一種超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法與流程
2023-08-01 00:50:36
本發明涉及植物轉基因技術領域，具體為一種超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法。
背景技術：
轉基因技術能夠使優良基因跨物種交流，從而實現對農作物的品質和產量等性狀進行定向、精確的改良。轉基因作物在產量、抗逆性和營養品質等方面較傳統作物有顯著改進，還能大大降低生產成本，減少農作物生產中的環境汙染。但目前大面積應用到農業中的轉基因作物只有玉米、油菜、大豆、棉花、和番茄等少數幾種作物，對絕大多數植物而言，轉基因技術只停留在實驗室階段。目前植物轉基因研究主要採用的方法都需要經過繁複的植物組培過程，需要花費大量的人力、物力、財力和時間。一些植物種或品種的組織培養再生困難而使得這兩種方法具有很大的基因依賴性，因而受到很大的局限性。同時由於植物組織培養過程中易造成細胞變異、再生苗移栽過程夭亡等，使得本已不高的轉化率又大打折扣，這些缺陷都大大限制了植物轉基因技術的廣泛應用。為此，我們提出了一種超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法投入使用，以解決上述問題。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法，以解決上述背景技術中提出的問題。
為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法，該超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法的具體步驟如下：
s1：選用具有增產潛力的芝麻品種作為基礎材料，早晨7-8點採集當天開放的芝麻花朵，然後用鑷子取下雄蕊，置於潔淨的紙上，輕壓後收集花粉，將收集的新鮮花粉於冰箱4℃保存備用；
s2：用滴管在凹玻片上的凹穴內滴加配好的緩衝液，用棉棒挑少許花粉均勻撒於緩衝液上，讓其自然散開懸浮於緩衝液表面，撒好後將玻片放入鋪有溼濾紙的培養皿中加蓋並將其置於30℃的人工氣候箱中培養，6小時後，在光學顯微鏡下觀察、記錄花粉萌發及破碎情況；
s3：供試菌種lba4404農桿菌保存於15％的甘油中，使用前提前兩天用接種環挑取少許農桿菌菌種劃線接種於附加有50mg/l卡那黴素(km)的yp固體培養基上培養活化；從培養平板上挑取農桿菌菌落接種到yp和50mg/l卡那黴素(km)的液體培養基中,並於28℃、210r/min下振蕩培養至對數期，然後用鹼裂解法提取質粒dna；
s4：將步驟s3中的質粒dna混入步驟s2中的緩衝液中，進行超聲波處理，理後的花粉懸浮液分裝於0.2ml的eppendorf管中，每一株選取主莖上的1-2個在當天即將開放的花蕾，將其花冠取下，人工去雄，將柱頭充分浸入處理後的花粉懸浮液中授粉，然後再將花冠戴上；
s5：然後摘除附近的其它花蕾和分枝，並掛牌標註授粉時間和花蕾數，授粉全部結束之後打頂，並每周一次去除分枝和其它未經轉化處理的花蕾和果實，直至秋季檢查授粉結實情況，統計、收穫代種子；
s6：將收穫的代種子隨大田試驗播種，得到代植株，待代植株代苗齡達3、4片真葉時，用濃度為100mg/ml的卡那黴素第一次塗抹芝麻葉片(頂部的2片葉)進行篩選，將葉片上出現明顯的大面積蟲斑和死亡的植株去除；
s7：待苗齡到8、9片真葉時，用濃度為120mg/ml的卡那黴素進行第二次田間篩選，將葉片上不出現蟲斑和僅出現不明顯小面積零星蟲斑的植株拴牌標記，並採集新鮮葉片保存於-70℃下，以備提取基因組dna；
