苷dT的類似物；ddC和3TC是脫氧胞苷dC的類似物，這些雙脫氧核苷三磷酸鹽是HIV-1逆轉錄酶競爭抑制劑，當他們插入生長的DNA鏈時，可導致未成熟的DNA鏈終結，病毒DNA合成受阻並進而導致病毒複製受到抑制。
[0012]非核苷類逆轉錄酶抑制劑是一組與核苷無關，化學結構完全不同的特異性抑制HIV-1逆轉錄酶的化合物，它們不是HIV-1逆轉錄酶底物競爭抑制劑，而是通過與酶活性點附近的P66疏水區結合而抑制逆轉錄酶。
[0013]蛋白酶抑制劑是基於肽類的化合物，它們或競爭性抑制蛋白酶活性，或作為互補蛋白酶活性點的抑制劑，能抑制蛋白酶的功能，使新產生的病毒不能成熟。
[0014]目前流行的高效抗逆轉錄病毒療法，俗稱「雞尾酒療法」，是採用蛋白酶抑制劑加兩種核苷類逆轉錄酶抑制劑的方法治療感染者和病人的方法。此種藥物具有較強的抗病毒作用，經使用後可在血漿中檢測不到病毒，並可長期維持這一療效。另外，它還可以使被愛滋病病毒破壞的人類免疫功能獲得恢復或部分恢復。但是這一療法有其本身的局限性，包括治療費用高昂及副作用明顯等缺點。
[0015]幹擾核糖核酸(small`interfering RNA, siRNA)
[0016]這是一類由20多個核苷酸組成的雙鏈RNA分子，可以通過特異性降解靶基因的信使核糖核酸(messager RNA, mRNA)起到沉默基因表達的作用。這一過程被稱為RNA幹擾(RNA interference, RNAi)。
[0017]RNA幹擾是基因轉錄後調控的一種方式。siRNA可以對其靶基因進行特異性識別，並能招募被稱為沉默複合體(RNA induced silencing complex, RISC)的蛋白質複合體。RISC包含核糖核酸酶等，可以通過靶向切割同源性mRNA的方式，特異、高效地抑制基因的表達。由於使用RNA幹擾技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用於生物醫學實驗研究及各種疾病的治療領域。
[0018]目前應用RNA幹擾方法治療愛滋病已成為愛滋病治療研究的熱點，通過設計針對HIV病毒基因組的siRNA，可以特異性降解病毒基因組，從根本上殺滅病毒。研究已經證明，siRNA能有效地抑制HIV病毒在體外培養細胞中的複製。siRNA可以通過抑制HIV病毒自身基因(如口16 4&8，代^丨&丨和6鮮)或宿主基因(如HIV的主要受體CD4)達到阻止HIV感染的目的。
[0019]然而，應用siRNA治療愛滋病還存在一些有待解決的問題，包括siRNA導入效率低及siRNA的穩定性差等問題。目前，siRNA的導入主要採取載體運載或抗體偶聯的方式。載體包括脂質體、納米膠襄、環糊精包含物等，雖然這些載體可以延長藥物在體內的存留時間並一定程度上提高siRNA藥物的吸收率，但是其傳送藥物的靶向性和高效性仍然不足。雖然抗體偶聯的方式可以提高siRNA的靶向性，但siRNA在體內的穩定性得不到保證。[0020]因此，RNA幹擾方法作為治療愛滋病病人及HIV病毒感染人群的潛在藥物，目前還存在一些未解決的問題，遞送siRNA的特異性差及效率低是防妨礙其應用的主要原因。
[0021]細胞微粒子(Microvesicles)
[0022]這是是一類大小在10_500nm之間，由細胞產生(例如分泌)的、具有脂質雙層膜的生物(囊泡)結構。早在1967年就有報導，其來源於血小板，包含囊泡，當時被稱為「platelet dust」，具有促進凝結的作用。後來體外研究發現內皮細胞、血管平滑肌細胞、白細胞、淋巴細胞、紅細胞等也都能釋放(細胞)微粒子。根據微粒子產生的途徑，又可以將微粒子區分為exosomes和shedding vesicles。Exosomes是細胞在被刺激的情況下,通過多囊泡小體(Multivesicular bodies,MVBs)胞吐到細胞外的,而shedding vesicles則是直接從細胞表面以出芽的方式分泌出來的。目前，不同細胞分泌的shedding vesicles被命名為不同的名稱，比如中性粒細胞和單核細胞分泌的被稱為ectosomes，而血小板分泌的則被稱為microparticles。細胞微粒子的膜成分取決於其來源的細胞,主要由脂質和蛋白質組成。
