疫苗組合物和其使用方法與流程

2023-07-31 23:09:36 1

相關申請的交叉參考本申請要求2009年4月1日提交的美國臨時專利申請號61/165,732的優先權。本申請要求此在先專利申請的權益，其全部內容通過引用納入本文。發明領域本發明一般涉及化學和免疫學領域。本發明更具體涉及誘導對象中免疫應答的疫苗、組合物和方法。
背景技術：
：通過使用疫苗預防微生物感染和致病過程被認為是抵禦疾病的最有效和理想過程。在感染或疾病前以刺激宿主生物中免疫應答的方式將抗原或免疫原引入生物。然而，傳統的疫苗策略不能有效增強保護抵禦許多病原或癌症。在超過100種病原中，通過傳統疫苗策略僅製成約20種成功的疫苗。在誘導高細胞毒性t淋巴細胞(ctl)反應的那些疫苗中，一些疫苗常由於免疫原性較弱、免疫迴避機制和假性印跡而顯示中等的目標反應率。目前的疫苗遞送方法在誘導保護性免疫應答方面成功率中等，因為它們不誘導強「危險信號」，它們啟動作為反饋機制的抑制反應且它們遞送抗原給非專職性抗原呈遞細胞(apc)。例如，目前的癌症疫苗即使在產生高ctl反應時，也僅顯示中等(2.6％)目標反應率。它們有許多缺點，包括免疫原性差和免疫迴避機制。此外，最具前景的癌症疫苗(基於樹突細胞和基於g-vax)非常昂貴且這些疫苗的製備很複雜(例如需要個人化和gmp生產)。基因疫苗或基因免疫涉及將遺傳物質引入哺乳動物宿主以產生抗原，其被視作包括癌症疫苗在內的疫苗可能途徑。遞送的編碼所述感興趣抗原的哺乳動物表達載體引起體內表達和隨後發生的抗原特異反應。此外，基因是帶負電的聚合物，不能跨細胞膜到達細胞核以表達感興趣蛋白。基因免疫提供許多優點，包括產生體內表達的全譜天然表位、相較給予體外表達重組蛋白可獲得天然構象的蛋白、誘導抗體和細胞免疫應答、無需昂貴且往往挑戰性的抗原生產步驟。然而，基因疫苗有一些缺點，包括破壞對自體抗原的耐受性、體內遞送核酸到細胞和核較差、缺乏對特定細胞類型的特異性、和免疫應答較弱。其他疫苗形式也有缺點。例如，病毒遞送基因產生對病毒載體的強免疫應答且涉及安全問題。從細菌中純化蛋白和生產用作抗原的肽花費較大且耗時。目前，沒有可靶向apc以生成特異和較強免疫應答而副作用沒有或很少的經濟、有效疫苗形式。因此，非常需要靶向專職apc並引發較強和特異細胞和抗體反應且安全、經濟、易用的疫苗。發明概述本文描述了基於納米顆粒的組合物、藥盒和方法及平臺，用於體內遞送抗原或編碼抗原的核酸到專職性apc(papc)以產生對該抗原的較強和特異免疫應答。本文還描述了基於納米顆粒的組合物、藥盒、方法和平臺，用於遞送sirna給papc和遞送核酸、肽或蛋白給細胞(例如表達mhcii型的腫瘤細胞)。目前疫苗策略的一個主要缺陷在於其誘導包括調節t細胞在內的抑制細胞。已知將抗原靶向遞送給papc可減少或阻止抑制機制激活，特別是調節t細胞的抑制機制。所述組合物、藥盒和方法包括聯用mhc靶向和免疫原性肽(例如padre、ha)與帶電(例如帶正電)高度分支的聚合枝狀物(例如pamam和其他枝狀物)作為靶向遞送核酸、肽或多肽給特定細胞的載體，從而產生基於納米顆粒的新方法用於基因或蛋白免疫。本文所述的典型疫苗包括帶電(例如帶正電)高度分支的聚合枝狀物，其偶聯mhc靶向和免疫原性肽如t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)、至少一種多肽抗原或編碼所述至少一種抗原的核酸、和任選的聚i-c。本文所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物有效結合帶負電的生物分子，包括dna、rna和其他。偶聯t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)的帶電(例如帶正電)高度分支的聚合枝狀物提供了由於遞送特異抗原給papc而提高功效的疫苗。在本文所述實驗中，顯示首次使用padre以通過其結合mhcii型分子而靶向papc。本文所述實驗描述了2種不同靶向肽的有效使用，所述肽的獨特特徵是結合mhcii型。因此，本文所述疫苗、方法和組合物涵蓋所有mhcii型結合肽。本文所述疫苗、藥盒和組合物提供了體內特異且有效轉染papc、和普遍的內置通用t輔助活性，其引起自體papc成熟並因而產生較強和特異免疫應答。枝狀物由於提供對大小和形狀的結構性控制(負荷空間)而成為理想的dna遞送候選物，它們為生物相容性(無毒性和無免疫原性)，具有精確支架特性，具有針對特定靶向部分的明確表面可修飾功能，具有細胞粘附和內吞作用及遞送到細胞質或核的能力，具有可接受的生物降解性(在體內安全降解的能力)，能簡單和持續地可重複(臨床級)合成。在本文所述實驗中，偶聯dna、sirna、肽或多肽的帶正電、高度分支的聚合枝狀物包括在人和小鼠中都靶向apc並激活t輔助細胞的肽(例如padre肽或流感ha)。所述padre肽具有2個主要功能：因其結合papc上存在的mhcii型而護送dna到papc且它刺激t輔助細胞，該細胞促進細胞毒性t細胞生成和抗體反應所需的類型轉換。此新型納米構建物具有基因和肽遞送及免疫的獨特性質。本文所述實驗也顯示偶聯padre的帶正電、高度分支的聚合枝狀物(pamam枝狀物)在治療性設定中使b16/lu8小鼠中已建立且高侵入性黑素瘤延遲生長並使其尺寸減小50％，在b16/ova預防性設定中顯示腫瘤100％消除，誘導針對免疫所用基因產物的強免疫應答，證明在小鼠和人apc中的轉染效率提至2或3倍，體內遞送編碼gfp的質粒從而產生引流淋巴結，有效遞送sirna到人b細胞、t細胞、和鼠巨噬細胞。本文所述組合物和疫苗是特製的理想免疫平臺，因為它們靶向mhcii型陽性細胞，其中所有或幾乎所有都是papc。然而，同樣重要的是mhcii型陽性細胞表達很重要的抑制或促進t細胞激活的共抑制和共刺激分子(包括但不限於cd80、cd86、b7-h1、b7-h4、b7-dc、cd137、ox40、foxp3和其推定共刺激受體)。靶向調控這些途徑中相關分子的表達可用於i)癌症、傳染病的免疫治療/接種或者其他新疫苗方法如針對成癮或不孕或中和對象中疾病誘導劑的疫苗接種，以及控制自身免疫。本文所述的將疫苗靶向遞送給apc通過產生強許多的免疫應答、減少抑制/反饋機制、和降低疫苗劑量從而預防毒性，為與目前疫苗策略相關的挑戰提供解決方法。因此，本文所述疫苗包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯至少一種t輔助肽和編碼至少一種抗原的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯於所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合專職抗原呈遞細胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物和核酸的組合能誘導針對所述至少一種抗原的免疫應答。在疫苗中，所述至少一種枝狀物能結合聚肌胞苷酸。該實施方式可包括藥學上可接受載體和/或油包水乳液。在一種實施方式中，所述至少一種t輔助肽是pan-dr表位(padre)，例如各具有seqidno:1所示胺基酸序列的2個padre表位。所述至少一種t輔助肽也可以是流感ha。所述核酸可以是表達載體且所述至少一種抗原可以是癌抗原或來自傳染性病原體的抗原。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物。本文還描述以下疫苗：該疫苗包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯至少一種t輔助肽和至少一種肽或多肽抗原，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種肽或多肽抗原偶聯於所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合專職抗原呈遞細胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物和至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導針對所述至少一種肽或多肽抗原的免疫應答。在一種實施方式中，所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物還偶聯不同於所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原。所述疫苗還可包括第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其上偶聯至少一種t輔助肽和不同於所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原，其中所述至少一種t輔助肽和所述第二種肽或多肽抗原偶聯於所述第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合專職抗原呈遞細胞且所述至少一種t輔助肽、所述第二種帶電的高度分支聚合枝狀物和所述第二種肽或多肽抗原的組合能誘導針對所述第二種肽或多肽抗原的免疫應答。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可結合聚肌胞苷酸。所述疫苗還可包括藥學上可接受載體和/或油包水乳液。所述至少一種t輔助肽可以是pan-dr表位，例如各具有seqidno:1所示胺基酸序列的2個pan-dr表位。在另一實施方式中，所述至少一種t輔助肽是流感ha。所述至少一種肽或多肽抗原可以是癌抗原或來自傳染性病原體的抗原。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物。本文還描述了將抗原遞送給哺乳動物並誘導該哺乳動物中生成針對所述抗原的單克隆抗體的方法。所述方法包括以下步驟：將含有至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的組合物給予哺乳動物，所述枝狀物偶聯至少一種t輔助肽和至少一種肽或多肽抗原或所述至少一種抗原的編碼核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸或至少一種肽或多肽抗原偶聯於所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合專職抗原呈遞細胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶電的高度分支聚合枝狀物、和所述核酸或至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導針對所述至少一種肽或多肽抗原的免疫應答，所述組合物的量有效誘導mhcii型介導的t輔助細胞激活，其中將所述組合物給予所述哺乳動物導致生成針對所述至少一種肽或多肽抗原的單克隆抗體。在所述哺乳動物患有癌症的一種實施方式中，所述至少一種肽或多肽抗原是癌抗原，所述組合物是癌症疫苗。通常，給予所述組合物在所述哺乳動物中不產生局部不良反應。在所述哺乳動物患有傳染病的另一個實施方式中，所述至少一種肽或多肽抗原來自傳染性病原體，所述組合物是所述傳染性病原體的疫苗，通常在所述哺乳動物中不產生局部不良反應。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可結合聚肌胞苷酸和/或可包括一個藥學上可接受載體和/或油包水乳液。在本方法的一種實施方式中，所述至少一種t輔助肽是padre表位，例如各具有seqidno:1所示胺基酸序列的2個padre表位。