s8：對提取的基因組dna做轉化植株的分子鑑定、pcr特異性擴增、斑點雜交和southernblot檢測，並進行掃描照相、保存。
優選的，所述不步驟s2中，在將少許花粉撒於緩衝液上時不必攪拌，以防花粉混於液體中因缺氧而影響萌發。
優選的，所述步驟s2中，緩衝液為蔗糖溶液、硼酸溶液和氯化鈣溶液的混合液。
優選的，所述步驟s3中，yp固體培養基中每升培養基含5g酵母提取物、10g蛋白腖、5g氯化納和15g瓊脂，調ph至6.8高壓滅菌。
優選的，所述步驟s5中，人工授粉時間為上午的10:00-12:00。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明不需要費時費力的組織培養過程，轉化方法簡便易操作，且能夠直接得到轉化的種子，轉化率較高，理論上適用於任何開花植物，是一種經濟、高效、實用的基因轉化技術，對於一些再生體系建立不完全的植物，具有尤其重要的意義。
具體實施方式
下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
本發明提供一種技術方案：一種超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法，該超聲波輔助花粉介導植物轉基因方法的具體步驟如下：
s1：選用具有增產潛力的芝麻品種作為基礎材料，早晨7-8點採集當天開放的芝麻花朵，然後用鑷子取下雄蕊，置於潔淨的紙上，輕壓後收集花粉，將收集的新鮮花粉於冰箱4℃保存備用；
s2：用滴管在凹玻片上的凹穴內滴加配好的緩衝液，用棉棒挑少許花粉均勻撒於緩衝液上，讓其自然散開懸浮於緩衝液表面，撒好後將玻片放入鋪有溼濾紙的培養皿中加蓋並將其置於30℃的人工氣候箱中培養，6小時後，在光學顯微鏡下觀察、記錄花粉萌發及破碎情況，在將少許花粉撒於緩衝液上時不必攪拌，以防花粉混於液體中因缺氧而影響萌發，緩衝液為蔗糖溶液、硼酸溶液和氯化鈣溶液的混合液；
s3：供試菌種lba4404農桿菌保存於15％的甘油中，使用前提前兩天用接種環挑取少許農桿菌菌種劃線接種於附加有50mg/l卡那黴素(km)的yp固體培養基上培養活化；從培養平板上挑取農桿菌菌落接種到yp和50mg/l卡那黴素(km)的液體培養基中,並於28℃、210r/min下振蕩培養至對數期，然後用鹼裂解法提取質粒dna，yp固體培養基中每升培養基含5g酵母提取物、10g蛋白腖、5g氯化納和15g瓊脂，調ph至6.8高壓滅菌；
s4：將步驟s3中的質粒dna混入步驟s2中的緩衝液中，進行超聲波處理，理後的花粉懸浮液分裝於0.2ml的eppendorf管中，每一株選取主莖上的1-2個在當天即將開放的花蕾，將其花冠取下，人工去雄，將柱頭充分浸入處理後的花粉懸浮液中授粉，然後再將花冠戴上；
s5：然後摘除附近的其它花蕾和分枝，並掛牌標註授粉時間和花蕾數，授粉全部結束之後打頂，並每周一次去除分枝和其它未經轉化處理的花蕾和果實，直至秋季檢查授粉結實情況，統計、收穫代種子，人工授粉時間為上午的10:00-12:00；
s6：將收穫的代種子隨大田試驗播種，得到代植株，待代植株代苗齡達3、4片真葉時，用濃度為100mg/ml的卡那黴素第一次塗抹芝麻葉片(頂部的2片葉)進行篩選，將葉片上出現明顯的大面積蟲斑和死亡的植株去除；
s7：待苗齡到8、9片真葉時，用濃度為120mg/ml的卡那黴素進行第二次田間篩選，將葉片上不出現蟲斑和僅出現不明顯小面積零星蟲斑的植株拴牌標記，並採集新鮮葉片保存於-70℃下，以備提取基因組dna；
s8：對提取的基因組dna做轉化植株的分子鑑定、pcr特異性擴增、斑點雜交和southernblot檢測，並進行掃描照相、保存。