[0023]我們研究發現細胞微粒子來源於生物體，對生物體具有高親和性，是理想的藥物用載體，可用於RNA幹擾方法中用於作為治療愛滋病人及HIV病毒感染人群中以高效、特異性地遞送siRNA。
[0024]具體地，我們發現:細胞微粒子是一種在生物體內轉運效率高，特異性強的生物囊泡載體，且不同細胞釋放的微粒子的膜表成分(包括特異性表面受體及膜脂結構)與對應細胞的質膜成分相同，因此，細胞微粒子帶有來源細胞表面特有的受體蛋白或膜脂結構，與對應的靶細胞有高親和性；同時，由於細胞微粒子中還含有siRNA發揮作用所需的重要蛋白，因此，如果採用細胞微粒子作為運送siRNA的載體，就可以高效率、選擇性地遞送siRNA到靶細胞/組織，從而大大提高siRNA調控細胞功能的作用。因此，由於細胞微粒子(包括所有具有細胞微粒子特徵的膜`脂囊泡結構，比如exosome和shedding vesicles以及針對各種細胞分泌的shedding vesicles的特稱)可以提高siRNA運輸的特異性、祀向性和穩定性；以及可以促進siRNA作用效果等優點，能夠有效用於愛滋病的治療中。
[0025]因此，本發明提供一種應用細胞微粒子運送針對HIV病毒基因組的siRNA的方法。本發明還涉及細胞微粒子-抗HIV特異性siRNA的複合物，其製備方法，及其在治療愛滋病及HIV感染者等方面的應用。

【發明內容】

[0026]本發明提供一種治療愛滋病的藥物複合物，可用於有效輸送治療愛滋病的藥物。所述藥物複合物為siRNA和細胞微粒子的複合物，包括針對HIV病毒基因組的siRNA以及作為載體的細胞微粒子；
[0027]所述HIV病毒包括HIV-1及HIV-2兩種類型。
[0028]優選的，所述HIV病毒為HIV-1型病毒。
[0029]所述siRNA包括所有能針對HIV基因組，並能導致HIV基因組特異性降解的siRNA序列。
[0030]優選的，所述siRNA序列為下列序列的一種或多種:
[0031 ] I) HIV-Gl:GCCCTTCAGACAGGATCAGAA[0032]2 ) HIV-G2:AAGCAGCCATGCAAATGTTAA
[0033]3 ) HIV-G3:TCCCAGTAGGAGAAATCTATA
[0034]4 ) HIV-G4:GCAAGCTTCACAGGAGGTAAA
[0035]5) HIV-Tl:AGATCCTAGACTAGAGCCCTG
[0036]6 ) HIV-T2:TGGAAGCATCCAGGAAGTCAG
[0037]7 ) HIV-T3:GCATCCAGGAAGTCAGCCTAA
[0038]8 ) HIV-T4:TCAAAGCAACCCACCTCCCAA
[0039]所述細胞微粒子包括各種大小在10_500nm之間、由細胞分泌，例如以出芽或胞吐形式分泌的、具有脂質雙層膜的天然生物囊泡，包括被稱為exosome、shedding vesicles的結構以及各種細胞分泌的shedding vesicles。
[0040]所述細胞微粒子與siRNA以包裹與被包裹的關係存在；
[0041]所述細胞微粒子-siRNA複合物為表達有siRNA的宿主細胞分泌產生；
[0042]所述宿主細胞包括現有所有細胞系、 細胞株、以及正常人或疾病患者自身組織/細胞的原代培養物。
[0043]本發明還提供一種製備上述細胞微粒子-siRNA複合物藥物的方法。
[0044]所述複合物藥物包括針對HIV病毒基因組的siRNA以及作為載體的細胞微粒子；
[0045]所述製備藥物的方法包括將siRNA導入宿主細胞及從細胞中提純出載有siRNA的細胞微粒子的步驟。
[0046]所述將siRNA導入宿主細胞的方法包括:1)應用脂質體轉染人工合成的成熟體siRNA ；2)應用脂質體或電轉染方法，轉染攜帶siRNA表達序列的病毒載體或質粒；以及3)建立siRNA永久表達細胞株等三種方法。
[0047]優選的，應用脂質體轉染人工合成的成熟體siRNA的方法包括以下步驟:
[0048]I)設計針對HIV病毒基因組的siRNA序列；
[0049]所述siRNA包括所有能針對HIV基因組，並能導致HIV基因組特異性降解的siRNA序列。設計方法參見本領域常規技術方法。優選的，所述siRNA序列為下列序列的一種或多種:
