一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用的製作方法

2023-08-01 07:03:51 1

一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用，屬於微生物及組織培養技術，具體涉菌根真菌的分離鑑定、鐵皮石斛的組織培養、菌根真菌對鐵皮石斛生物量及礦質元素增長的作用。將被孢黴屬菌根真菌應用於鐵皮石斛組培苗生根壯苗培養，包括菌根真菌分離培養，鐵皮石斛組培苗生根壯苗培養和鐵皮石斛菌根化三個步驟。採用本發明，鐵皮石斛組培苗在鮮重增長率、乾重、株高增長率、分櫱、生根等方面都有顯著增加，對礦質元素尤其是大量元素的吸收也有明顯提高，真菌MortierellaFL9與鐵皮石斛形成了良好的共生關係。
【專利說明】一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用，屬於微生物及組織培養【技術領域】。
【背景技術】
[0002]自然界中絕大多數的蘭科植物不同生長狀態都有與之共生的菌根真菌。蘭科植物種子萌發困難，自然狀態下，蘭科植物生長狀態良好是由於蘭科植物與真菌形成良好的共生關係，才能促進蘭科植物的生長。
[0003]鐵皮石斛屬蘭科石斛蘭屬多年生草本，為我國傳統的名貴中藥材，位居中華九大仙草之首。近年來，隨著人們保健意識的增強，鐵皮石斛市場需求量增大，野生石斛資源採伐嚴重。人們開始尋求人工栽培的方法來培養鐵皮石斛，組培技術的發展實現了其大量繁殖，然而組培苗生長緩慢，移栽馴化成活率低。本發明從菌根保育的角度來研究促進鐵皮石斛組培苗生長的方法。

【發明內容】

[0004]本發明目的在於提供一種使得鐵皮石斛菌根化的方法，此方法可以促進鐵皮石斛的生長，提高栽培成活率，促進鐵皮石斛對礦質營養元素的吸收尤其是大量元素的吸收。
[0005]本發明採用的方法是分別先對菌根真菌進行分離鑑定及純化培養，鐵皮石斛組培苗進行生根壯苗培養，再將菌根真菌與鐵皮石斛組培苗共培養使得鐵皮石斛菌根化。
[0006]本發明中菌根真菌#orii6?ri?77aFL9的分離鑑定。採用根組織分離法,選取浙江大明山野生狀態下春蘭新鮮營養根的根段，流水洗淨，表面消毒後，接種到PDA培養基上，多次純化得到被孢黴屬菌根真菌菌株FL9。乳`酚棉蘭染色及DNA序列測定得出，真菌為被孢黴屬菌根真菌，命名為iforiiereBaFLL
[0007]上述被孢黴屬菌根真菌生物學特徵表述為:在PDA培養基上生長，早期菌絲貼培養基生長，菌落正反面均為白色，菌絲呈蓬鬆狀，邊緣整齊，培養8d後，菌落直徑5.2cm,菌落約厚0.4cm,孢子圓形，大小為:6.05~6.14 μ m,菌絲分支,有隔。
[0008]前述被孢黴屬菌根真菌菌株，其核氨酸序列如SEQ ID N0.1。
[0009]本發明中，鐵皮石斛的生根壯苗採用的最適培養配方為基本培養基採用1/2MS，附加 0.7mg.L^1IBA+1.0mg.L-1NAA 鹿糖 30mg.L—1,瓊脂 6.8mg.L-1,活性炭 Img.I71，其中添加有機添加物椰乳有利於石斛苗的生根壯苗。
[0010]前述被孢黴屬菌根真菌#oriiere77aFL9菌株在促進鐵皮石斛生長中的應用。
[0011]本發明提供了一種菌苗共生最適培養基的篩選的方法:在查閱相關文獻的基礎上，設計5種不同的培養基配方，菌苗共培養過程中，分別觀察菌苗的共生培養狀況，最終篩選出菌苗均適應的培養基。
[0012]本發明中被孢黴屬菌根真菌#orii6?ri?77aFL9與鐵皮石斛組培苗共生培養採用的培養基配方為:CaCl2 1.0mmol.L S MgSO40.SmmoI.L S K2SO4 1.0mmol.L S KH2PO40.4mmo1.L 1, FeSO4IOO μ mo I.L S H3 B0425 μ mo I.L S MnCl233 μ mo I.L S ZnSO42.8 μ mo I.L \ NaMoO4L 0 μ mo I.L \ Na2 EDTA140 μ mo I.L \ 酵母汁 1.0g.L S 瓊脂
6.8g.L 1O
[0013]本發明提供了一種被孢黴屬菌根真菌#orii6?ri?77aFL9與鐵皮石斛共生培養的方法:將鐵皮石斛組培苗植入共生培養基中，培養一周後選取生長狀態良好無汙染的瓶苗，採用直徑0.5cm的打孔器打取PDA培養基上活化的菌片，接種到鐵皮石斛瓶苗內，進行共生培養。
[0014]本發明提供了一種黴屬菌根真菌#oriiere77aFL9菌株對鐵皮石斛生長的效應研究的方法。通過對共生植株生物量測定，礦質營養元素含量的測定分析菌株的鐵皮石斛組培苗生長的作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為被孢黴屬菌根真菌#0riiere77aFL9平板圖；