所述至少一種t輔助肽也可以是流感ha。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物還可偶聯不同於所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原。所述組合物還可包括第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯至少一種t輔助肽和不同於所述至少一種肽或多肽抗原的第二種肽或多肽抗原，其中所述至少一種t輔助肽和所述第二種肽或多肽抗原偶聯於所述第二種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合專職抗原呈遞細胞且所述至少一種t輔助肽、所述第二種帶電的高度分支聚合枝狀物和所述第二種肽或多肽抗原的組合能誘導針對所述第二種肽或多肽抗原的免疫應答。在一個生產和收穫抗體的實施方式中，所述哺乳動物可以是嚙齒類動物或兔並從所述哺乳動物中收穫單克隆抗體。在此實施方式中，所述單克隆抗體通過以下步驟製備：從所述哺乳動物中收穫所述抗體，確定所述抗體效價，從所述哺乳動物中取出脾，與骨髓瘤融合。所述抗體可人源化處理。本文還描述以下組合物：該組合物包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯至少一種t輔助肽和至少一種sirna，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種sirna偶聯於所述帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合專職抗原呈遞細胞。所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是padre，所述sirna可針對例如ctla-4、foxp3、cd28、ido或精氨酸酶1。本文進一步描述將sirna遞送給專職抗原呈遞細胞的方法，包括以下步驟：提供含有至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯至少一種t輔助肽和至少一種sirna，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種sirna偶聯於所述帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合專職抗原呈遞細胞；將所述組合物在一定條件下給予哺乳動物對象，所述條件下偶聯至少一種t輔助肽和至少一種sirna的所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物結合專職抗原呈遞細胞且所述sirna進入所述專職抗原呈遞細胞。所述帶電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是例如padre，所述sirna可針對例如ctla-4、foxp3、cd28、ido或精氨酸酶1。在一種實施方式中，所述sirna防止所述專職抗原呈遞細胞中的ctla-4、foxp3、cd28、ido或精氨酸酶1表達。本文還描述了在哺乳動物中抑制mhcii型腫瘤細胞(例如淋巴瘤或淋巴瘤的部分)增殖或誘導mhcii型腫瘤細胞凋亡的方法。此方法包括以下步驟：將含有至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的組合物給予哺乳動物，所述枝狀物偶聯至少一種t輔助肽且結合編碼蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯並結合於所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合mhcii型腫瘤細胞且所述至少一種t輔助肽、所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物、和所述核酸或由核酸編碼的蛋白的組合抑制mhcii型腫瘤細胞增殖或誘導mhcii型腫瘤細胞凋亡。所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物可以是例如pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是例如padre。然而，可使用任何適當的帶正電、高度分支的聚合枝狀物和t輔助肽。本文所述的遞送核酸給細胞的方法包括使所述細胞接觸含有至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯至少一種t輔助表位和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助表位和所述核酸偶聯於至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助表位特異性結合所述細胞且所述至少一種t輔助表位、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細胞內化。在此方法中，所述肽或蛋白通常在所述細胞內表達。儘管可使用任何合適的帶正電、高度分支的聚合枝狀物和t輔助肽，所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物可以是例如pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是例如padre。本文所述的用於遞送核酸給細胞的組合物包括至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯至少一種t輔助肽和和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯於至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合所述細胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細胞內在化。所述帶正電、高度分支的聚合枝狀物可以是pamam枝狀物，所述至少一種t輔助肽可以是例如padre。然而，可使用任何合適的帶正電、高度分支的聚合枝狀物和t輔助肽。除非另有說明，本文使用的所有技術術語都具有本發明所屬領域普通技術人員通常所理解的同樣含義。如本文所用，「核酸」或「核酸分子」指具有2個或更多核苷酸如rna(核糖核酸)和dna(脫氧核糖核酸)和化學修飾核苷酸的鏈。「純化」核酸分子在天然產生該核酸的細胞或生物中的其他核酸序列基本彼此分離(例如，30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、100％無汙染物)。所述術語包括例如納入載體、質粒、病毒或者原核或真核生物基因組的重組核酸分子。純化核酸的例子包括cdna、基因組核酸片段、聚合酶鏈式反應(pcr)生成的核酸、通過限制性酶處理基因組核酸形成的核酸、重組核酸、和化學合成的核酸分子。「重組」核酸分子是通過人工組合原本獨立的2種序列區段製成，例如通過化學合成或通過遺傳工程技術操作分離的核酸區段。涉及肽、寡肽或蛋白中的胺基酸殘基時，術語「胺基酸殘基」、「胺基酸」和「殘基」可互換使用，且如本文所用指經醯胺鍵或模擬醯胺鍵與至少一種其他胺基酸或胺基酸模擬物共價連接的胺基酸或胺基酸模擬物。如本文所用，「蛋白」和「多肽」同義使用，指任何胺基酸的肽接鏈，無論其長度或翻譯後修飾，例如糖基化或磷酸化。涉及核酸分子、多肽或傳染性病原體時，術語「天然」指自然產生的(例如野生型(wt))核酸、多肽或傳染性病原體。如本文所用，術語「抗原」或「免疫原」指由抗體特異性識別和結合的分子。涉及表位(例如t輔助表位)時，生物活性指能夠結合適當mhc分子，且在肽用於刺激ctl反應的情況下誘導針對靶抗原或抗原模擬物的t輔助反應和ctl反應。術語「特異結合」和「特異性結合」指在成對物質如酶/底物、受體/激動劑、抗體/抗原等之間發生的結合，所述結合可由共價或非共價相互作用或者共價和非共價相互作用的組合來介導。當2種物質相互作用產生非共價結合的複合物時，所述發生的結合通常是靜電、氫鍵或親脂相互作用的結果。因此，在產生結合複合物的2種物質間的相互作用具有抗體/抗原或酶/底物相互作用的特徵時，成對物質間發生「特異結合」。具體地，所述特異結合的特徵是配對的一個成員結合一種特定物質且不結合該結合成員對應物所屬化合物家族內的其他物質。如本文所用，術語「pan-dr表位」、「pan-hla-dr結合表位」、「「padre」和「「padre肽」指約4到約20個殘基的肽，其能以高親和力結合12個最常見dr等位基因(dr1、2w2b、2w2a、3、4w4、4w14、5、7、52a、52b、52c和53)中的至少約7個。「高親和力」在本文中定義為ic50％小於200nm的結合。例如，高親和力結合包括ic50％小於3100nm的結合。對於結合mhcii型，結合親和力閾值通常為1,000nm，結合親和力小於100nm一般被視作高親和力。美國專利號5,736,142詳述了padre肽的構建和應用，其通過引用納入本文。本文使用的「t輔助肽」指由t輔助細胞的t細胞受體識別的肽。例如，本文所述的padre肽是t輔助肽。如本文所用，術語「枝狀物」指帶電(例如，帶正電、帶負電)、大致呈球形的高度分支聚合大分子。帶正電、高度分支的聚合枝狀物的一個示例是pamam枝狀物。術語「pamam枝狀物」和「聚醯胺-胺枝狀物」指叔胺位於分支點且通過醯胺官能團形成結構層間連接的枝狀物類型。術語「pamam枝狀物」和「聚醯胺-胺枝狀物」指叔胺位於分支點且通過醯胺官能團形成結構層間連接的枝狀物類型。pamam枝狀物的表面顯示許多正電荷。術語「衍生枝狀物」指其表面偶聯一個或多個官能團的枝狀物。「padre衍生枝狀物」或「padre-枝狀物」是納米構建物，其中一個或多個padre肽共價結合於帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物(例如pamam枝狀物)表面的官能團。術語「偶聯」指一個分子或試劑物理或化學連接或附於另一分子或試劑。偶聯的示例包括共價連接和靜電複合。術語「複合」、「與之複合」和「偶聯」在本文中可互換使用。如本文所用，短語「序列同一性」指對齊2種序列(例如，核酸序列、胺基酸序列)以最大化亞基匹配即考慮缺口和插入時，所述2種序列中對應位置的相同亞基百分數。可用序列分析軟體(例如加利福尼亞州聖地牙哥的accelryscgc公司的序列分析軟體包)測量序列同一性。短語「分離」或「生物純」指物質幾乎或基本沒有其天然狀態下發現的正常伴隨成分。如本文所用，術語「納米顆粒」指大小以納米計的微觀粒子。例如，納米顆粒是padre-枝狀物偶聯物或是結合多個padre-枝狀物偶聯物與核酸或胺基酸物質的顆粒，其總直徑範圍在約2-500nm範圍內。術語「抗體」包括多克隆抗體、單克隆抗體(mab)、嵌合抗體、人源化抗體、針對能以可溶或結合形式標記的抗體的抗獨特型(抗id)抗體、以及其片段、區域或衍生物，其通過任何已知技術提供，例如但不限於酶切割、肽合成或重組技術。如本文所用，術語「佐劑」指可調節增強體液和/或細胞免疫應答的任何物質。如本文所用，術語「展示」或「表面暴露」視作同義詞，指抗原或其他分子存在於某一結構如納米顆粒(例如padre-枝狀物)的外表面(例如易為免疫位點識別)。術語「多價」指納米顆粒上展示超過一個拷貝或類型的抗原或分子。如本文所用，「疫苗」包括所有預防和治療性疫苗。本文所述疫苗組合物適於以生物相容形式體內給予對象。本文使用的表述「適於體內給予的生物相容形式」指待給予的物質形式，該形式的治療效果勝過任何毒性效果。