[0050]1.HIV-Gl:GCCCTTCAGACAGGATCAGAA[0051 ] i1.HIV-G2:AAGCAGCCATGCAAATGTTAA
[0052]ii1.HIV-G3:TCCCAGTAGGAGAAATCTATA
[0053]iv.HIV-G4:GCAAGCTTCACAGGAGGTAAA
[0054]V.HIV-Tl:AGATCCTAGACTAGAGCCCTG
[0055]v1.HIV-T2:TGGAAGCATCCAGGAAGTCAG
[0056]vi1.HIV-T3:GCATCCAGGAAGTCAGCCTAA
[0057]vii1.HIV-T4:TCAAAGCAACCCACCTCCCAA
[0058]2)依照設計好的序列人工合成siRNA ；
[0059]3)應用脂質體將siRNA導入細胞內。
[0060]優選的，應用脂質體或電穿孔轉染法，轉染攜帶siRNA表達序列的病毒載體或質粒的方法包括以下步驟:
[0061]I)設計針對HIV病毒基因組的siRNA表達序列；[0062]所述表達序列包括任一種或多種針對HIV基因組的siRNA的反向互補序列。
[0063]I)依照設計好的序列人工合成表達序列；
[0064]2)將表達序列插入到適合其表達的病毒載體或質粒中；
[0065]3)將重組的病毒載體或質粒應用脂質體或電轉染方法，導入宿主細胞內；
[0066]4)使siRNA表達載體在細胞內表達siRNA。
[0067]優選的，建立siRNA永久表達細胞株的方法包括:
[0068]I)設計針對HIV病毒基因組的siRNA表達序列；
[0069]2)構建siRNA表達載 體；優選的，所述載體為慢病毒載體；
[0070]3)對於測序正確的重組質粒，提取和純化高質量的不含內毒素的重組質粒；
[0071]4)使用高效重組載體(脂質體)和重組質粒共轉染293T細胞，進行病毒包裝和生產，收集病毒液；
[0072]5)濃縮、純化病毒液；
[0073]6 )採用GFP螢光法檢測病毒滴度；
[0074]7)用高質量的病毒液感染宿主細胞；
[0075]8)檢測基因功能或者siRNA的沉默效率；
[0076]9)使用抗生素進行穩定轉染細胞株的篩選；
[0077]10)採用單克隆培養，建立永久表達的轉基因單克隆細胞株。
[0078]所述宿主細胞包括現有所有細胞系、細胞株、以及正常人或疾病患者自身組織/細胞的原代培養物。
[0079]所述提純載有siRNA的細胞微粒子的方法包括以下步驟:
[0080]I)收集siRNA導入後的細胞的培養液；
[0081]2)採用一定方法分離提純其中的細胞微粒子。
[0082]所述提純細胞微粒子的方法包括差速離心法、免疫吸附法及超濾法中的一種或多種。
[0083]優選地，所述製備方法為差速離心法，例如包括以下步驟的差速離心法:(I)先將細胞或組織於300g離心5分鐘，取上清；(2)將上清於1500g離心20分鐘，取上清；(3)將上清於1000Og離心30分鐘，取上清。(4)將上清於IlOOOOg離心70分鐘，取沉澱即為細胞
微粒子。
[0084]或者優選地，所述製備方法為免疫吸附法，例如包括以下步驟的免疫吸附法:(I)先將細胞或組織於3000轉/分鐘下離心30分鐘，取上清；(2)將吸附在組織培養皿上的細胞特異性的抗體或免疫磁珠與上清溫育30~60分鐘，回收被吸附的細胞微粒子。
[0085]或者優選地，所述製備方法為超濾法，例如包括以下步驟的超濾法:⑴先將細胞或組織於3000轉/分鐘下離心30分鐘，取上清；(2)將上清放入帶有一定孔徑濾膜的濃縮離心管，於4000轉/分鐘進行離心，濃縮即得。
[0086]本發明還提供一種該複合物藥物在愛滋病及HIV病毒攜帶者治療中的應用。
[0087]用本發明的藥物複合物治療愛滋病或HIV病毒攜帶者可以採用以下方法實現:
[0088]I)將上述複合體藥物注入受體或加入受體細胞；
[0089]2)通過siRNA介導的沉默作用阻斷HIV病毒的擴張；
[0090]3)任選地，檢測HIV病毒含量的變化，即複合藥物治療愛滋病的效果；[0091]所述受體包括愛滋病患者和/或HIV病毒感染者。