圖2為被孢黴屬菌根真菌#oriiere77aFL9菌株的菌絲圖片(400倍)；
圖3為被孢黴屬菌根真菌#oriiere77aFL9菌株的孢子圖片(1000倍)；
圖4為被孢黴屬菌根真菌#oriiere77aFL9對鐵皮石斛促生作用圖(左側為CK，右側為接菌苗)。
【具體實施方式】
[0016]實施例1:本發明中被孢黴屬菌根真菌#orii6?ri?77aFL9菌株的分離鑑定
採自浙江大明山野生狀態下春蘭新鮮營養根，水衝洗根上的泥沙，對材料表面進行滅菌，無菌水衝洗乾淨，無菌條件下橫切成長約為5_的塊狀,置於PDA培養基中，切面朝向培養基，25°C恆溫避光培養。經過7d的培養菌絲從組織塊上長出形成一定大小菌落，從邊緣挑取菌絲移到另一 PDA平板重複至純化得到菌株FL9。
[0017]菌株FL9形態觀察及乳酚棉蘭染色，結合圖1-3，生物學特徵表述為:在PDA培養基上生長，早期菌絲貼培養基生長，菌落正反面均為白色，菌絲呈蓬鬆狀，邊緣整齊，培養8d後，菌落直徑5.2cm,菌落約厚0.4cm,孢子圓形,大小為:6.05~6.14 μ m,菌絲分支,有隔。
[0018]ITS基因的PCR擴增和序列測定，菌株DNA提取後進行PCR擴增DNA，選用DNA多聚酶鏈式反應(PCR)試劑盒，設計使用的引物為ITSl (5，TCCGTAGGTGAACCTGC 3，)和ITS2(5』 AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG3』)。建立 50mL 體系進行反應；對 DNA 模板的 PCR 產物進行檢測。
[0019]根據菌落形態觀察和提取的14種DNA序列與網上基因庫(http:// www.ncb1.nlm.nih.gov/Genbank/index, html)查詢對比，以基因序列相似度為標準，參照《中國真菌志》來測定這菌株FL9的科屬，菌株FL9為被孢黴屬菌根真菌#oriiere77aFL9。
[0020]實施例2:鐵皮石斛組培苗的生根壯苗
選取生長狀態基本一致的小苗，重量約為0.28±0.4g，株高2.5±0.5cm,接種到生根壯苗培養基中，基本培養基採用1/2MS，附加0.7mg.L^IBA+l.0mg.T1NAA蔗糖30mg.L—1，瓊脂6.8mg.L-1,活性炭Img.L_S pH為5.8，不同有機添加物椰乳、香蕉泥、馬鈴薯對鐵皮石斛組培苗生根壯苗的影響，每瓶接種5株，重複三次。培養兩個月後調查苗的株高、鮮重、髮根數。結果表明，添加椰乳有利於鐵皮石斛幼苗的分化、新根的生成。
[0021]實施例3:菌苗共生培養基的篩選
A:DE1 培養基,配方為:CaCl2 LOmmol.L SMgSO4CLSmmol^L \ K2SO4 1.0mmol.L SKH2 PO40.4mmo1.I, 1, FeSO4IOO μ mol.L 1, H3 Β0425 μ mo I.L S MnCl233 μ mol.L 1, ZnSO4
2.8 μ mol.L \ NaMoO4L O μ mol.L \ Na2 EDTA140 μ mol.L \ 酵母汁 1.0g.L S 瓊脂8.0g.L 1O
[0022]B:選用Dijk和Eck對蘭花與真菌共生培養的改良培養基，簡稱DE2培養基，其配方為:CaCl2l.Ομπιο?.I/^MgSO40.5 μ mol.I/\ K2SO4L O μ mol.I/\ KH2PO40.4 μ mol *L_1,FeSO4IOO μ mol.L S H3B0425 μ mol.L S MnCl233 μ mol.L 1, ZnS042.8 μ mol.L S NaMoO41.0 μ mol.I/1，Na2 EDTA140ymol.L — 1，酵母汁 l.0g.I/1，瓊脂 8.0g.L — 1，可溶性澱粉9.0g/L。
[0023]C:MS 培養基，蔗糖 lOg.!/1。
[0024]D:MS 培養基，蔗糖 15g.L—1。
[0025]E:MS 培養基，蔗糖 20g.L—1。
[0026]將生長狀態良好，根長約1.5^2cm的，株高約2.5^3.0cm的鐵皮石斛組培苗植入菌苗共生培養基中，每瓶三株，成正三角形栽植，培養I (Tl 5 d後，將經PDA培養基活化的8種真菌分別用直徑為0.5cm的打孔器在菌落表面打取平板菌塊，然後用接種針將平板菌塊接種於三株苗的中間培養基上，每一處理重複3瓶。培養50d後對菌苗的生長狀況進行調查，結果表明培養基A也就是DEl培養基為菌苗共生的最適培養基。
[0027]實施例4:鐵皮石斛與被孢黴`屬菌根真菌共生培養