所述物質可給予任何動物，例如人。在一些實施方式中，將本文所述的疫苗給予哺乳動物例如嚙齒類動物或兔，用於產生針對特定抗原的單克隆抗體。短語「免疫應答」指誘導特異性針對一種或幾種抗原的抗體和/或免疫細胞介導的反應。誘導免疫應答取決於許多因素，包括受攻擊生物的免疫原性構成、該抗原的化學組成和構型、該抗原的給予方式和時間段。免疫應答有許多面，其中一些由免疫系統細胞表現(例如b淋巴細胞、t淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞)。免疫系統細胞可通過與抗原或免疫系統其他細胞的相互作用、釋放細胞因子和對所述細胞因子反應而參與免疫應答。免疫應答一般分成2種主要類別—體液和細胞介導。免疫應答的體液部分包括生成特異於抗原的抗體。細胞介導部分包括產生針對所述抗原的遲髮型超敏和細胞毒性效應細胞。短語「治療有效量」和「有效劑量」指足以產生治療上(例如臨床上)所需結果的量；所述結果的具體性質根據治療疾病的性質而變化。例如，待治療的疾病是癌症時，所述結果可以是消除包括癌症腫瘤在內的癌細胞。本文所述的組合物和疫苗可以每天一次或多次到每周一次或多次給予。技術人員應理解某些因素可影響有效治療對象所需的劑量和時間，包括但不限於疾病或紊亂的嚴重性、先前的治療、對象的總體健康和/或年齡、和存在的其他疾病。此外，用治療有效量的本發明組合物或疫苗治療對象可包括單一治療或系列治療。如本文所用，術語「治療」定義為將本文所述或由本文所述方法鑑定的治療劑施用於或給予患者，或將所述治療劑施用於或給予患者的分離組織或細胞系，所述患者患有疾病、有疾病症狀或易染病，目的是治癒、痊癒、緩解、減輕、改變、醫治、改良、改善或影響疾病、疾病症狀或易染病傾向。術語「患者」、「對象」和「個體」在本文中可互換使用，指待治療的哺乳動物對象，優選人患者。在一些情況下，本發明的方法用於實驗動物、獸醫應用、開發疾病的動物模型，包括但不限於嚙齒類動物(包含小鼠、大鼠和倉鼠)以及非人靈長類動物。下文描述合適的疫苗、組合物、藥盒和方法，但與本文所述相似或等同的疫苗、組合物、藥盒和方法也可用於本發明的實施或測試。本文述及的所有出版物、專利申請和專利都通過引用全文納入本文。如有衝突，以本說明書為準，包括定義。下面討論的具體實施方式僅是說明性，並非旨在限制。附圖簡要說明圖1是padre-枝狀物的一對示意圖，所述枝狀物可混合質粒或者連接肽或多肽抗原以靶向apc。圖1顯示本文所述的padre-枝狀物提供可納入任意感興趣抗原或編碼任意感興趣抗原的核酸的平臺。本文所述的padre-枝狀物是設計成被專職apc捕獲的先天免疫激活劑。圖2是一系列人b細胞的流式細胞分析點圖，顯示與紅色螢光標記的短核酸序列複合的padre-枝狀物的體外遞送。此核酸是紅色標記的dsrna寡聚物，設計用於rnai分析以促進對sirna寡核苷酸遞送到哺乳動物細胞的評估和優化。細胞與padre-枝狀物/多核苷酸複合物或對照共培養4小時，然後去除培養基並加入新鮮培養基。所述圖像顯示用alexafuor標記的dsrna寡聚物遞送到純化人b細胞內。第4列最下方圖像顯示寡聚物遞送到約92％的細胞中。圖3是顯示體內dna遞送padre-枝狀物的系列照片。將padre-枝狀物/gfp質粒複合物注入皮膚(5μg總質粒)和角膜(1μg/角膜)。拍攝活的麻醉小鼠的立體螢光顯微圖像。左圖顯示皮膚中的gfp表達，右圖顯示角膜中的gfp表達。圖4顯示治療小鼠中已建立的腫瘤。c57bl小鼠用編碼gfp(一次)或ova(二次)的質粒皮下免疫。收集3隻小鼠的血清並進行elisa(左)或flisa(右)。圖5是顯示padre-枝狀物治療已建立腫瘤的一對圖。植入b16黑素瘤細胞(頂部)或tsa(底部)的小鼠在腫瘤移植後第2天或3天接種疫苗，接著在一周後加強免疫。圖6的流式細胞分析系列直方圖顯示與複合有padre-枝狀物的gfp質粒(5μg)共培養後的gfp表達，下圖是人外周血單核細胞(pbmc)，上圖是人b細胞。左側直方圖為枝狀物/gfp質粒複合物用作對照。圖7的流式細胞分析系列點圖顯示通過pdd體外遞送蛋白：白蛋白-fitc到人b細胞。左側圖像顯示pdd/白蛋白-fitc遞送到純化的人b細胞內。收集人純化b細胞並與pdd/白蛋白-fitc共培養。左側直方圖顯示在pdd/白蛋白-fitc加入人b細胞後的早晨，人b細胞內的白蛋白-fitc遞送。頂部直方圖顯示單獨的b細胞，中部直方圖顯示枝狀物/白蛋白-fitc複合物加入人b細胞，底部直方圖顯示pdd/白蛋白-fitc複合物加入人b細胞的結果。右側圖是加入pdd/白蛋白-fitc複合物1小時後b細胞攝取白蛋白的螢光顯微圖像。圖8的流式細胞分析系列點圖顯示淋巴結中體內靶向dc。左圖示意顯示注入和取出淋巴結和分析的時間軸，右圖顯示對pdd/gfp質粒或枝狀物/gfp質粒注射位點相鄰淋巴結細胞相對原初淋巴結所得數據分析的一對流式細胞分析點圖。這些圖像顯示淋巴結相鄰注射位點中padre-枝狀物體內靶向小鼠dc和b細胞。淋巴細胞用cd11c(dc標記)、mhcii型和cd20(b細胞標記物)染色。右上方直方圖顯示注入枝狀物/gfp質粒在約6％dc中引起gfp表達，而下方點圖清晰顯示注入pdd/gfp質粒在>70％dc中引起gfp表達。圖9顯示帶有不同t輔助表位的枝狀物drha在淋巴結中體內靶向dc，表明drha促進gfp轉染到dc內。此實驗類似圖8所述，差異在於balb/c小鼠與偶聯iad限制性ha肽的枝狀物聯用。在注入drha/gfp質粒或枝狀物/gfp質粒後第5天取出毗鄰drha/gfp質粒或枝狀物/gfp質粒注射位點的淋巴結和原初淋巴結。所述圖表顯示針對dc用cd11c(dc標記)染色後獲自淋巴結細胞的流式細胞分析數據。上圖顯示如所述處理的小鼠引流淋巴結中發現的gfp陽性的dc數量。下圖顯示dc內gfp的平均螢光強度。這些結果清楚表明drha不僅增加體內轉染的dc數量，還提高進入所述細胞的質粒分子數。圖10是用與紅色(alexafluor)標記dsrna寡聚物複合的padre-枝狀物轉染的人b細胞的顯微圖。圖11是用與紅色(alexafluor)標記dsrna寡聚物複合的枝狀物轉染的狒狒pbmc(左圖)和用與紅色(alexafluor)標記dsrna寡聚物複合的padre-枝狀物轉染的細胞(右圖)的一對顯微圖。在加入pdd/dsrna-alexa-fluor或對照複合物到狒狒pbmc2小時後拍攝螢光顯微圖像。所述圖像顯示通過pdd靶向遞送多核苷酸到猴pbmc的高效性。圖12是用與gfp編碼質粒複合的枝狀物轉染的狒狒pbmc(左圖)和用與gfp編碼質粒複合的padre-枝狀物轉染的細胞(右圖)的一對顯微圖。用與gfp質粒複合的枝狀物轉染狒狒pbmc(左圖)和用與gfp質粒複合的padre-枝狀物轉染細胞(右圖)。在加入pdd/gfp質粒或對照複合物到狒狒pbmc後1天拍攝螢光顯微圖像。所述圖像顯示通過pdd靶向遞送質粒和質粒所編碼基因表達的高效性。圖13的結果顯示用與質粒(drp-ova質粒)複合的padre-枝狀物單次dna免疫優於質粒(ep-ova質粒)的體內電穿孔。圖14是用免疫小鼠血清的in-cellwestern分析中多孔板的一對照片，顯示用pdd/質粒-pcard抗原2次免疫後小鼠中誘導的高效價抗體反應。多孔板含有用抗原編碼質粒轉染的cos-7細胞(左圖)和用對照質粒轉染的cos-7(右圖)。圖15是用免疫小鼠血清的in-cellwestern分析中多孔板的圖和系列照片，顯示用pdd/質粒2次免疫後小鼠中誘導的高效價抗體反應。還顯示了用與編碼gfp或ova的質粒複合的padre-枝狀物免疫一次或者用與編碼ccr5、vgpcr、cathl或p2的質粒複合的padre-枝狀物免疫二次後的in-cellwesternflisa結果。圖16是用免疫小鼠血清的in-cellwestern分析中多孔板的一對照片，顯示用pdd/質粒-vgpcr免疫一次的小鼠中誘導的抗體反應在用pdd/質粒-vgpcr第二次免疫後進一步增強。這些結果顯示用pdd/質粒-vgpcr單次免疫產生的抗體反應在加強免疫時提高。圖17顯示g5枝狀物、偶聯物和肽的紫外可見光譜。圖18顯示在預防性設定中通過本文所述疫苗(padre-枝狀物/ova質粒)消除b16/ova腫瘤。發明詳述本文描述了基於納米顆粒的疫苗、組合物、藥盒和方法，用於有效體內遞送一種或多種免疫用抗原和生成抗體(例如單克隆抗體)，以及用於有效遞送肽、蛋白、sirna、rna或dna到papc或mhcii型陽性細胞(例如腫瘤細胞)。在典型疫苗或組合物中，帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物偶聯mhc靶向和免疫原性肽如t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha等)且與至少一個分子偶聯或結合以誘導對象中對特定抗原的免疫應答。所述分子可以是細菌、真菌、原生動物或病毒來源的蛋白或肽，或衍生自這些抗原的片段、碳水化合物、或碳水化合物模擬肽。所述分子也可包括用於治療自身免疫病的自體抗原。另外，所述抗原分子也可含有一種或多種核酸，包括哺乳動物質粒中編碼至少一種抗原的的核酸。例如，抗原可以是引起對象(例如哺乳動物)中一種或多種免疫原性蛋白表達和誘導針對所表達蛋白的強烈和特異免疫應答的一種或多種核酸。在另一個示例中，抗原也可以是經加工並呈遞的免疫原性肽或多肽。帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物可偶聯二種或更多不同抗原，且類似地可偶聯各編碼不同抗原的二種或更多核酸。本文所述的疫苗或其他組合物可包括與一種抗原偶聯的多個帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物(例如，與5拷貝特定抗原偶聯的5個枝狀物)，或與多個不同抗原偶聯的多個帶電(例如帶正電)、高度分支的聚合枝狀物(例如，與5種不同抗原偶聯的5個枝狀物)。所述枝狀物基於該枝狀物(正電)與抗原(負電)的相反電荷而形成與抗原(核酸或蛋白)的複合物(偶聯物)，或所述偶聯可以是共價化學連接。在一種實施方式中，本文所述的基於納米顆粒體內遞送抗原的方法包括注射疫苗，所述疫苗由與帶電(例如帶正電)的高度分支聚合枝狀物(例如padre衍生枝狀物(pdd))結合的抗原編碼dna質粒、或與該枝狀物偶聯的抗原肽或多肽組成，所述枝狀物還偶聯mhc靶向和免疫原性肽如t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha等)。帶負電的質粒自然結合帶正電的padre-枝狀物，而肽或多肽抗原若非帶負電則可化學連接padre-枝狀物。在其他實施方式中，枝狀物帶負電以結合帶正電的蛋白和肽。表面暴露的抗原或編碼抗原的核酸可通過本領域已知的任何合適方法與所述枝狀物偶聯。偶聯方法包括離子或非離子性質的化學複合、靜電結合或共價結合。如本文所述偶聯t輔助表位的枝狀物可以是多價的；它可在其表面呈遞超過一個拷貝或種類的抗原或核酸。呈遞多價或凝聚抗原(或編碼抗原的核酸)可改善對象的免疫應答。一個或多個拷貝或種類的抗原或核酸可通過2個或更多單獨接頭或間隔件或者通過共同接頭或間隔件與枝狀物結合。本文所述組合物、藥盒和疫苗具有預防和治療性應用，即可用作預防劑防止對象中疾病或病症發生，以及治療患病或有病症的對象。本文所述疫苗可用於產生免疫應答抵禦任何傳染性病原體或癌症。本文所述治療劑可用於靶向單核細胞，特別是b細胞，且可用於治療並發的b細胞慢性淋巴細胞白血病和多發性骨髓瘤。本文所述的納米顆粒(例如padre衍生枝狀物)與治療劑(例如藥物)的組合可以多種形式使用，例如納米顆粒與治療劑的混合物，靜電結合以形成複合物，化學偶聯所述治療劑與納米顆粒等。