[0092]所述受體細胞包括所有被HIV感染的細胞系、細胞株、以及愛滋病患者及HIV感染者自身組織/細胞的原代培養物。
[0093]所述檢測HIV含量的方法包括病毒核酸檢測法、P24抗原檢測法等。
[0094]優選的，所述病毒核酸檢測方法為應用螢光實時定量PCR法(Real-time PCR)檢測HIV病毒核酸含量。具體包括以下步驟:1)提取病毒RNA ;2)對HIV RNA進行逆轉錄(RT)，然後對其產物cDNA進行PCR擴增。根據PCR反應中的得到的CT值，推導出最初參與反應的病毒cDNA的模板數，進而得到病毒含量。
[0095]優選的，P24抗原檢測法為應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測P24抗原:通常採用夾心法ELISA，即將純化的已知抗體包被在固相反應板孔底，當加入待測血清後，若血清中含有p24抗原，則與包被抗體形成抗原-抗體複合物，再加入酶(HRP)標記的抗體，加底物顯色後，在酶標儀上檢測反應產物的吸光度(0D值)。由於在一定範圍內，OD值的大小和P24抗原的含量成線性相關，因此OD值就可以直觀反映病毒含量的多少。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0096]圖1 一例瞬時表達載體的結構圖。
[0097]圖2 —例永久表達載體的結構圖。
[0098]圖3電子顯微鏡下觀察細胞微粒子。
[0099]圖4轉染過螢光標記的siRNA的293T細胞。
`[0100]圖5流式細胞方法檢測的細胞微粒子-siRNA複合體。
[0101]圖6複合物藥物和相應對照對假病毒的影響。
[0102]圖7八種siRNA序列對應的複合物藥物對假病毒的抑制率。
[0103]圖8複合物藥物HIV-T3對HIV病毒的抑制率。
實施例
[0104]可以理解的是，在此描述的特定實施方式通過舉例的方式來表示，其並不作為對本發明的限制。在不偏離於本發明範圍的情況下，本發明的主要特徵可以用於各種實施方式。本領域的技術人員將會意識到或能夠確認，使用常規實驗，許多等同物都能應用於本文所描述的特定步驟中。這些等同物被認為處在本發明的範圍之內，並且被權利要求所覆蓋。
[0105]實施例1轉染人工合成的siRNA成熟體
[0106]本實施例將人工合成的成熟體siRNA轉染進入細胞，具體包括以下步驟:
[0107]I)設計針對HIV-1病毒基因組的siRNA序列，具體地，我們針對HIV-1基因組的gag和tat基因的保守區域設計了 8條幹擾RNA序列:
[0108]HIV-Gl:GCCCTTCAGACAGGATCAGAA
[0109]HIV-G2:AAGCAGCCATGCAAATGTTAA
[0110]HIV-G3:TCCCAGTAGGAGAAATCTATA
[0111]HIV-G4:GCAAGCTTCACAGGAGGTAAA
[0112]HIV-Tl:AGATCCTAGACTAGAGCCCTG
[0113]HIV-T2:TGGAAGCATCCAGGAAGTCAG[0114]HIV-T3:GCATCCAGGAAGTCAGCCTAA
[0115]HIV-T4:TCAAAGCAACCCACCTCCCAA
[0116]2)人工合成上述成熟體siRNA。
[0117]3)應用脂質體(採用脂質體 Lipofectamine2000(Invitrogen,美國)將 siRNA轉染進入胚腎上皮細胞系293T細胞(美國標準菌種收藏所，American Type CultureCollection, ATCC),具體方法如下:
[0118](1) 293T細胞培養在添加了 10%胎牛血清(Gibco，美國)的高糖DMEM培養基(Gibco,美國)中，5%C02、37°C培養。
[0119](2)將 30 μ I lipofectamine2000 和 600pmol 的陰性對照 siRNA(隨機合成的非特異性siRNA序列)分別與Iml OPT1-MEM(Gibco,美國)混合，形成混合物A和混合物B，室溫下放置5min。
[0120](3)將 30 μ I Iipofectamine2000 和 600pmol 的 siRNA 分別與 ImlOPT1-MEM(Gibco,美國)混合，形成混合物C和混合物D，室溫下放置5min。
