金葡菌毒力刺激因子抑制肽及其應用的製作方法

2023-08-01 00:50:16

專利名稱：金葡菌毒力刺激因子抑制肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一組能夠特異抑制金葡菌毒力刺激因子活性的多肽。本發明還涉及這些金葡菌毒力刺激因子抑制肽在醫藥領域中的應用。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(金葡菌)是一類常見的革蘭氏陽性致病菌，是引起燒傷及戰傷感染、肺炎、心內膜炎、敗血症、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年僅醫院內感染金葡菌的人數就超過數百萬。目前臨床上對金葡菌感染的治療多採用聯合使用抗生素的辦法，但是效果並不理想。由於金葡菌極易產生耐藥性且無好的解決方法，常用的許多抗生素對之無效，控制金葡菌感染已成為目前臨床醫學中亟待待解決的問題之一。
金葡菌的主要致病物質是毒素，包括溶血毒素、殺白細胞素、腸毒素等。最新研究表明，金葡菌這些毒力因子的合成是受一種可調節RNA分子，即RNA III控制的。RNA III激活毒力因子的基因轉錄，通過鹼基互補調節毒力因子的翻譯。在細菌生長的對數早期，其RNA III水平低，但到對數晚期RNAIII水平會增加40倍，而RNA III的水平是由金葡菌自身分泌的因子RAP(RNA III activating protein)，即RNA III激活蛋白調節的，故因子RAP又稱為金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持續分泌RAP，在RAP達到一定濃度後才有激活毒力因子產生的作用。沒有RAP產生的金葡菌本身並不致病。1998年Science雜誌研究結果表明，用RAP免疫動物，其抗體可以有效地保護小鼠免受金葡菌的感染，存在的主要問題是個體間抗體差異大，所以保護效果差異也大(Balaban N，et al.Autoinducer of virulence as a target for vaccine andtherapy against Staphylococcus aureus.Science，1998，280(17)438-440)。目前，文獻報導一種一種小分子肽可抑制肽金葡菌毒力刺激因子的活性，該抑制肽被命名為RIP，胺基酸序列為YSPWTNF。它與RAP蛋白N-末端胺基酸序列有高度同源性(Balaban N，et al.Regulation of Staphylococcus aureuspathogenesis via target of RNA III-activating protein(TRAP).J.Bio.Chem.2001，2762658-2667)。

發明內容
我們採用噬菌體展示技術從隨機肽庫中篩選出能特異與RAP分子結合併抑制其活性的小分子多肽，目的是用RAP抑制劑阻斷RAP對毒力因子產生的誘導作用，從而切斷金葡菌毒素產生的信號轉導，為治療金葡菌感染開闢新的途徑。本發明的多肽無論從來源還是從結構上完全不同於上述抑制肽RIP。
本發明的目的是提供一類能夠與金葡菌毒力刺激因子特異結合併抑制其活性的多肽。
本發明的另一目的是提供這些金葡菌毒力刺激因子抑制肽在醫藥領域中的用途。
本發明的金葡菌毒力刺激因子抑制肽是具有以下通式結構的12肽W1-X1-A1-X2-W1-X4-P1-X1，其中，W代表色氨酸殘基，X代表任何天然L-型胺基酸殘基或D-型異構體，A代表芳香族胺基酸殘基，如色氨酸殘基(W)、酪氨酸殘基(Y)或苯丙氨酸殘基(F)等，腳註數字代表胺基酸殘基的個數。
具有上述結構模式的多肽能夠與金葡菌毒力刺激因子RAP特異結合，並抑制其活性。具體表現為，在體外具有上述結構模式的多肽無論是以何種形式如展示在噬菌體上、或體外化學合成、或用基因工程方法重組表達，都能夠與RAP特異結合，並抑制金葡菌中由RAP調控的RNAIII的表達，動物實驗結果表明，具有上述結構模式的多肽能夠抑制金葡菌引起的感染。
本發明的小分子多肽可通過本技術領域的的常規方法，如化學合成或基因重組表達的方法製得。
傳統抗生素治療產生抗藥性的原因主要為用藥後細菌在生存壓力下產生分解抗生素中有效基團的誘導酶。本發明利用特異抑制RAP活性的多肽建立的治療金葡菌感染的方案，由於不殺滅細菌而使細菌的致病性喪失，所以不會象傳統抗生素治療那樣對細菌產生選擇壓力而產生抗藥株，這就為一直困擾臨床的抗藥性金葡菌感染這一常見、多發且有致命性的疾病的治療找到新的出路。
本發明對研製新型抗金葡菌感染的小分子多肽藥物具有重要意義，並具有廣泛的應用價值及廣闊的市場前景。另外，金葡菌毒力刺激因子RAP結合肽作為生物製劑也有潛在的應用價值，如可用於RAP的親和純化或作為探針用於RAP的檢測等。
本發明的RAP抑制肽在抑制RAP活性方面優於RIP。