治療劑的示例包括但不限於毒素、irna、sirna、微小rna、質粒(例如編碼腫瘤抑制基因)、自殺基因(例如tk)或者阻斷或改變腫瘤增殖和/或存活的任何基因、(紫杉醇)(百時美施貴寶公司(bristol-myerssquibb))、抗體、美法侖、強的松、薩力多胺(mpt)、(硼替佐米)(千年製藥公司(milleniumpharmaceuticals))、來那度胺和地塞米松或這些試劑的任意組合。類似地，本文所述組合物和方法可用於治療自身免疫失調，其中所述治療劑到達(遞送到)免疫細胞，所述免疫細胞包括單核細胞、dc、t細胞或b細胞。本文所述組合物可與佐劑例如(但不限於)聚i:c一起使用，其帶負電且如本文所述與納米顆粒平臺形成複合物。下述優選實施方式描述了這些組合物、疫苗、藥盒和方法的適應性變化。然而，通過這些實施方式的描述，可基於下面描述形成和/或實施本發明的其他方面。生物學方法本文描述了涉及常規分子生物學技術的方法。這類技術在本領域公知且在方法學專著中有詳述，如molecularcloning:alaboratorymanual(《分子克隆：實驗室手冊》)第3版，第1-3卷，sambrook等編，冷泉港實驗室出版社(coldspringharborlaboratorypress)，紐約州冷泉港，2001；currentprotocolsinmolecularbiology(《新編分子生物學操作》)，ausubel等編,紐約格林出版社和韋利科學出版社(greenepublishingandwiley-interscience)，1992(定期更新)。免疫學技術在本領域公知且在方法學專著中有詳述，如immunology(《免疫學》)第93卷，frederickw.alt編，學術出版公司(academicpress,inc.)，麻薩諸塞州伯靈頓，2007；makingandusingantibodies:apracticalhandbook(《抗體製作與使用：實用手冊》)，garyc.howard和matthewr.kaser編，crc出版社(crcpress)，佛羅裡達州波卡拉頓，2006；medicalimmunology(《醫學免疫學》)第6版，gabrielvirella編，健康信息出版公司(informahealthcarepress)，英國倫敦，2007；harlow和lane的antibodies:alaboratorymanual(《抗體：實驗室手冊》)，冷泉港實驗室出版社，紐約州冷泉港，1988。基因轉移和基因治療的常規方法也可調整用於本發明。參見例如genetherapy:principlesandapplications(《基因治療：原理和應用》)，t.blackenstein編，施普林格出版公司(springerverlag)，1999；genetherapyprotocols(methodsinmolecularmedicine)(《基因治療方案(分子醫學方法)》)p.d.robbins編，美國休曼出版社(humanapress)，1997。生產疫苗和給予疫苗的方法也在本領域公知且詳述於例如vaccineprotocols(methodsinmolecularmedicine)(《疫苗方案(分子醫學方法)》)，andrewrobinson、martinp.cranage和michaelj.hudson，第2版，美國休曼出版社，新澤西州託託華，2003；vaccineadjuvantsanddeliverysystems(《疫苗佐劑和遞送系統》)，manmohansingh，第1版，約翰韋利公司，新澤西州霍伯肯，2007；arvina.m.和greenbergh.b.，virology344:240-249,2006；和r.morenweiser,genetherapy增刊1:s103-s110,2005。構建和使用疫苗以及pamam枝狀物也描述於例如arashkia等，virusgenes40(1):44-52,2010；velders等，jimmunol.166:5366–5373,2001；和s.chauhan,n.k.jain,p.v.diwan.(2009)pre-clinicalandbehaviouraltoxicityprofileofpamamdendrimersinmice(「pamam枝狀物在小鼠中的臨床前和行為毒性分布」)，proceedingsoftheroyalsocietya:mathematical,physicalandengineeringsciences(《皇家學會論文集a：數學、物理和工程科學》)(在線出版日期：2009年12月3日)。偶聯核酸、肽或多肽的枝狀物的合成枝狀物作為支架集中dna，為和帶負電的dna或rna發生強靜電作用優選完全帶正電的枝狀物。例如，所得枝狀物/t輔助表位/dna複合物具有的淨電荷取決於可調整的n/p比例(胺與磷酸根或電荷比)。本文所述枝狀物偶聯t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)和抗原、編碼抗原的核酸、或sirna，其中所述至少一種t輔助肽和所述抗原、核酸、或sirna偶聯於所述枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合papc。在一種實施方式中，枝狀物偶聯至少一個padre肽(例如2、3、4、5個等)和肽或多肽抗原。在此實施方式中，枝狀物通常偶聯或結合(例如通過靜電結合)多個所述肽或多肽抗原。當抗原是小抗原(特別是小肽或碳水化合物)時，偶聯或結合數個抗原(例如多個相同抗原)可能特別有用，因為小抗原通常由於半抗原相關大小問題而不能引發有效免疫應答。因此在本文所述枝狀物/t輔助肽/核酸偶聯物中包括多拷貝的抗原可提高所述抗原的免疫原性。在另一實施方式中，枝狀物偶聯padre肽且結合編碼抗原的核酸。在另一實施方式中，枝狀物偶聯padre肽且結合針對感興趣基因的sirna。在這些實施方式中，可用任何合適方法製備所述枝狀物並偶聯t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)及結合核酸(例如dna、sirna)或肽或多肽。生成和使用枝狀物的方法在本領域熟知且已有描述，例如zhangj-t等，macromol.biosci.2004,4,575–578及美國專利號4,216,171和5,795,582，其都通過引用納入本文。也參見：d.a.tomalia,a.m.naylor和w.a.goddardiii，starburstdendrimers:molecular-levelcontrolofsize,shape,surfacechemistry,topology,andflexibilityfromatomstomacroscopicmatter(「星形枝狀物：分子水平控制大小、形狀、表面化學、拓撲學和從原子到宏觀物質的靈活性」)，angew.chem.int.ed.engl.29(1990)，138-175。在本文所述實驗中，使用pamam枝狀物。然而，可使用任何合適的帶正電、高度分支的聚合枝狀物。其他帶正電、高度分支的聚合枝狀物的示例包括聚(丙烯亞胺)(ppi)枝狀物，或更普遍的是其表面具有伯胺基的任何其他枝狀物。本文所述padre枝狀物(padre衍生枝狀物)可通過任何合適方法製備。製作和使用padre的方法在本領域已知。參見例如美國專利號5,736,142。為生成美國專利號5,736,142所述padre肽，使用最初由jardetzky等(emboj.9:1797-1083,1990)描述的策略，將含有mhc結合關鍵側鏈的錨定殘基插入13個殘基的聚丙氨酸肽。例如，padre肽可根據美國專利號5,736,142所述方法製得，或可購得(例如來自anaspec公司，加利福尼亞州佛利蒙市)。由於尺寸相對較小，所述padre肽可根據常規技術在溶液中或固體支持物上合成。多種自動化合成儀有市售且能根據已知操作使用。或者，可使用重組dna技術，其中將編碼t輔助表位的核苷酸序列插入表達載體，轉化或轉染到合適宿主細胞中且在適於表達的條件下培養。這些過程在本領域公知，由sambrook等(同上)所綜述，其通過引用納入本文。本文所述padre肽可包括n和c末端殘基的修飾。技術人員應理解可修飾n和c末端以改變所述肽的物理或化學性質，例如用於影響結合、穩定、生物利用度、易於連接性等。本文所述padre肽可以多種方式修飾以提供所需特性，例如改善藥理學特徵，而同時保持未修飾肽的幾乎所有生物學活性。在本文所述實驗中，通過所述padre肽的–cooh末端與所述枝狀物某一胺基間的簡單醯胺偶聯來製成所述padre-枝狀物偶聯物。所述padre肽(ac-d-ala-lys-cha-val-ala-ala-trp-thr-leu-lys-ala-ala-ala-d-ala-ahx-cys-oh)(seqidno:1，ac＝乙醯化；d-ala＝d-丙氨酸；cha＝環己基丙氨酸；ahx＝氨基已酸)以乙醯化形式購自anaspec公司(加利福尼亞州佛利蒙市)以保護胺基末端並防止其反應。購買的肽具有95％的最小純度。所述醯胺偶聯反應在dmf溶液中以標準條件進行(參見圖1，底部示意圖)。為控制附於各枝狀物表面的padre表位數量，反應中使用2:1的肽/枝狀物攻擊比，嘗試每個枝狀物僅結合幾個肽以使大部分胺基保持游離從而在該枝狀物上有大量正電荷。在典型實施方式中，本文所述的多個padre-枝狀物偶聯物是其上附有0、1、2、3個等padre(或其他肽)的枝狀物分布。預期相對群體遵循泊松分布。padre(akxvaawtlkaaa，seqidno:2)以高或中等親和力(ic5095％的apc且不再需要純化難以提純的蛋白。這類蛋白可以是多蛋白複合物的一部分，可以是膜蛋白，且可以是不正確摺疊和不溶的。本文所述枝狀物偶聯物不需要蛋白的糖基化或翻譯後修飾，它們標記蛋白結構或摺疊的幹擾，大幅節約成本和時間。padre-枝狀物靶向並遞送核酸到小鼠、狒狒和人的pbmc，使得此平臺成為從小鼠到非人靈長類動物和人的快速翻譯研究的理想候選。同樣如上所述，在另一實施方式中，誘導免疫應答的疫苗包括油包水乳液和至少一種枝狀物，其偶聯至少一種t輔助肽(例如，表位如padre肽或流感ha)和一種肽或多肽抗原，其中所述至少一種t輔助表位和所述肽或多肽抗原偶聯於所述枝狀物外表面且能誘導針對所述肽或多肽抗原的免疫應答。具有弱免疫原性的肽或多肽如本文所述偶聯(複合)t輔助表位/枝狀物複合物時誘導強免疫應答。帶負電荷的多肽和肽可與例如padre-枝狀物複合，而不需要共價結合。例如，padre-枝狀物的油包水乳液產生進一步的佐劑活性和貯存效果。如上所示，本文所述組合物和疫苗具有預防和治療性應用；它們可用於預防或防止對象中疾病或病症發生以及治療患病或具有病症的對象。本文所述疫苗可用於引起免疫應答抵禦任何傳染性病原體或癌症。傳染性病原體的示例包括病毒，例如但不限於流感、hiv、登革病毒、輪狀病毒、hpv、hbv、hcv、cmv、hsv、hzv和ebv，以及病原體，包括瘧疾的致病劑，惡性瘧原蟲(plasmodium(p)falciparum)、三日瘧原蟲(p.malariae)、卵形瘧原蟲(p.ovale)、間日瘧原蟲(p.vivax)和諾氏瘧原蟲(p.knowlesi)；包括利什曼原蟲(leishmania(l))的致病劑，碩大利什曼原蟲(l.major)、熱帶利什曼原蟲(l.tropica)、衣索比亞利什曼原蟲(l.aethiopica)、墨西哥利什曼原蟲(l.mexicana)、杜氏利什曼原蟲(l.donovani)、嬰兒利什曼原蟲(l.infantum)同恰氏利什曼原蟲(l.chagas)；包括炭疽桿菌、百日咳桿菌(bordetellapertussis)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumonia)和腦膜炎球菌(meningococcus)在內的病原細菌。