表1不同蔗糖濃度對花粉萌發的影響
請參閱表1，在最適緩衝液的選擇過程中，直接將花粉與質粒dna溶液混合，花粉在溶液中極易吸脹破裂，失去生活力，因此必須選擇含有適當溶質的溶液，以維持花粉粒正常的膨壓。一般認為蔗糖既能維持花粉內外環境的滲透壓又能為花粉的萌發提供營養，因此選擇蔗糖為花粉萌發緩衝液的基本成分。在芝麻初花期採集當天的花粉，分別懸浮於5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％和50％的蔗糖溶液中(ph7.0)，靜置6小時之後鏡檢、並做統計分析。緩衝液中不同的蔗糖濃度與芝麻花粉的萌發率有著直接的關係，起初隨著蔗糖濃度的升高，花粉的萌發率也在升高,並在蔗糖濃度為35％時萌發率達到最高，此時萌發率在29％左右；之後隨著蔗糖濃度的繼續加大，花粉的萌發率卻開始下降，在蔗糖濃度為50％時，花粉萌發率已不足10％，可見培養基中蔗糖濃度過高或過低都不利於芝麻花粉的離體萌發。因此，選擇35％的蔗糖溶液作為用花粉介導芝麻轉化緩衝液的基本成分。
表2不同硼酸濃度對花粉萌發的影響
請參閱表2，將新鮮花粉懸浮於由35％的蔗糖和不同濃度的硼酸組成的緩衝液中，培養、鏡檢、並做統計分析。硼酸的濃度對芝麻花粉的萌發率有較明顯的影響，在蔗糖濃度為35％時，培養基中加入20mg/l-40mg/l的硼酸時，隨著硼酸濃度的增加，花粉萌發率顯著提高，且觀察發現花粉管長度也有比較明顯的伸長，在花粉萌發的過程中花粉管還有分叉現象。當硼酸濃度達到40mg/l時，花粉萌發率達到最高，可達43.826％，隨後繼續加大硼酸濃度，則抑制花粉的萌發。由此可以看出,在離體條件下，在緩衝液裡添加適宜濃度的硼酸可以有效改善花粉的萌發。
表3不同氯化鈣濃度對花粉萌發的影響
請參閱表3，將新鮮花粉懸浮於由35％的蔗糖、40mg/l的硼酸和不同濃度的氯化鈣組成的緩衝液中，培養、鏡檢，並做統計分析。從表3和表4可以看出，在沒有添加外源ca2+的緩衝液中，芝麻花粉也能萌發，可見，外源ca2+對芝麻花粉的萌發並不是必需的，但培養基中加入適量的ca2+能夠促進花粉萌發，在一定程度上提高花粉的萌發率。試驗結果表明(表5)，當蔗糖濃度為35％，硼酸濃度為40mg/l時，100mg/l-200mg/l的低濃度的氯化鈣可以促進花粉的萌發，氯化鈣濃度為200mg/l時，花粉萌發率達到最高，繼續加大濃度，則抑制花粉的萌發。綜合上述三個實驗，確定芝麻花粉介導芝麻轉化的最適緩衝液由35％的蔗糖，40mg/l的硼酸，200mg/l的氯化鈣組成。
本發明中在對芝麻基因組dna的提取時，採用改良的ctab法提取，其中ctab提取液為1m/ltris-hci，0.5m/lna2edta，2％pvp，2％(v/v)β-巰基乙醇，提取的dna自然乾燥後溶解於te中，1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測後，於－20℃保存備用；
在對芝麻基因組dna進行pcr特異性擴增時，使用pbi101-chi-bmk質粒特異性擴增引物對提取的芝麻總dna進行pcr擴增，擴增過程中設立嚴格的陰性和陽性對照(非轉基因植株為陰性對照，質粒dna為陽性對照)，根據目的基因序列設計合成兩對特異引物，chi基因引物:5′-atgcgagcgacactggcg-3′和5′-tagggttgttgacattcgcg-3′，兩引物間的片段大小約為1800bp，擴增反應程序為94℃，5min；94℃，30s；62℃，45s；72℃，2min；30個循環。bmk基因引物:5′-atgaaatttttccttata-3′和5′-ttaaccaattatttggac-3′，兩引物間的片段大小約為280bp。