圖1是RAP抑制肽對金葡菌細胞內RNA III水平的影響(Northern blot結果)。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
實施例1.RAP抑制肽對金葡菌細胞內RNA III水平的影響1.實驗方法提取培養90分鐘的金黃色葡萄球菌細胞內總RNA。具體方法是4℃12000g離心，從5毫升細菌培養物中回收細胞，重懸菌體於0.5毫升裂解緩衝液，並在冰中凍結。超聲破碎後，用等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提1次，再用氯仿/異戊醇(24∶1)抽提1次，400微升水相加入15微升5M NaCl，並加2.5倍體積乙醇沉澱，-204℃過夜。4℃離心後，沉澱用70％乙醇洗一次，乾燥後用無RNA酶的DNA緩衝液溶解，加入DNA酶消化60分鐘，37℃酚氯仿抽提，標準乙醇沉澱方法回收RNA，溶解於100微升DEPC處理水中，定量。
利用RNA III特異性探針(序列為RNA III基因序列中1320～1566片段)，通過Northern blot方法檢測金黃色葡萄球菌細胞內RNA III的水平，以此來檢測結合肽的活性。
結合肽1為WHWTNWGKTSPA結合肽2為WPFAHWPWQYPR2.實驗結果結果表明結合肽1和結合肽2均能夠明顯抑制RNA III的轉錄，參見附圖1。圖中，A為陽性對照；B、C、D、E為單克隆噬菌體，其中B為1號結合肽，E為2號結合肽；F為無關噬菌體展示肽。每加樣孔加入5μg細菌總RNA。
實施例2.在感染金葡菌的動物模型上檢測結合肽的活性1.實驗方法採用經典的動物感染模型，即分別將同等培養條件且相同數量(1×108個細胞)的金黃色葡萄球菌單獨或與結合肽混合注射到Balb/c來源的具有正常免疫力的無毛小鼠(軍事醫學科學院動物中心提供)皮下，所有注射物中含有終濃度為5毫克/毫升的Cyfodex(Ampharmacia公司產品)。72小時後觀察小鼠皮膚感染面積的大小，感染面積的計算公式如下。
面積＝(π/6)×長度(釐米)×寬度(釐米)結合肽為WPFAHWPWQYPR2.實驗結果結果發現RAP結合肽能夠明顯抑制金葡菌造成的動物皮膚感染，見下表組 別 感染面積(平方釐米)金葡菌+生理鹽水 2.763±0.86金葡菌+結合肽 0.776±0.37*金葡菌+無關肽 2.154±1.24n＝8，*表示與加生理鹽水對照組和無關肽對照組相比都有顯著性差異(p＜0.001)
權利要求
1.金葡菌毒力刺激因子抑制肽，具有以下通式結構的胺基酸組成W1-X1-A1-X2-W1-X4-P1-X1，其中，W代表色氨酸殘基，X代表任何天然L-型胺基酸殘基或D-型異構體，A代表芳香族胺基酸殘基，腳註數字代表胺基酸殘基的個數。
2.權利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽，其特徵在於A代表酪氨酸殘基。
3.權利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽，其特徵在於A代表苯丙氨酸殘基。
4.權利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽，其特徵在於A代表色氨酸殘基。
5.權利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子RAP抑制肽，其特徵在於胺基酸組成為WHWTNWGKTSPA。
6.權利要求3所述的金葡菌毒力刺激因子RAP抑制肽，其特徵在於胺基酸組成為WPFAHWPWQYPR。
7.權利要求1至5中的任意一項所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽在製備抗金葡菌感染藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一組能夠特異抑制金葡菌毒力刺激因子活性的多肽。該抑制肽的胺基酸組成為W
文檔編號A61K38/10GK1394871SQ0111997
公開日2003年2月5日 申請日期2001年7月5日 優先權日2001年7月5日
發明者邵寧生, 楊光, 柳川, 薛沿寧, 沈倍奮 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所, 海南通用同盟藥業有限公司