在本文所述實驗中，padre-枝狀物消除小鼠中已建立的黑素瘤。然而，本文所述與t輔助肽和抗原或抗原編碼核酸偶聯的枝狀物可用於產生針對任何癌症的特異性免疫應答。其他癌症的示例包括hpv引起的宮頸癌(例如e7/e7腫瘤相關抗原(taa)或編碼這些抗原的質粒可複合本文所述t輔助表位/枝狀物(例如padre-枝狀物))、人黑素瘤(例如trp-1、trp-2、gp-100、mage-1、mage-3和/或p53可用作taa且複合本文所述t輔助表位/枝狀物(例如padre-枝狀物))、和前列腺癌(例如tsa可用作taa且複合本文所述t輔助表位/枝狀物(例如padre-枝狀物))。對於肺腫瘤、乳腺腫瘤和白血病也類似，可使用任意合適taa，許多已有描述。許多這種taa在不同癌症中共有(例如cea、muc-1、her2、cd20)。taa或編碼這些抗原的質粒的混合物可用於製成本文所述通用、多用途癌症疫苗。在本文所述疫苗的一個示例中，cd4表位/枝狀物(例如padre-枝狀物)可複合超過一種抗原或超過一種編碼所述抗原的質粒。或者，各與一種抗原或編碼一種抗原的一種質粒複合的多個疫苗可用作不同病原體或不同癌症的疫苗。將抗原遞送給哺乳動物並誘導免疫應答的方法本文描述了將抗原遞送給哺乳動物(例如人)並誘導生產針對該抗原的單克隆抗體以引起所述哺乳動物中免疫應答的方法。一種典型的方法包括以下步驟：將含有至少一種帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)的組合物給予哺乳動物，所述載體偶聯有mhc靶向和免疫原性肽(例如，t輔助肽如padre肽或流感ha等)和至少一種肽或多肽抗原或者至少一種編碼所述至少一種抗原的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種核酸或者至少一種肽或多肽抗原偶聯於所述帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)的外表面，使得所述至少一種mhc靶向和免疫原性肽(例如t輔助肽)特異性結合papc且所述至少一種mhc靶向和免疫原性肽(例如t輔助肽)、至少一種帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)和所述至少一種核酸或者至少一種肽或多肽抗原的組合能誘導針對該抗原的免疫應答。在此方法中，所述組合物給予的量有效誘導mhcii型介導的t輔助細胞激活，在所述哺乳動物中產生單克隆抗體和針對該抗原的免疫應答。組合物還可包括油包水乳液。所述至少一種枝狀物通常還偶聯poly(i:c)，所述組合物通常還包括藥學上可接受載體。所述至少一種t輔助表位可以是pan-dr表位，例如各具有seqidno:1胺基酸序列的2個pan-dr表位。或者，所述至少一種t輔助表位可以是除了pan-dr以外的表位(padre表位)，例如流感ha。通常，所述至少一種枝狀物是g5枝狀物。在一種實施方式中，所述哺乳動物患有癌症，所述抗原是癌抗原，所述組合物是所述癌症的疫苗。在另一實施方式中，所述哺乳動物患有傳染病，所述抗原是來自傳染性病原體的抗原，所述組合物是所述傳染性病原體的疫苗。在這類實施方式中，給予所述組合物通常在哺乳動物中不產生局部不良反應。這些方法通常通過在所述哺乳動物外製成所述組合物(例如疫苗)並將所述組合物給予所述哺乳動物來進行，所給予的量足以在所述哺乳動物中刺激免疫應答抵禦所述抗原，例如癌抗原或來自傳染性病原體的抗原。本文所述組合物、疫苗和方法可用於任何合適對象，例如動物如哺乳動物(例如人類、嚙齒類、狗、貓、山羊、綿羊、牛、馬等)。患有癌症或傳染病或者具有發病風險的人類病人是典型對象。遞送sirna到papc的組合物和方法本文也描述遞送sirna到papc的組合物和方法。在一種典型實施方式中，遞送sirna到papc的組合物包括至少一種帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)，其偶聯有至少一種mhc靶向和免疫原性肽(例如t輔助肽)和sirna。所述至少一種mhc靶向和免疫原性肽(例如t輔助表位)和所述sirna偶聯於所述至少一種帶電(例如帶正電)聚合載體(例如枝狀物)的外表面，從而所述至少一種t輔助表位特異性結合papc。所述sirna可針對(特異於)任何感興趣的基因(例如foxp3、cd-28、ctla-4)。所述組合物還可包括油包水乳液。遞送sirna到papc的典型方法包括以下步驟：提供含有至少一種枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯有至少一種t輔助肽和至少一種sirna，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種sirna偶聯於所述枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助表位特異性結合papc；將所述組合物在一定條件下給予哺乳動物，該條件下偶聯有至少一種t輔助肽和至少一種sirna的所述至少一種枝狀物結合papc且所述sirna進入所述papc並在所述papc內表達。所述組合物還可包括油包水乳液。在此方法中，所述sirna可針對(特異於)任何感興趣的基因(例如foxp3)以使感興趣基因的表達沉默。在一個示例中，用針對foxp3的sirna使foxp3的表達沉默，foxp3是誘導調節t細胞的分子，該細胞抑制免疫應答並作為免疫應答的負調節。此實施方式對癌症治療特別有用，其中調節t細胞抑制免疫治療和幹預。調節t細胞表達mhcii型且可通過padre-枝狀物或其他cd4表位-枝狀物而靶向。另一個示例是cd4t細胞上傳遞抑制信號給t細胞的ctla-4。在ctla-4特異性sirna複合padre-枝狀物的實施方式中，所述複合物靶向含cd4t細胞的mhcii型表達細胞並使ctla-4表達沉默。ctla-4表達越低則針對病原體或癌症的免疫應答越高，且當遞送到papc中時其防止或減少免疫應答抑制分子的表達(或當宿主進行免疫接種時，提高針對病原體、癌症的免疫應答)或者提高免疫應答，包括b7.1、lfa-3、icam-1(誘導t細胞活化所需的信號2)，用於治療自身免疫病如銀屑病。在典型實施方式中，本文所述組合物包括的sirna特異於共抑制和共刺激分子及其推定的共刺激受體(例如foxp3、cd28、ctla-4)。序列特異性sirna結合靶核酸分子，抑制其表達。sirna有效處理異常細胞、異常細胞生長和腫瘤，包括由傳染性致病劑導致的腫瘤。提供了遞送sirna的組合物和其治療方法。本領域已知構建和使用核酶、sirna和反義分子的方法(例如，isakay.，curropinmolther第9卷:132-136,2007；sioudm.和iversenp.o.，currdrugtargets第6卷:647-653,2005；mouldysioud的ribozymesandsirnaprotocols(methodsinmolecularbiology)(《核酶和sirna方案(分子生物學方法)》)第2版，2004，美國休曼出版社，紐約州紐約市)。「反義」核酸可包括與編碼蛋白的「有義」核酸互補的核苷酸序列，例如與雙鏈cdna分子編碼鏈互補或與mrna序列互補。所述反義核酸可與感興趣基因的完整編碼鏈或僅其中一部分互補。在另一實施方式中，所述反義核酸分子與編碼感興趣基因的核苷酸序列編碼鏈的「非編碼區」(例如5'和3'非翻譯區)反義。反義試劑可包括例如約8到約80個核鹼基(即約8到約80個核苷酸)，如約8到約50個核鹼基，或約12到約30個核鹼基。反義化合物包括核酶、外部指導序列(egs)寡核苷酸(寡核苷酸酶)、和其他與靶核酸雜交並調節其表達的催化性短rna或催化性寡核苷酸。反義化合物可包括至少8個連續核鹼基的延伸，其與靶基因(即感興趣基因)序列互補。寡核苷酸不必與其可特異性雜交的靶核酸序列100％互補。當寡核苷酸與靶標的結合幹擾所述靶分子正常功能引起功能喪失，並存在足夠的互補度以防止所述寡核苷酸在特異性結合所需條件下與非靶標序列非特異性結合時，寡核苷酸是可特異性雜交的，特異性結合所需條件在體內分析或治療性處理的情況下即生理條件，或者在體外分析的情況下即進行所述分析的條件。rna幹擾(rnai)是顯著有效過程，其中雙鏈rna(dsrna，本文中也稱小幹擾rna為sirna，或者稱雙鏈小幹擾rna為dssirna)在動物和植物細胞中誘導序列特異性同源mrna降解(hutvagner和zamore，curr.opin.genet.dev.，12:225-232(2002)；sharp，genesdev.，15:485-490(2001))。在哺乳動物細胞中，可通過雙股小幹擾rna引發rnai(sirna)(chiu等，mol.cell.，10:549-561(2002)；elbashir等，nature，411:494-498(2001))，或是通過微小rna(mirna)、功能性小髮夾rna(shrna)、或用dna模板與rna聚合酶iii啟動子在體內表達的其他dsrna(zeng等，mol.cell，9:1327-1333(2002)；paddison等，genesdev.，16:948-958(2002)；lee等，naturebiotechnol.，20:500-505(2002)；paul等，naturebiotechnol.，20:505-508(2002)；tuschl,t.，naturebiotechnol.，20:440-448(2002)；yu等，proc.natl.acad.sci.usa，99(9):6047-6052(2002)；mcmanus等，rna，8:842-850(2002)；sui等，proc.natl.acad.sci.usa，99(6):5515-5520(2002))。所述dsrna分子通常每條鏈包括16-30個核苷酸，例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個，其中一條鏈與所述mrna中的靶區域基本相同，例如至少80％(或更多，例如85％、90％、95％或100％)相同，例如有3、2、1或0個錯配核苷酸，而另一條鏈與第一條鏈相同或基本相同。每條鏈也可具有一個或多個突出端(即非互補)核苷酸，例如1、2、3、4個或更多突出端核苷酸，如dtdtdt。所述dsrna分子可化學合成，或者可從dna模板體外轉錄或從例如shrna體內轉錄。可用本領域任何已知方法設計所述dsrna分子；本領域已知多種算法，參見例如tuschl等，genesdev13(24):3191-7(1999)，且許多可在網上獲得。陰性對照sirna通常與所選sirna具有相同的核苷酸組成，但與所述合適基因組沒有顯著的序列互補性。這種陰性對照可通過隨機置亂所選sirna核苷酸序列來設計；可進行同源性搜索以確保陰性對照不與所述合適基因組中任何其他基因同源。此外，可通過將一個或多個鹼基錯配引入序列來設計陰性對照sirna。在一些實施方式中，sirna可用修飾核苷酸(例如2f-rna)生成以使該sirna抗核酸酶。產生抗體的方法和藥盒本文描述了產生抗體的方法和藥盒，所述抗體可給予對象用於治療或預防性目的。目前遞送dna到細胞的方法效率低、複雜且誘導的免疫應答弱。然而，本文所述組合物和方法引起的強抗體反應顯示快速和高表達感興趣抗原。在一個產生抗體的方法中，本文所述枝狀物/t輔助肽偶聯物(例如padre-枝狀物)可與肽或多肽或核酸(例如dna)複合(偶聯)。poly(i:c)與枝狀物的結合對產生單克隆抗體特別有用，因為它減少注射間的頻率和間隔。