[0121](4)將混合物A和混合物B混合，生成混合物E，放置20min。
[0122](5)將混合物C和混合物D混合，生成混合物F，放置20min。
[0123](6)將混合物E和F分別加入對照組和實驗組細胞中，補足OPT1-MEM到15ml。5%C02、37°C 培養。
[0124](7)6小時後更換成`正常培養液。
[0125](8) 24h~48h後轉染結束，收集樣品。
[0126]實施例2轉染針對HIV病毒基因組的siRNA的瞬時表達載體
[0127]本實施例採用分子生物學方法構建siRNA的瞬時表達載體，用於在培養細胞內表達siRNA,具體包括以下步驟:
[0128]I)設計實施例1中針對HIV病毒基因組的siRNA的表達序列；
[0129]2)人工合成上述siRNA表達序列，並將合成的序列插入到siRNA真核表達載體pcDNA6.2GW/EmGFP-miR(invitrogen美國)中，構建重組載體。表達載體的結構示意圖如圖1所示；
[0130]3)將重組載體採用脂質體法或電穿孔轉染法轉染進入宿主細胞293T細胞(美國典型培養物保藏中心，American Type Culture Collection, ATCC)。
[0131]脂質體轉染法的具體步驟包括:(1)轉染前24h，用胰蛋白酶消化收集處於對數生長期的細胞，細胞加入12孔板內，每個孔內加2ml已調整好濃度的細胞懸液，使每個孔內細胞數為3X105個，37°C，5% CO2培養箱孵育；(2)24h後細胞密度達80%左右，可以用來轉染；(3)按照Lipo_fectamine2000脂質體使用說明書，取3.0 μ g用於轉染的載體加入100 μ I無血清、無抗生素的Opt1-MEM液,輕輕混勻；(4)取2 μ I脂質體加入100 μ IOpt1-ΜΕΜ,輕輕混勻，室溫下孵育5min ； (5)將稀釋的質粒和稀釋的Lipofectamine2000混合，輕輕混勻，室溫下孵育20min ； (6)將混合物加到12孔板的每個孔內，每個孔內加入混合物的體積為100 μ I，輕輕混勻；(7) 37V,5% CO2培養箱孵育4~6h後將含有脂質體和質粒的培養液換掉，代之以含有10%胎牛血清的DMEM培養液，置於37°C，5% CO2，培養箱孵育；
(8)利用倒置螢光顯微鏡觀察綠色螢光蛋白的表達，計數細胞的轉染效率為80%。
[0132]電穿孔轉染法的具體步驟包括:(I)細胞生長到對數期，用胰酶消化，4°C，1000g離心5min ； (2)用0.5倍體積的電穿孔液重懸細胞，細胞密度調至3 X IO6細胞/毫升；(3)將400 μ I的細胞懸液(IO6-1O7細胞)內加入30 μ I的載體DNA，用吸管將細胞和DNA輕輕混勻；(4)將混合物加入電轉化池中，冰浴。將電轉化池移至電極間放電，I~2min後，取出電轉化池，冰浴，立即進行下一步操作；(5)用滅菌的吸頭將電穿孔的細胞轉移至培養皿中，加入細胞完全培養液，置於含5% C02、37°C培養箱孵育，用於轉染效率觀察；(6)利用倒置螢光顯微鏡觀察綠色螢光蛋白的表達，並計數細胞的轉染效率，為75%。
[0133]實施例3建立能夠永久表達siRNA的轉基因細胞株
[0134]為了得到穩定表達的，針對HIV病毒基因組的siRNA，本實施例通過構建siRNA永久表達載體,將其轉染進入宿主細胞，同時通過篩選,選擇載體插入到宿主細胞基因組的永久表達克隆，將其單克隆培養，從而建立能永久表達siRNA的轉基因細胞株。
[0135]具體步驟包括:
[0136]I)人工合成實施例1中針對HIV病毒基因組的siRNA的表達序列；
[0137]2)構建慢病毒載體:將人工合成的序列分別插入慢病毒載體pLenti6.3/V5-DEST (invitrogen,美國)，構建重組載體。載體結構示意圖如2所示；