擴增反應程序為94℃，5min；94℃，30s；47℃，30s；72℃，45s；30個循環，取製備的總dna稀釋到50ng左右作為模板進行pcr擴增，pcr反應體系為20μl，其中模板dna(50ng/μl)2μl，primerⅰ(10μm)0.8μl，primerⅱ(10μm)0.8μl，10×pcrbuffer(含mg2+)2μl，dntp(10μm)0.4μl，taqdna聚合酶0.4μl，ddh2o13.6μl，上覆3μl石蠟油。反應完成後,加2μl5×上樣緩衝液，採用1％的瓊脂糖凝膠電泳，膠中加入0.5μl/mleb。電泳結束後，凝膠成像分析系統檢測、掃描照像、保存；
在斑點雜交檢測過程中，待檢樣品為隨機取樣的pcr陽性植株基因組dna(約10μg)、陰性對照(非轉基因植株基因組dna約10μg)和質粒dna(約5μg)。將待檢樣品高溫變性直接點樣到尼龍膜上，紫外固定4min，然後再將膜夾在兩層濾紙之間，80℃固定30min，然後預雜交2h，雜交過夜，幾丁質酶基因探針和抗體的製備按試劑盒說明書進行，雜交後用cspd(roche)螢光染色觀察並用x-光片自顯影曝光；
在southernblot檢測過程中，待檢樣品為隨機取樣的pcr陽性植株基因組dna總dna(15μg)、陰性對照(非轉基因植株基因組dna約15μg)和質粒dna(約10μg)，分別用hindⅲ和salⅰ在37℃水浴中酶切過夜，酶切產物於0.8％瓊脂糖凝膠上以4v/cm的低電壓電泳分離。然後用常規方法在搖床上處理電泳膠，雜交後用cspd(roche)螢光染色觀察並用x-光片自顯影曝光。
在本發明中，利用花粉介導法獲得轉基因植株需要將花粉經過適宜的超聲波處理，利用超聲波在瞬間釋放的高能和空化作用，使花粉處於感受態，從而在儘可能保持外源dna完整性的前提下，使攜帶目的基因的質粒載體有效地進入花粉粒。超聲波處理的程度不同,對花粉粒活性的影響也不同，若處理強度過大，則可能會破壞外源質粒的完整性，也會影響花粉的萌發率，進而直接影響轉化率；若處理強度過小，則力度不夠，質粒進入花粉的機率就會大大降低。因此，選擇合適的超聲波處理參數是十分重要的；
選擇合適的花粉採集時間。芝麻每日從早晨4:00開始開花，到下午7:00停止，以上午6:00-8:00開花最多，10:00後明顯減少。有研究表明：溫度和溼度是影響花粉生活力的重要因素，低溫和低溼有助於花粉維持較長時間的生活力；
選取合適的授粉時間。溫度對於芝麻花粉的萌發有重要的影響，27-32℃為萌發的最適的溫度。且據中國農科院油料作物研究所試驗觀察，芝麻的成蒴與日照和空氣溼度顯著相關，這就要求我們在轉化過程中嚴格選擇授粉時間，本實驗中，選擇在上午10：00-12：00以期達到最佳受精的試驗結果；
提高人工授粉時增加塗抹的花粉量或在授粉時適當的重複授粉可以提高結實率。授粉塗抹時動作要柔和，儘量減少對柱頭的機械損傷；
選擇合適的授粉花蕾，芝麻為雌雄同體、自花授粉作物，在開花前即自行授粉，且同一花中的雌蕊比雄蕊早一天左右成熟。一般一朵花從幼蕾到開放大約需要7-9天，如果授粉的花蕾選擇的較小，則雌蕊發育不成熟，如果選擇的太大，則可能已經完成授粉，所以實驗中一般選擇尚未開放但是預計當天能夠開放的花蕾為授粉對象，以此來提高芝麻的結蒴率和轉化成功率；
在加強授粉期間及授粉結束之後的田間管理，例如及時的去除未經轉化處理的蒴果，去除分支，以及授粉結束後及時打頂，都有利於養分集中供給人工授粉的蒴果，對提高結實率，進而提高轉化率有利。
儘管已經示出和描述了本發明的實施例，對於本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由所附權利要求及其等同物限定。