在下述實驗中，單次注入複合dna的padre-枝狀物後，顯示gfp在角膜和皮膚中的遞送和表達以及強體液反應。目前50％的藥物靶向最難以純化的膜蛋白。本文所述組合物、藥盒和方法提供靶向難以純化蛋白的工具而不需純化它們。多克隆抗體是在免疫動物血清內包含的異質抗體分子群。因此，可用本文所述組合物、藥盒和方法生成的抗體包括多克隆抗體，以及單克隆抗體、單鏈抗體、fab片段、f(ab')2片段、和用fab表達庫生成的分子。單克隆抗體是特定抗原的同質抗體群，可用本文所述枝狀物/t輔助表位偶聯物和標準雜交瘤技術製備(參見例如kohler等，nature256:495，1975；kohler等，eur.j.immunol.6:511,1976；kohler等，eur.j.immunol.6:292,1976；hammerling等，monoclonalantibodiesandtcellhybridomas(《多克隆抗體和t細胞雜交瘤》，紐約愛思唯爾公司(elsevier)，1981；ausubel等，同上)。具體地，可通過生成抗體分子的任何技術獲得單克隆抗體，用例如kohler等，nature256:495，1975和美國專利號4,376,110所述的培養連續細胞系；人b細胞雜交瘤技術(kosbor等，immunologytoday4:72,1983；cole等，proc.natl.acad.sci.usa80:2026，1983)和ebv-雜交瘤技術(cole等，monoclonalantibodiesandcancertherapy(《單克隆抗體和癌症治療》)，arl公司(alanr.liss)，第77-96頁，1983)。這些抗體可以是任何免疫球蛋白種類，包括igg、igm、ige、iga、igd和其任意亞類。如本文所述產生mab的雜交瘤可在體外或體內培養。體內生成高效價mab的能力使得本文所述組合物、藥盒和方法對於mab生成特別有用。本文所述組合物、藥盒和方法中枝狀物/t輔助肽(例如padre-枝狀物)與編碼蛋白或抗原的核酸複合(偶聯或結合)而無需純化蛋白或抗原，因為所述編碼抗原或蛋白的核酸(例如質粒dna或mrna)提供以下優點：i)免除冗長和/或昂貴和/或費時的蛋白純化步驟，ii)通過宿主的細胞機制體內表達所述蛋白的天然形式，避免常規蛋白純化所得蛋白非天然形式的問題，和ii)產生治療性單克隆抗體的理想方法，其中所述靶標是所述蛋白或抗原的自然/天然形式。通過應用已知技術以在動物如小鼠中生成人抗體，可製得針對特定抗原的人抗體。參見例如fishwild,d.m.等，naturebiotechnology14(1996):845-851；heijnen,i.等，journalofclinicalinvestigation97(1996):331-338；lonberg,n.等，nature368(1994):856-859；morrison,s.l.，nature368(1994):812-813；neuberger,m.，naturebiotechnology14(1996):826；美國專利號5,545,806；5,569,825；5,877,397；5,939,598；6,075,181；6,091,001；6,114,598；和6,130,314。通過應用已知方法如美國專利號5,530,101、5,585,089、5,693,761和5,693,762所述，可從非人抗體製得針對特定抗原的類人或人源化抗體。一旦生成多克隆或單克隆抗體，可通過蛋白質印跡、免疫沉澱分析經標準方法或其他合適方法測試所述抗體的特異性抗原識別，例如ausubel等，同上所述。可通過系列注射產生抗血清，優選包括至少3次加強注射。可通過已知技術生成識別並結合特異表位的抗體片段。例如，這類片段包括但不限於可通過胃蛋白酶消化所述抗體分子產生的f(ab')2片段、可通過還原f(ab')2片段二硫橋產生的fab片段。或者，可構建fab表達庫(huse等，science246:1275，1989)以快速和簡單鑑定具有所需特異性的單克隆fab片段。遞送抗原給哺乳動物並在該哺乳動物中誘導產生針對所述抗原的單克隆抗體以獲得單克隆抗體的典型方法包括將含有至少一種枝狀物的組合物給予哺乳動物，所述枝狀物偶聯有至少一種t輔助肽和肽或多肽抗原或者編碼所述抗原的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸或者肽或多肽抗原偶聯於所述至少一種枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合papc且所述至少一種t輔助肽、至少一種枝狀物和所述核酸或者肽或多肽抗原的組合能誘導針對該抗原的免疫應答。在此方法中，所述組合物給予的量有效誘導mhcii型介導的t輔助細胞激活，導致產生針對該抗原的單克隆抗體。在小鼠內生成抗體的方法中，如上所述用抗原免疫小鼠後，從一隻或多隻小鼠中收穫抗體並篩選高效價。選擇具有高效價的小鼠，從該小鼠中取出脾。然後，與骨髓瘤融合，篩選最佳結合克隆。本文也描述了對抗原產生抗體(例如單克隆抗體)而無需蛋白純化的藥盒。典型的藥盒包括含有多個本文所述枝狀物/t輔助肽複合物(偶聯物)(例如padre衍生枝狀物、偶聯有流感ha的枝狀物等)的容器、和ph通常為7.4的生理緩衝液。在緩衝液或培養基的一個示例中，所述緩衝液或培養基包括伊格爾氏最低限度必需培養基，用hepes和碳酸氫鈉緩衝，補充有次黃嘌呤、胸苷、丙酮酸鈉、l-穀氨醯胺、和小於10％的牛血清白蛋白或包括胰島素和/或轉鐵蛋白的帶100mg/lcacl2的單獨血清蛋白，其中內毒素水平低於1.0eu/ml。在此實施方式中，藥盒用戶將至少一種編碼一種抗原的核酸(例如dna質粒)用緩衝液稀釋至100-200μg/ml，溫和振蕩的同時將所述組合物(t輔助-枝狀物)添加到經稀釋的質粒dna。在典型實施方式中，使用比例為10:1的t輔助-枝狀物與質粒dna(n:p)，大約是7倍(重量)的組合物與1倍(重量)的dna質粒。在一種實施方式中，遵循以下條件。室溫孵育10分鐘後，將含有10-20μg質粒dna/組合物的100ul混合物皮下注入小鼠。在14天中進行類似加強免疫，然後通過標準方法進行初始篩選、融合和最終篩選單克隆抗體。除了核酸外，本文所述組合物和藥盒可偶聯蛋白或抗原。在這樣的實施方式中，同樣10:1比例的所述組合物與蛋白通常形成複合物。本文所述藥盒中的用法說明描述了在需要時形成適當比例、緩衝的操作方案和進行優化和解決問題的方法。質粒dna或蛋白/抗原與本文所述padre-枝狀物偶聯物的複合通過在水溶液中混合這2種成分來完成，水溶液用含pbs的生理緩衝液緩衝於生理ph。典型n/p(胺與磷酸根)比是10:1。採用凝膠電泳或其他合適試驗證實dna與padre-枝狀物的完整複合。本文所述藥盒可與編碼感興趣抗原的任何載體或質粒一起使用。通常包括製備和使用本文所述枝狀物/t輔助表位複合物(偶聯物)的說明材料。儘管說明材料一般包括書面或印刷材料，它們並不限於如此。本文的藥盒和方法涵蓋任何能保存這些說明並將其與終端用戶交流的介質。這類介質包括但不限於電子存儲介質(例如磁碟、磁帶、膠捲、晶片)、光學介質(例如cdrom)等。這類介質可包括提供這些說明材料的網址。遞送核酸到細胞的組合物和方法在本文所述實驗中，遞送編碼gfp的基因被特異性遞送到mhcii型細胞(表達mhcii型的細胞)且觀察到所述基因表達。因此，本文所述組合物和方法可用於任何基因治療應用。遞送核酸到細胞的組合物通常包括至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯有至少一種t輔助肽和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯於所述至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合所述細胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細胞內化。遞送核酸給細胞的方法通常包括使所述細胞接觸含有至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的組合物，所述枝狀物偶聯有至少一種t輔助肽和至少一種編碼肽或蛋白的核酸，其中所述至少一種t輔助肽和所述核酸偶聯於至少一種帶正電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合所述細胞且所述至少一種t輔助肽、至少一種帶正電的高度分支聚合枝狀物和所述核酸的組合被所述細胞內化。在典型實施方式中，所述肽或蛋白在所述細胞內表達。給予組合物本文所述疫苗和組合物可以任何適當製劑形式給予哺乳動物(例如狗、貓、豬、馬、嚙齒類、非人靈長類、人)。例如，含有與sirna偶聯的padre-枝狀物的組合物或含有與核酸或者肽或多肽抗原複合的padre-枝狀物的疫苗能配製在藥學上可接受載體或稀釋劑如生理鹽水或緩衝鹽溶液中。可基於給予模式和途徑及標準藥學實踐選擇合適的載體和稀釋劑。示範性藥學上可接受載體和稀釋劑以及藥物製劑的描述可參見本領域標準教材remington’spharmaceuticalsciences(《雷明頓藥學科學》)以及usp/nf。所述組合物可添加其他物質以穩定和/或保存所述組合物。本文所述組合物和疫苗可通過任何常規技術給予哺乳動物。這種給予通常是胃腸外(例如靜脈內、皮下、瘤內、肌肉內、腹膜內或鞘內引入)。所述組合物也可直接給予靶位點。所述組合物可以單次大劑量注射、多次注射或通過連續輸注(例如靜脈內、腹膜透析、泵輸注)給予。對於胃腸外給予，所述組合物優選製成滅菌無熱原形式。在治療性應用中，將本文所述組合物和疫苗給予已患癌症或感染有感興趣病原體(例如病毒)的個體。在預防性應用中，將本文所述組合物和疫苗給予具有癌症或傳染病(即感染有感興趣病原體(例如病毒))發病風險(例如遺傳傾向或環境接觸)的個體。在治療性應用中，將本文所述組合物和疫苗給予已患癌症或感染有感興趣病原體(例如病毒)的個體。在預防性應用中，將本文所述組合物和疫苗給予具有發展(例如遺傳傾向，或環境接觸)癌症或傳染病(即感染有感興趣病原體(例如病毒))風險的個體。有效劑量優選以有效量將本文所述疫苗和組合物給予哺乳動物(例如狗、貓、豬、馬、嚙齒類、非人靈長類、人)，即所述量能在處理的哺乳動物中產生所需結果(例如防止或消除哺乳動物中的癌，提供保護抵禦傳染病等)。可如下所述確定這個治療有效量。本文所述疫苗和組合物的毒性和治療功效可通過標準藥學過程測定，使用培養細胞或實驗動物以測定ld50(使50％群體死亡的劑量)。毒性和治療效果間的劑量比是治療指數且可表示為ld50/ed50比。優選表現出高治療指數的那些組合物。儘管可使用顯示副作用的那些組合物，必須仔細設計遞送系統使這些副作用的潛在損害最小化。優選組合物的劑量優選在含有低或無毒ed50的範圍內。根據所用劑型和給予途徑，所述劑量可在此範圍內變化。對於70kg的病人，本文所述組合物和疫苗用於初始免疫(即用於治療或預防性給予)的治療有效量範圍通常為約1μg到約25,000μg(例如1、100、500、2000、2500、10,000、15,000、25,000μg)偶聯有抗原或結合有編碼所述抗原的核酸的t輔助表位/枝狀物的複合物(例如，0.14μg-357μg的質粒dna或蛋白和0.86μg-2142.85μg的t輔助-枝狀物)，然後是約1μg到約2500μg複合物(疫苗)的加強劑量，根據病人反應和通過測量病人血液中的特定ctl活性和/或抗體反應所得情況進行數周到數月的加強免疫方案。在一種實施方式中，可以比上面劑量高>133倍的劑量將枝狀物每天給予哺乳動物共15次而無毒性(參見abhaysinghchauhan等2009proc.r.soc.a,466，第1535–1550頁.2009)。