[0138]3)慢病毒包裝:將重組載體轉染293T細胞，包裝病毒。具體包括以下步驟:1.293T細胞的培養；2.將合適數量的細胞接種入4X IOcm培養皿，過夜培養；3.用包裝質粒(Invitrogen,美國)和病毒載體共轉染；4.換液,繼續培養；5.收集病毒液；2000g,離心IOmin去細胞及碎片，並過0.45 μ m濾膜,獲得病毒原液，濃縮病毒液，重懸於400 μ I培養基。6.病毒活性滴度的測定:將ΗΕΚ293細胞接種96孔板，梯度稀釋病毒液，加入ΗΕΚ293細胞中，72小時後觀察帶GFP螢光細胞，計算病毒活性滴度。ΗΕΚ293細胞採用添加了 10%胎牛血清的DMEM培養基(Gibco，美國)，在5%C02，37°C下培養。
[0139]4)病毒侵染及單克隆陽性克隆篩選。具體包括以下步驟:1.培養293T細胞至對數期；2.將合適數量的細胞接種入培養皿，過夜培養；3.用前期製備的慢病毒侵染293T細胞；4.換液，繼續培養；5.加抗性篩選(必要時採用流式分選陽性細胞)；挑多個單克隆篩選陽性克隆；6.擴增細胞至足夠數量。
[0140]實施例4分離純化載有siRNA的細胞微粒子
[0141]細胞內的siRNA可以被細胞分泌的細胞微粒子包裹，近而分泌到細胞外。通過收集細胞培養液，經過一系列的分離純化，就可以得到載有siRNA的細胞微粒子，即細胞微粒子-siRNA複合物。
[0142]本實施例分別採用以下方法分離已轉入siRNA的細胞分泌出的載有siRNA的細胞微粒子:
[0143](I)差速離心法:先將培養細胞依次通過300g、1500g及1000Og離心，除去各類細胞及碎片，然後將上清超速離心110 OOOg離心70分鐘，取沉澱便是細胞分泌的載有SiRNA的細胞微粒子。
[0144](2)免疫吸附法:將細胞特異性的抗體吸附在組織培養皿上或直接
[0145]用免疫磁珠，將除去各類細胞及碎片後的血清/血漿或細胞培養液直接和培養皿或免疫磁珠溫育(30分鐘或I小時)，不同細胞的細胞微粒子可直接被吸附和回收。
[0146](3)過濾法:將除去各類細胞及碎片後的血清/血漿或細胞培養液直
[0147]接放在帶有100KD濾膜的濃縮離心管，在4 000轉/分鐘進行離心，細胞微粒子將留在離心管內被濃縮獲得。
[0148]將分離得到的細胞微粒子在透射電鏡下觀察，具體包括:細胞微粒子沉澱用2.5%戊二醛固定液在4°C固定過夜，PBS漂洗三遍，每遍10分鐘。之後用1%的四氧化鋨室溫固定60分鐘。固定後的樣品用10%的明膠包埋，然後在4°C用戊二醛再固定後，將樣品切成小塊(體積小於I立方毫米)。樣品用依次增高濃度的乙醇溶液脫水(30%，50%, 70%, 90%, 95%和100%X3)。用環氧樹脂浸透包埋後，用Leica UC6超薄切片機切片，最後用FEI TecnaiT20透射電子顯微鏡在120kV條件下觀察。
[0149]採用差速離心法分離得到的細胞微粒子的透射電鏡圖如圖3所示，顯示從培養細胞中分離到的細胞微粒子大小不一，分布在10-500nm範圍。
[0150]實施例5細胞微粒子及其載有的siRNA組成的藥物複合物的檢定
[0151]本實施例通過一系列方法檢定細胞微粒子及其載有的siRNA組成的藥物複合物的存在。
[0152]I)通過實施例1所述方法將突光標記的siRNA轉染入細胞。結果如圖4所示,在螢光顯微鏡下觀察可見螢光標記的siRNA(箭頭所指亮點)已經轉染進入細胞。
[0153]2)通過實施例4所述方法分離鑑定轉染過螢光標記的siRNA的供體細胞分泌的細胞微粒子。結果如圖3所示，可見分離得到的細胞微粒子從形態、大小、膜結構等方面均符合細胞微粒子的特點(所述特點參見:Thery, C.，Zitvogel, L.，and Amigorena, S.(2002).Exosomes: composition, biogenesis and function.Nat Rev Immunol2, 569-579.Cocucci，E.，RacchettijG.&Meldolesi，J.Shedding microvesicles: artefacts no more.TrendsCell Bioll9，43-51(2009))。
[0154]3)通過流式細胞`方法檢測分離純化並鑑定為細胞微粒子的顆粒中是否包裹有siRNA，即是否組成了細胞微粒子-siRNA複合物，結果如圖5所示。由於siRNA是被螢光標記的，如果細胞微粒子中含有siRNA，那麼，細胞微粒子也一定能被螢光標記。因此，我們採用流式細胞方法檢測細胞微粒子所帶的螢光狀況。由圖5可見，有大量細胞微粒子攜帶有螢光(圖5豎線以右部分)，證明細胞微粒子中包裹有siRNA，也即證明了細胞微粒子-siRNA藥物複合物的存在。
