Aprt家族基因在植物細胞分裂素毒性方面的應用的製作方法

2023-08-03 14:36:36 1

專利名稱：Aprt家族基因在植物細胞分裂素毒性方面的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體地說，涉及APRT家族基因在植物細胞分裂素毒性方面的應用。
背景技術：
自從上世紀五十年代激動素被發現以來，多種類型的細胞分裂素作為一類重要的植物生長調節物質被廣泛應用於農業生產和組織培養中。實踐中常用的細胞分裂素包括激動素和6-苄基腺嘌呤等。作為植物激素，微量的施用就能起到明顯的效果。在實際中施加的濃度往往遠高於細胞分裂素的生理濃度。這一方面是考慮到藥物的可溶和滲透性，另一方面考慮到藥效的持久性。但在應用過程中，由於細胞分裂素的施用不當，往往造成植物的毒副作用。這是在激素應用過程中不可忽視的問題。在擬南芥中的研究對細胞分裂素的相關副作用有了一定的認識。低濃度施加細胞分裂素後，可以刺激另一種植物激素乙烯的合成，而乙烯是逆境條件下用來抑制植物生長的一種重要的激素。乙烯生物合成的增加可以抑制植物的營養生長，使葉面積減小，光合作用強度下降，從而對植物產量增加不利。而高濃度的細胞分裂素的施加不僅能促進乙烯合成的增加，還會產生一些未知的毒性作用。但是關於細胞分裂素的毒性機理並沒有完全的理解。細胞分裂素的毒性作用是由遺傳控制的。這在之前的研究中有所暗示。Fabien Nogue等人建立了一套細胞分裂素的生物測定法。他們利用了一種菸草突變體zeal，細胞分裂素可以促進幼苗子葉和下胚軸部位的增厚增肥生長，而且這種生長的促進作用與細胞分裂素的濃度有很好的正相關性。但是在野生型菸草中這種促進作用並不能看到，這是由於野生型的菸草對細胞分裂素的毒性作用是敏感的。高濃度的細胞分裂素可以抑制野生型菸草的生長甚至殺死植株。雖然其中具體的分子機制並不清楚，但是這一現象告訴我們細胞分裂素對植物的毒害依賴於某些內源基因的功能。這些基因及所參與調控的生理過程正是需要我們去認識和研究的內容。