對於治療目前患有癌或傳染病的對象和/或剛診斷出有癌或傳染病的對象，在急性感染情況下，給藥優選在疾病第一徵兆或檢測到或手術取出腫瘤時或於診斷後不久便開始。然後是加強劑量，直到至少病症顯著減輕且之後持續一段時間。在慢性感染中，可能需要負荷劑量，然後是加強劑量。對於預防性用途，給藥可以在個體意識到癌症傾向時就開始，或在預期面臨傳染病之前。如醫學和獸醫領域所熟知，任一對象的劑量取決於許多因素，包括所述對象的尺寸、體表面積、年齡、待給予的具體組合物、給予時間和途徑、總體健康、和同時給予的其他藥物。已在臨床前研究以及臨床試驗中測試枝狀物如pamam。近期，fda授予iii期臨床試驗中的(星藥公司(starpharma)，澳大利亞墨爾本)「快速通道」地位。已知枝狀物在角膜中的治療性用途，枝狀物已用於角膜基因遞送。在角膜應用中使用枝狀物的示例包括角膜新生血管治療、光動力治療、和作為角膜等價物的組織工程。將poly(i:c)作為幹擾素的「天然」誘導劑給予人已超過40年。多項近期臨床試驗檢測了不同劑量和給藥途徑的安全性和增強的免疫原性；重複報導和確立了總體安全性和增強的免疫原性。實施例通過以下具體實施例進一步描述本發明。所述實施例僅提供用於說明且不應以任何形式構成對本發明範圍的限制。實施例1-基於納米顆粒的佐劑/靶向基因免疫平臺治療已建立的黑素腫瘤採用裸露dna的基因免疫用於生成天然形式的抗原。然而，目前基因免疫方法的低體內轉染效率、缺乏有效遞送和弱特異性嚴重限制其功效。為克服這些限制，本文開發並描述了抗腫瘤dna免疫的新型靈活的平臺，1)可體內特異性有效轉染papc，2)提供「危險信號」，引起自體papc成熟並從而引起強免疫應答，和3)激活可進一步加強所產生免疫應答的t輔助細胞。本文所述基於枝狀物的新型納米顆粒通常通過偶聯2種反應物來製備：5代端氨基pamam枝狀物、和靶向/免疫增強肽或通用t輔助表位(padre)。下述數據顯示此平臺i)獲得目標抗腫瘤效果，c57bl小鼠中已建立的高侵入性b16/lu8黑素腫瘤的腫瘤尺寸減小50％，ii)誘導針對免疫所用基因的產物的強免疫應答和ii)使小鼠和人apc的轉染效率升至2-3倍。此外，採用偶聯padre-枝狀物的gfp編碼質粒的體內實驗顯示引流淋巴結中產生gfp。材料和方法如上所述並加以下列改良而生成padre衍生的pamam-枝狀物。通過以適當n/p比在室溫孵育10分鐘來產生所述padre-枝狀物/dna或sirna複合物。將這種複合物加入原代pbmc或脾細胞的體外研究或皮下注射用於免疫目的。圖1顯示5代pamam枝狀物的padre修飾(偶聯)。為維持高度帶正電錶面以結合多個核酸，一個枝狀物分子通常有2個偶聯其表面的padre肽從而可保持其正淨電荷。將padre加入所述枝狀物引起特異性靶向apc和強cd4輔助。所述padre衍生的pamam-枝狀物不僅護送編碼抗原的質粒，還刺激先天和適應性免疫並作為「危險信號」。用無內毒素的maxiprep試劑生成不同質粒(包括pegfp-c1、pmax、gfp、trp-2、p2、pcard和pcdna3.1中的ova)。通過標準方法進行螢光免疫吸附試驗(flisa)和免疫螢光檢測(ifa)。簡要地，將轉染的cos-7細胞以0.02×106/孔接種於96孔板，固定細胞並進行透化。為測量產生的體液反應，將稀釋血清加入所述孔且採用irdye800cw標記的第二抗小鼠igg測量抗體反應。為製備枝狀物/dna複合物，將溶於無內毒素pbs中的1μg/μl製備dna與枝狀物或枝狀物-padre以不同電荷比複合。室溫孵育10分鐘後，將所述複合物加入細胞培養物或皮下、真皮內注射或注入角膜基質腔內。為免疫荷載b16-lu8黑素腫瘤的小鼠，5組雌性c57bl小鼠皮下移植(0.02×106)b16-f10細胞。在腫瘤移植後第2和10天，不同組分別接受i)無處理，ii)僅pcdna3.1(載體對照)，iii)與單獨枝狀物複合的trp-2，或iv)與padre-枝狀物複合的trp-2。每周進行2次腫瘤測量。結果鑑定已製備的padre-枝狀物。通過所述肽–cooh末端與所述枝狀物胺基之間的簡單醯胺偶聯製成所述肽-枝狀物偶聯物。反應中使用2:1的肽/枝狀物攻擊比例，嘗試各枝狀物僅結合幾個肽以保留大部分游離胺基離從而在該枝狀物上有大量正電荷。所述產物通過相對純水透析來純化至少24小時，隨後真空乾燥。通過1hnmr、紫外-可見光譜和maldi-tof質譜鑑定所收集產物，清油。nmr顯示對應於所述枝狀物質子的大峰和所述肽質子的一小組峰。所述padre-枝狀物偶聯物的maldi-tof質譜在m/z比枝狀物自身觀察到的峰高約3,000個單位處顯示峰。超出的質量對應於約2個肽表位(圖17)。所述數據確認各枝狀物上平均存在2個padre(圖17)。顯示了將多個核酸體外遞送到自體apc內。以1:5和1:10的電荷比達到最佳的體外多核苷酸遞送/轉染人原代外周單核細胞。圖2顯示sirna通過padre-枝狀物遞送(～％86)到純化的人b細胞，其中複合(偶聯)padre-枝狀物的alexafluor標記sirna與b細胞一起孵育4小時。細胞用cd19/fitc染色且紅色通道(pe)代表有sirna/alexafluor.man的細胞。參見圖3，顯示padre-枝狀物的體內dna遞送。編碼gfp或trp-2的質粒單獨注射或者與padre-枝狀物或枝狀物(即不複合padre的枝狀物)複合注射。圖像顯示注射後24和16小時在皮膚(左)和角膜(右)中的gfp表達。已證實注射padre-枝狀物複合物後24和16小時在皮膚和角膜中都有gfp有效表達。證實了體內的淋巴結靶向。皮下注射padre-枝狀物/gfp質粒複合物(5μg總質粒)後8天，取出相鄰淋巴結並與僅注射gfp-dna的小鼠淋巴結作比較。在免疫後第8天拍攝網狀淋巴結的螢光顯微圖像。觀察到毗鄰注射位點的淋巴結中的抗原表達，但對照淋巴結中未觀察到抗原表達。證實了體內淋巴結靶向。皮下注射padre-枝狀物/gfp質粒複合物(5μg總質粒)後8天，取出相鄰淋巴結並與僅注射gfp-dna的小鼠淋巴結作比較。在免疫後第8天拍攝網狀淋巴結的螢光顯微圖像。觀察到毗鄰注射位點的淋巴結中的抗原表達，但對照淋巴結中未觀察到抗原表達。如圖4所示，給予padre-枝狀物/質粒複合物後產生特異性免疫應答。用質粒/padre-枝狀物複合物免疫一次(gfp)或二次(ova)後觀察到強體液反應。圖5所示數據顯示padre-枝狀物治療已建立腫瘤。已知b16黑素瘤是侵入性小鼠腫瘤模型。移植b16黑素瘤細胞(頂部)或tsa(底部)的小鼠在腫瘤移植後第2或3天進行免疫接種，接著在1周後進行加強免疫。後續腫瘤測量清楚證實給予padre-枝狀物可具體在c57bl(iab)中產生保護性免疫應答，c57bl(iab)對padre結合有較高親和性。c57bl也通過誘導t輔助細胞而對padre響應更強。參見圖5，所述結果表明目標抗腫瘤效果，已建立的高侵入性b16/lu8腫瘤的腫瘤尺寸減小50％。有意選擇此侵入性模型以顯示該平臺的效能，其他平臺都失敗了。腫瘤生長延遲和腫瘤尺寸減小是前所未有的。事實上，腫瘤移植後第22天，在測試組(即這些動物接受如本文所述疫苗)中未檢測到腫瘤或無可觸摸的腫瘤，這與所有對照組顯著不同。此免疫所用dna量(疫苗劑量)比正常所用(20μg，共2次免疫)低許多。圖5中，下方圖是用balb/c小鼠的陰性對照，其中padre結合不適當，balb/ctsa腫瘤模型中的類似實驗未顯示效果。這清楚顯示通過mhcii型的遞送系統的特異性。這些數據清楚證實本文所述的靶向佐劑納米顆粒平臺導致基因遞送、所編碼抗原的強表達、抗原呈遞和誘導保護性免疫應答。因此，本文所述padre-枝狀物是新型有效的佐劑/靶向遞送工具和平臺，用於i)無蛋白的(單克隆)抗體生成，ii)免疫治療/防止具有假象印跡(deceptiveimprinting)的惡性腫瘤和傳染病，和iii)遞送sirna用於基於免疫的多種治療幹預。實施例2-體外靶向遞送和轉染效率參見圖6，體外靶向遞送pbmc產生77％的b細胞轉染效率。獲得來自健康供體的人pbmc。以600萬細胞/毫升rpmi培養基培養pbmc，所述培養基含有10％胎牛血清。將5μg的gfp編碼質粒稀釋於100ul生理緩衝液pbs，振蕩的同時將溶於50ulpbs的5μgpadre-枝狀物加入dna。室溫孵育10分鐘後，將gfp質粒和padre-枝狀物的混合物/複合物加入pbmc。在37℃/5％co2培養箱孵育24小時後，pbmc用cd19pe染色且通過流式細胞儀分析細胞。在總pbmc的43％中觀察到gfp表達，而在b細胞上門控時77％的b細胞表達gfp。對照組中，用相同比例的枝狀物和gfp質粒孵育的pbmc在總pbmc或b細胞中約11％和7％顯示gfp表達。與僅用培養基的pbmc比較，未觀察到主要的活力變化。這是多個實驗的代表。這些實驗證實i)將gfp質粒遞送到pbmc特別是表達mhcii型的細胞(b細胞)，和ii)由pbmc特別是由b細胞表達gfp。實施例3-將肽/蛋白體內遞送到小鼠dc和體外遞送到人b細胞將pdd/白蛋白-fitc遞送到純化的人b細胞(圖7)。參見圖8，此圖顯示padre-枝狀物體內靶向小鼠dc和其功效以及注射和淋巴結分析的時間軸。此實驗的結果表明i)(圖7)在不到2小時內將混合padre-枝狀物的白蛋白-fitc(一種蛋白)遞送入人b細胞內，ii)(圖8)在皮下注射後第5天，將偶聯枝狀物的padre(一種表位)體內遞送到淋巴結的b細胞和dc(所述padre-枝狀物複合gfp質粒以顯影所述複合物遞送到淋巴結/b細胞/dc)，iii)(圖9)在皮下注射後第5天，將偶聯枝狀物的流感ha輔助表位(一種表位)體內遞送到淋巴結的dc(所述padre-枝狀物複合gfp質粒以顯影所述複合物遞送到淋巴結dc)。這些數據代表多個實驗，在一些實驗中皮下注射各自複合gfp質粒的padre-枝狀物或ha-枝狀物後第3天取出淋巴結。這些結果確立了以下示例：將偶聯fitc的蛋白遞送到包括b細胞和dc在內的apc通過fitc顯影，以及將偶聯枝狀物的2種肽padre和ha輔助表位遞送到淋巴結細胞中，其中gfp質粒複合肽-枝狀物以促進顯影和分析所述複合物(與複合gfp編碼質粒的枝狀物肽相連)。在注射納米顆粒(padre-枝狀物/gfp編碼質粒)與對照5天後，通過在相鄰淋巴結中靶向和擴增dc的體內流式細胞分析數據顯示特異性體外和體內轉染dc(78％相比～7％的gfp表達)。padre衍生枝狀物(pdd)可增強遞送，因為它有助於以高親和力結合apc上所表達mhcii型的padre的調理效果。類似地，皮下注射時將ha-枝狀物(drha)/gfp質粒體內遞送到相鄰淋巴結中(圖9)。應注意在小鼠中，padre結合iab的mhcii型(c57bl小鼠)(圖8)，而所選ha表位結合iad的mhcii型(balb/c小鼠)(圖9)。顯示了用2種不同表位在2個不同小鼠品系中體內遞送獲得類似結果的可行性。apc靶向的遞送引起padre-枝狀物/gfp質粒在人pbmc(圖6)和純化的人b細胞(圖6)和c57bl小鼠脾細胞中表達gfp，和遞送padre-枝狀物/*dsrna到人b細胞(圖10)和猴pbmc(圖11)內是通過本文所述組合物將肽遞送到papc的其他體外證明。由於使用以結合mhcii型為獨特特徵的2種不同靶向肽，如本文中的實驗所示起作用，因此本文所述疫苗、方法和組合物涵蓋所有mhcii型結合肽。參見圖9，也製備與流感ha輔助表位偶聯的枝狀物(hdd)。hdd可用於balb/c小鼠。hdd在注入小鼠時靶向相鄰淋巴結中的dc。實施例4-padre-枝狀物遞送sirna到人b細胞和非人靈長類pbmc以及padre-枝狀物遞送質粒到非人靈長類pbmc。參見圖10，複合dssirna(對照sirna)的padre-枝狀物顯示體外靶向傳遞。