[0155]實施例6應用細胞微粒子-siRNA複合物藥物在體外抑制HIV假病毒
[0156]HIV假病毒為用其他低危害病毒外殼蛋白包裹HIV病毒基因組而構成的模擬HIV病毒作用方式，但危害性遠遠降低的仿HIV病毒。一般製造HIV假病毒的方法包括:構建表達HIV基因的重組表達質粒和表達其他低危害病毒，如皰疹性口炎病毒的殼G糖蛋白基因的重組表達質粒，將兩種質粒共轉染哺乳動物細胞，獲得假型慢病毒。
[0157]本實施例通過檢測細胞微粒子-SiRNA複合物藥物對於HIV假病毒的抑制作用，為複合物藥物對愛滋病的治療效果提供支持。
[0158]具體實驗步驟包括:1)按照實施例3的方法構建永久表達siRNA的轉基因細胞株；2)按照實施例4的方法分離純化轉基因細胞分泌的載有siRNA的細胞微粒子，即細胞微粒子-siRNA複合物；3)將複合物藥物加入到感染了 HIV假病毒的Hela(CD4-LTR/β-Gal)細胞(美國典型培養物保藏中心，American Type Culture Collection, ATCC)中。Hela細胞採用添加了 10%胎牛血清的高糖DMEM培養基(Gibco，美國)，在5%C02，37°C下培養；4)檢測病毒滴度，分析複合物藥物對HIV假病毒的抑制作用。[0159]結果如圖6所示，縱坐標顯示了 HIV假病毒在293T細胞中的含量。將完全不加病毒的空白細胞作為對照(橫軸I代表的柱子)，將其值設為I ;單加入病毒而不採取任何治療措施的細胞(橫軸2代表的柱子)中的假病毒含量是對照細胞的16倍多。然而，加入細胞微粒子-SiRNA複合物藥物作為治療手段，宿主細胞內的假病毒含量就大量減少。從結果可見，加入藥物(橫軸5、6代表的柱子)後,宿主細胞內的假病毒已降低到40%左右(橫軸6代表的柱子)。更重要的是，增加藥物的用量(橫軸5代表的柱子)，宿主細胞內的HIV假病毒甚至被完全抑制，HIV假病毒的含量下降到和不加假病毒組(橫軸I代表的柱子)相同的水平。
[0160]另外，為了確定細胞微粒子-s i RNA複合物藥物對HIV假病毒的抑制作用是由於siRNA，而不是細胞微粒子造成的，我們還向HIV假病毒感染的宿主細胞中轉入了不含SiRNA的細胞微粒子作為另一個對照(橫軸3代表的柱子)。從結果可以看出，僅細胞微粒子無法對HIV假病毒產生抑制作用，也證明了產生病毒抑制作用不是細胞微粒子而是siRNA本身。
[0161]同時，我們還加入了一種短肽類的抗愛滋病藥物作為陽性對照(橫軸4代表的柱子)。由結果可以看出，這種藥物也只能將HIV假病毒含量降低到50%左右。因此，可以看出細胞微粒子-siRNA複合物藥物與常規治療愛滋病的藥物相比，其作用效率更高，抑制假病毒的效果更好。
[0162]實施例1中所有8種siRNA序列對應的複合體藥物對HIV假病毒的抑制效果如圖7所示。由圖可見，所有藥物對HIV假病毒的抑制率都達到60%以上，有的甚至達到86%。同時，所有藥物對假病毒的抑制率都隨著藥物濃度的降低而下降。 [0163]這一結果證明了，本實施例中8種細胞微粒子-siRNA複合物藥物對HIV假病毒有非常強的抑制作用，同時這一作用是濃度依賴性的，並不是偶然和隨機的現象。
[0164]實施例7應用細胞微粒子-siRNA複合物藥物在體外抑制HIV-1病毒
[0165]本實施例檢測了 siRNA序列HIV-T3對應的複合物藥物對HIV-1病毒的抑制作用。
[0166]具體實驗步驟包括:1)按照實施例3的方法構建永久表達siRNA序列HIV-T3的轉基因細胞株；2)按照實施例4的方法分離純化轉基因細胞分泌的載有siRNA的細胞微粒子，即細胞微粒子-siRNA複合物；3)將複合物藥物加入到感染了 HIV-1病毒的T細胞白血病細胞系Jurkat細胞(ATCC)中，Jurkat細胞採用添加了 10%胎牛血清的1640培養基(Gibco，美國)，在5%C02，37°C下培養；4)檢測病毒滴度，分析複合物藥物對HIV病毒的抑制作用。