將生長狀態良好的鐵皮石斛組培苗植入菌苗共生培養基中，每瓶三株，成正三角形栽植，培養1(T15 d後，將經PDA培養基活化的8種真菌分別用直徑為0.5cm的打孔器在菌落表面打取平板菌塊，然後用接種針將平板菌塊接種於三株苗的中間培養基上，每一處理10瓶，重複3次。
[0028]菌苗共培養60d後，分別取出對照苗和接菌苗，洗淨根部殘留瓊脂，用濾紙吸乾表面水分待用。調查統計接菌苗與對照苗的重量、株高、葉片數、分櫱和末根數，計算平均鮮重增長率、株高增長率、新增分櫱數及新髮根均為所有苗數的平均值。
[0029]隨機抽取鐵皮石斛菌根苗和對照苗各30株置於80°C的烘箱中烘乾，粉碎後過60目篩。將粉末在105°C下烘至恆重，準確稱取0.5g樣品於平底消解管中，加入5~15ml的55~65% (質量分數)硝酸，再加入1.5ml 50~60% (質量分數)HClO4，在消解爐中140°C下加熱至冒白煙為止，冷卻後加入5~15ml的34~37% (質量分數)HC1，轉入50ml容量瓶中。採用電感耦合等離子體原子發射光譜儀(ICP-AES)測定組培苗各元素含量，含量計算公式:
P (%) = (C*V*ts*100) / (m*106)
C一測得顯色液中的濃度，V—顯色體積，m—烘乾樣品質量，ts—分取倍數。
[0030]表1菌苗共培養60d後，真菌對鐵皮石斛生物量增長的效應
【權利要求】
1.被孢黴屬菌根真菌的分離培養方法，其特徵在於:選取野生狀態下春蘭新鮮營養根的根段，流水洗淨，表面消毒後接種到PDA培養基上，多次純化得到被孢黴屬菌根真菌菌株。
2.如權利要求1所述培養方法獲得的被孢黴屬菌根真菌，其特徵在於，其生物學特徵為:在PDA培養基上生長，早期菌絲貼培養基生長，菌落正反面均為白色，菌絲呈蓬鬆狀，邊緣整齊，培養8d後，菌落直徑5.2cm,菌落約厚0.4cm,孢子圓形，大小為:6.05~6.14 μ m，菌絲分支，有隔。
3.如權利要求1所述培養方法獲得的被孢黴屬菌根真菌，其特徵在於，所述的被孢黴屬菌根真菌的核氨酸序列為=SEQ ID N0.1。
4.一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用，其特徵在於包括如下步驟: (1)菌根真菌分離培養:選取春蘭新鮮營養根根段，流水洗淨，表面消毒後，接種到PDA培養基上，恆溫避光培養，重複純化得到菌株FL9 ； (2)鐵皮石斛組培苗生根壯苗培養:選取生長狀態一致的株苗，重量為0.28±0.4g，株高2.5±0.5cm，接種到生根壯苗培養基中，獲得壯苗； (3)鐵皮石斛菌根化:將步驟(2)所得壯苗植入共生培養基中，培養一周後選取生長狀態良好無汙染的瓶苗，採用直徑0.5cm的打孔器打取步驟(1)中PDA培養基上活化的菌片，接種到鐵皮石斛瓶苗內，進行共生培養。
5.如權利要求4一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用，其特徵在於，步驟(2)中 ，所述的生根壯苗培養基為:基本培養基採用1/2MS，附加0.7mg.L^1IBA+1.0mg.L-1NAA 鹿糖 30mg.L-1,瓊脂 6.8mg.L-1,活性炭 Img.I71。
6.如權利要求5所述的一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用，其特徵在於:所述的生根壯苗培養基中添加椰乳、香蕉泥或馬鈴薯。
7.如權利要求5或6所述的一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用，其特徵在於:所述的生根壯苗培養基中添加椰乳。
8.如權利要求4所述的一種被孢黴屬菌根真菌在鐵皮石斛組培苗培養中的應用，其特徵在於，步驟(3)中，所述的共生培養採用的培養基配方為=CaCl2 1.0mmol.I/1，MgSO40.5mmol.L S K2SO4 1.0mmol.L \ KH2 PO40.4mmo1.L S FeSO4IOO μ mo I.L S H3Β0425 μ mo I.L S MnCl233 μ mo I.L 1, ZnSO4 2.8 μ mo I.L S NaMoO4L 0 μ mo I.L \ Na2EDTA140ymol.I/1，酵母汁 1.0g.I/1，瓊脂 6.8g.I/1。
【文檔編號】A01H4/00GK103881928SQ201410091263
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月13日 優先權日:2014年3月13日
【發明者】崔永一, 王芬, 錢仁卷 申請人:浙江農林大學, 浙江省亞熱帶作物研究所