將0.1μgdsrna稀釋於100ulpbs，振蕩的同時將溶於20ulpbs的0.7μgpadre-枝狀物加入alexafluor標記的dsdna。室溫孵育10分鐘後，將所述複合物加入在24孔板孔中的100萬個純化b細胞(在加有10％胎牛血清的rpmi中)。在37℃/5％co2培養箱孵育約1小時後，衝洗細胞並將其放置回所述孔(在加有10％胎牛血清的1ml新鮮rpmi中)，在螢光顯微鏡下以紅色通道分析。亮場和紅色通道下的細胞覆蓋圖像證實人b細胞吸收alexafluor標記的dsrna(圖10)。細胞在37℃/5％co2培養箱孵育過夜後用cd19(b細胞標記物)染色並通過流式細胞儀分析(圖2)。如圖2所示，>80％的b細胞是alexafluor(標記dsrna)陽性，而對照枝狀物/dsrna-alexafluor約6％是陽性。這些結果清楚證實padre-枝狀物強力遞送核酸到papc。測試來自狒狒(阿拉伯狒狒，papiohamadryas)的1個樣品和來自食蟹獼猴(macacafascicularis)的2個不同樣品的pbmc。圖11所示代表性螢光顯微圖像在加入各自複合sirna/alexafluor的padre-枝狀物或枝狀物後2小時獲取。類似地，將複合gfp質粒的padre-枝狀物或枝狀物加入pbmc，孵育24小時後分析(圖12)。結果顯示padre-枝狀物在低於2小時內將核酸遞送到猴pbmc中，而枝狀物僅顯示中等遞送。這些結果強烈提示padre-枝狀物對非人靈長類動物起作用。實施例5-比較padre-枝狀物納米顆粒和in-cell-arttm平臺本文所述padre-枝狀物提供特異性靶向papc，與in-cell-art的非特異遞送到所有細胞相反。in-cell-arttm平臺包括704聚合物，通過電穿孔將dna遞送到細胞而無特異性內置佐劑活性或用於結合apc的任何配體。目前，已知體內電穿孔是最佳的非病毒性基因免疫法。本文所述padre-枝狀物提供in-cell-art平臺不具有的t輔助細胞誘導。在上述實驗中，顯示所述padre-枝狀物在治療性腫瘤模型中有效，而in-cell-art未顯示在在體內腫瘤模型中有效。在上述實驗中，padre-枝狀物作為與體內電穿孔作比較的有力對照(圖13)。相反，in-cell-art僅顯示與裸露dna的比較。本文所述單次免疫padre-枝狀物與用於增強體液反應的體內電穿孔作比較。為進行此實驗，將padre-枝狀物與5μg質粒室溫混合，10分鐘後，用所述混合物皮下注射至小鼠。在單次接種後第28天用表達50kb16f10的ova攻擊用已接種偶聯ova編碼質粒的padre-枝狀物免疫的小鼠和對照小鼠。接受與質粒偶聯的padre-枝狀物的所有小鼠在腫瘤移植後第25天時受保護，而經體外電穿孔接受質粒的小鼠中40％受保護，僅接受dna的對照組中0％受保護。如圖13所示，結果顯示用padre-枝狀物/質粒(drp-ova)的單次dna接種在誘導抗ova抗體體液反應上優於體內電穿孔(ep)遞送質粒(ep-ova)。實施例6-padre-枝狀物在小鼠中誘導強體液反應如圖14-16所示，複合質粒的padre-枝狀物在小鼠中引發強體液反應。實施例7-通過padre-枝狀物/ova疫苗在預防性設定中消除b16/ova腫瘤6周齡的雌性c57bl小鼠以每籠5隻分組接受i)無處理，ii)用dermavax電轉儀通過「體內電穿孔」2次免疫20μgova質粒，或iii)用padre-枝狀物/ova質粒2次免疫(各20μg)。免疫間隔2周進行。免疫後10天，所有小鼠在右脅接受皮下注射(移植)100μlpbs中的50,000b16/ova腫瘤細胞。每周2次測量腫瘤且對每周數據進行作圖，如圖18所示。用padre-枝狀物/20μgova質粒的2次接種使得所有免疫小鼠中的b16/ova腫瘤完全消除，而100％無處理小鼠和60％經「體內電穿孔」接種小鼠維持荷瘤。殺死所有腫瘤大於15％體重的荷瘤小鼠。其他實施方式可對部分或全部的所述組合物、藥盒和方法步驟進行任何改進。本文引用的包括出版物、專利申請和專利在內的所有參考文獻通過引用納入本文，。使用本文提供的任何和所有實施例或示例性用語(例如，「如」)旨在闡述本發明，除非另有說明否則不對本發明範圍構成限制。例如，儘管本文所述實驗包括消除b16黑素瘤和誘導對gfp、ova、pcard、ccr5、vgpcr、mupar、cathl或p2抗原的強體液反應，本文所述疫苗、組合物和方法可用於多種其他治療和預防性應用，包括防止和消除其他癌類型、誘導免疫應答並因而誘導針對任何感興趣抗原(例如來自傳染性病原體的抗原)的免疫。在另一實施例中，本文所述疫苗、組合物和方法可用於遞送對細胞而言不是抗原的蛋白或肽。在此實施例中，用於遞送肽或蛋白到細胞的典型組合物包括至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物，其偶聯有至少一種t輔助肽和至少一種肽或蛋白，其中所述至少一種t輔助肽和所述至少一種肽或蛋白偶聯於所述至少一種帶電、高度分支的聚合枝狀物的外表面，從而所述至少一種t輔助肽特異性結合所述細胞。本文中關於本發明或所述優選實施方式的性質和優點的任何表述不用於限制，不應認為這些表述限制了所附權利要求。更普遍地，本說明書的語言不用於表明任何非權利要求的元素對本發明實施必不可少。在適用法律允許情況下，本發明包括對所附權利要求中引用對象的全部改進和等同方式。此外，除非本文另有說明或明顯與上下文矛盾，本發明包括任意上述元素組合的所有可能變化。序列表邁阿密大學(universityofmiami)p.m.達夫塔裡安(daftarian,pirouz)a.凱弗爾(kaifer,angel)p.塞拉菲尼(serafini,paolo)v.l.佩雷(perez,victor)b.b.布隆貝格(blomberg,bonnie)v.p.萊蒙(lemmon,vance)黎薇疫苗組合物和其使用方法7230-61wous61/165,7322009-04-0127patentinversion3.5116prt人工序列合成構建體乙醯化d-丙氨酸(1)..(1)ala(3)..(3)環己基丙氨酸d-丙氨酸(14)..(14)氨基己酸(15)..(15)氨基己酸1alalysxaavalalaalatrpthrleulysalaalaalaalaxaacys151015213prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)丙氨酸(3)..(3)環己基丙氨酸d-ala(13)..(13)2alalysxaavalalaalatrpthrleulysalaalaala1510313prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)d-ala(13)..(13)3alalysphevalalaalatrpthrleulysalaalaala1510413prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)d-ala(13)..(13)4alalystyrvalalaalatrpthrleulysalaalaala1510513prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)d-ala(13)..(13)5alalysphevalalaalatyrthrleulysalaalaala1510613prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)ala(3)..(3)環己基丙氨酸d-ala(13)..(13)6alalysxaavalalaalatyrthrleulysalaalaala1510713prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)d-ala(13)..(13)7alalystyrvalalaalatyrthrleulysalaalaala1510813prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)d-ala(13)..(13)8alalysphevalalaalahisthrleulysalaalaala1510913prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)環己基丙氨酸(3)..(3)d-ala(13)..(13)9alalysxaavalalaalahisthrleulysalaalaala15101013prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)d-ala(13)..(13)10alalystyrvalalaalahisthrleulysalaalaala15101113prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)d-ala(13)..(13)11alalysphevalalaalaasnthrleulysalaalaala15101213prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)環己基丙氨酸(3)..(3)d-ala(13)..(13)12alalysxaavalalaalaasnthrleulysalaalaala15101313prt人工序列合成構建體d-ala(1)..(1)d-ala(13)..(13)13alalystyrvalalaalaasnthrleulysalaalaala15101413prt人工序列合成構建體14alalysphevalalaalatrpthrleulysalaalaala15101513prt人工序列合成構建體15alalystyrvalalaalatrpthrleulysalaalaala15101613prt人工序列合成構建體16alalysphevalalaalatyrthrleulysalaalaala15101713prt人工序列合成構建體環己基丙氨酸(3)..(3)17alalysxaavalalaalatyrthrleulysalaalaala15101813prt人工序列合成構建體18alalystyrvalalaalatyrthrleulysalaalaala15101913prt人工序列合成構建體19alalysphevalalaalahisthrleulysalaalaala15102013prt人工序列合成構建體環己基丙氨酸(3)..(3)20alalysxaavalalaalahisthrleulysalaalaala15102113prt人工序列合成構建體21alalystyrvalalaalahisthrleulysalaalaala15102213prt人工序列合成構建體22alalysphevalalaalaasnthrleulysalaalaala15102313prt人工序列合成構建體環己基丙氨酸(3)..(3)23alalysxaavalalaalaasnthrleulysalaalaala15102413prt人工序列合成構建體24alalystyrvalalaalaasnthrleulysalaalaala15102511prt前病毒pr8病毒25serphegluargphegluilepheprolysglu15102613prt人工序列合成構建體環己基丙氨酸(3)..(3)26alalysxaavalalaalatrpthrleulysalaalaala1510277prt人工序列合成構建體27glyserglyglyglyglyser15當前第1頁12