[0167]結果如圖8所示。由結果可見，siRNA序列HIV-T3對應的複合物藥物對HIV-1病毒有非常強的抑制作用。當加入藥物原液時(橫軸I所對應的柱子)，藥物對HIV-1病毒的抑制率可以達到95.95%，而當藥物以2倍梯度稀釋(橫軸2-6對應的柱子)時，其對HIV-1病毒的抑制率也隨之降低。
[0168]本結果更進一步證明了細胞微粒子-siRNA複合物藥物在細胞外對HIV病毒的抑制作用，為該藥物的後期開發奠定了基礎。
[0169]根據上述方法，本發明人證明上述細胞微粒子-siRNA複合物可以作為藥物，對HIV病毒起到抑制作用。其作用原理為:針對HIV病毒基因組的siRNA可以通過細胞微粒子高效、特異性的進入受到HIV病毒感染的靶細胞，通過siRNA介導的，對病毒基因組特異性的切割作用，從而起到抑制病毒的作用。
[0170]運用siRNA進行疾病治療的優勢在於:siRNA是通過和其靶基因配對作為識別信號，招募沉默複合體對其目的基因進行特異性切割而發揮作用的。siRNA藥物作用的靶點只有其靶基因，而不會干擾生物體內其他基因的正常表達，因此，其具有較高的特異性和較小的副作用。應用siRNA治療愛滋病更具有其特有的優勢，由於HIV病毒基因組為外源進入人體的核糖核酸，因此，siRNA藥物對HIV病毒的抑制完全不會影響到人體其他細胞的正常生理功能，因此不會對人體造成傷害。
[0171]同時，應用細胞微粒子作為載體運送siRNA的優勢在於:首先，細胞微粒子來源於細胞，是生物體本身存在的，從而可以克服目前人工合成的藥物載體對細胞的毒性以及對身體的損害；其次，將siRNA包裹進入細胞微粒子的過程中所應用的各種技術手段都很容易實現，同時包裹效率很高，這在一定程度上加大了其實際應用的潛力；更重要的是細胞微粒子是具有雙層質膜結構的囊泡結構，外膜和細胞質膜結構類似，可以通過和細胞膜融合、胞吞作用進入細胞。同時，由於細胞微粒子也攜帶有一些有助於RNA幹擾作用的蛋白質，因此可以提高siRNA的作用效率。如果應用病人自身組織或細胞的原代培養物分泌的細胞微粒子包裹siRNA還可減少免疫排斥並進一步提高細胞微粒子攜帶siRNA進入生物體的效率。基於以上優勢 ，細胞微粒子作為載體運送siRNA作為藥物將會在藥物開發及臨床疾病的預防和治療中起到重要的作用。
【權利要求】
1.細胞微粒子-抗Hiv特異性SiRNA的複合物，其中抗HIV特異性siRNA的序列選自:

2.根據權利要求1的複合物，其中所述細胞微粒子來自人或動物的供體細胞。
3.根據權利要求2的複合物，其中所述供體細胞包括:細胞系、原代細胞培養物。
4.根據權利要求2的複合物，其中所述細胞微粒子為生物囊泡結構。
5.根據權利要求1的複合物，其中抗HIV特異性siRNA包裹於細胞微粒子中。
6.根據權利要求1的複合物，其中細胞微粒子的平均粒徑為10-500納米。
7.權利要求1所述的細胞微粒子-抗HIV特異性siRNA的複合物在製備用於治療愛滋病或HIV感染的藥物中的用途。
8.一種藥物組合物，包括權利要求1-6中任一項所述的細胞微粒子-抗HIV特異性siRNA複合物。
9.製備權利要求1-6中任一項所述的細胞微粒子-抗HIV特異性siRNA複合物的方法，包括下列步驟: 將抗HIV特異性siRNA轉入細胞，優選應用轉染成熟體siRNA方法或轉染siRNA瞬時表達載體方法或建立siRNA永久表達細胞株方法； 分離細胞微粒子-抗HIV特異性siRNA複合物。
10.權利要求12的方法，其中通過選自差速離心法、免疫吸附法和超濾法中的一種或多種分離所述的細胞微粒子-抗HIV特異性siRNA複合物。
11.權利要求1-6中任一項所述的細胞微粒子-抗HIV特異性siRNA複合物在製備治療患有愛滋病的受體的藥物中的用途，其中所述受體包括愛滋病患者或HIV病毒感染者。
12.根據權利要求11的用途，所述受體的細胞包括被HIV感染的細胞系或細胞株或愛滋病患者及HIV感染者自身組織/細胞的原代培養物。
【文檔編號】A61K48/00GK103757001SQ201310714823
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2010年12月9日 優先權日:2010年12月9日
【發明者】張辰宇, 曾科, 顧宏偉, 曹鳴輝, 李麗明 申請人:江蘇命碼生物科技有限公司