發明內容
本發明的目的是提供APRT家族基因在植物細胞分裂素毒性、細胞分裂素代謝調控或作為抗性篩選標記方面的應用。為了實現本發明目的，本發明提供APRT(adenine phosphoribosyltransferase) 家族基因在植物細胞分裂素毒性、細胞分裂素代謝調控或作為抗性篩選標記方面的應用， 所述APRT家族基因包括擬南芥基因APTl (adenine phosphoribosyltransferase 1)、其同源基因 APT2、APT3、APT4 和 / 或 APT5.其中，所述的基因APT 1在Genebank中的編號為At 1 g27450，基因CDS長度為 732bp，編碼243個胺基酸的蛋白，其核苷酸序列如Seq IDNo :1所示。APT2在Genebank中的編號為Atlg80050，基因CDS長度為579bp，編碼192個胺基酸的蛋白，其核苷酸 序列如Seq ID No:2所示。APT3在Genebank中的編號為At4g22570，基因CDS長度為552bp，編碼183個胺基酸的蛋白，其核苷酸序列如Seq ID No:3所示。APT4在Genebank中的編號At4gl2440，基因CDS長度為549bp，編碼182個胺基酸的蛋白，其核苷酸序列如Seq ID No:4所示。APT5在Genebank中的編號為At5gl 1160，基因CDS長度為576bp，編碼191個胺基酸的蛋白，其核苷酸序列如Seq ID No:5所示。進一步的，本發明提供擬南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或APT5 在製備細胞分裂素毒性敏感型或不敏感型轉基因植物方面的應用。進一步的，本發明提供擬南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或 APT5在培育從代謝上調控腺嘌呤和/或細胞分裂素水平的轉基因植物方面的應用，其是將 APT1、APT2、APT3、APT4和/或APT5基因全長克隆到不同種類的表達載體上，然後用這些表達載體轉化植物，獲得細胞分裂素代謝和/或腺嘌呤代謝調控相關的轉基因植物。進一步的，本發明提供通過敲除APRT家族基因增強植物細胞分裂素抗性或減少毒副作用方面的應用。另外，本發明還提供一種改造的APTl基因，APTl蛋白第90位的甲硫氨酸與細胞分裂素的代謝偏好有相關性，對第90位的胺基酸進行替換，例如替換成纈氨酸和異亮氨酸， 以改變APTl酶識別特異性底物的能力。本發明利用擬南芥的分子遺傳學研究優勢，在擬南芥中研究了細胞分裂素致毒的機理。發現擬南芥APTl基因(Atlg27450)是使細胞分裂素產生細胞毒性的關鍵酶，這一基因屬於腺嘌呤核糖磷酸轉移酶APRT家族。在APTl的催化下，自由鹼基形式的細胞分裂素被轉化為核苷酸形式的細胞分裂素。細胞分裂素是腺嘌呤的衍生物。在植物體內，腺嘌呤核苷酸參與了多種重要的生理過程，如ATP的合成，核酸的代謝等。其實這些小分子的腺嘌呤衍生物本身並不是產生毒性的直接分子，而經過植物體內APRT類酶的代謝之後可以變成正常代謝的競爭性分子，從而產生毒性。同理過量的細胞分裂素的施加也會導致細胞毒性。之前人們利用一些腺嘌呤衍生物可以致毒，推測具有相同的機理。細胞分裂素對植物生長和發育起到關鍵的調控作用，而對於細胞分裂素生理功能的精確的時空調節是植物完成正常生活必需的。APTl是潛在的調控體內細胞分裂素代謝的工具，在體內的細胞分裂素代謝中也有著重要的作用。前述的細胞分裂素為玉米素、異戊烯基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤或激動素等。本發明對擬南芥中的APRT基因家族各成員的功能分化有了新的理解。擬南芥 APRT基因家族中有5個基因，包括ΑΡΤΙ、APT2、APT3、APT4和APT5。其中APTl對細胞分裂素和腺嘌呤代謝中功能是最強的。已知這五個酶的突變體中只有APTl的突變體具有明顯的發育缺陷。aptl突變體有發育遲緩和雄性不育的表型。這主要是由於腺嘌呤代謝的缺陷而並非是由於細胞分裂素代謝的缺陷。本發明中發現APTl蛋白多個保守胺基酸位點的替換都可以造成酶功能的喪失，包括G168E、L99F、G195D、G196R、P85T和R149K。本發明中發現APTl第90位的甲硫氨酸有可能是APTl偏好細胞分裂素的結構基礎之一。APTl是一個多功能的酶，不只參與了腺嘌呤的代謝，還參與了細胞分裂素的代謝。 植物巧妙利用了同一種酶既調控了核苷酸的代謝，又調控了激素的代謝。對於植物激素的代謝是APRT類家族在進化過程中偶然獲得的一種功能，事實上，在原核生物中和動物中並不需要有細胞分裂素類的代謝。但是由於植物激素的重要性，植物中的APRT家族對細胞分裂素的催化能力被保留下來，並有所加強。發現酵母中的APRT酶ScAPRT對腺嘌呤代謝的催化能力遠強於擬南芥中APTl酶，但是APTl對細胞分裂素的催化活性要高於ScAPRT。決定APRT底物特異性的胺基酸對指導酶的設計改造有潛在的價值。本發明從分子水平找到了造成細胞分裂素應用毒副作用及調控細胞分裂素代謝的關鍵基因APTl。APTl基因及同一家族的APT2，APT3，APT4和APT5基因具有以下三個方面的應用第一，調控一種重要植物激素-細胞分裂素的代謝，從而可以對植物生長發育中涉及細胞分裂素作用的生理過程進行調控，例如細胞分裂和分化，組織脫分化和再分化，根冠比例，葉片衰老等。第二，通過敲除APTl基因增強細胞分裂素抗性或減少毒副作用，APRT類基因活性喪失的植物可以作為一個細胞分裂素毒性耐受的品系在農業育種中進行利用。第三，作為抗性篩選標記基因。過量表達APTl蛋白本身對植物無毒性，而且有利於腺嘌呤的補救合成代謝，利於能量代謝和遺傳物質的合成代謝。但在高於IOOuM的高濃度細胞分裂素及其腺嘌呤類似物處理條件下過量表達APTl即造成代謝毒性，符合作為篩選標記基因的特點，並且可以進行負篩選。


圖1為梯度激動素培養基上黑暗培養的擬南芥野生型Col-O㈧和突變體 ein2-5(B)的下胚軸和根的長度統計。圖2為細胞分裂素受體三重突變體ahk2_5 ahk3_7 crel-2在50mg/L激動素培養基上的表型。圖3為擬南芥野生型Col-Ο、突變體ein2_9 tt4、突變體ein2_5、EIN3ox、C9在梯度濃度的激動素培養基上生長6天的表型，1-5分別為COl-0、ein2-9 tt4、ein2-5、EIN3OX、 C9。圖4為C9突變體回交後的表型(aptl-4)和另外三個等位突變體aptl-l、aptl-2、 apt 1-3在50mg/L激動素培養基上的表型。圖5為apt 1突變體和過量表達在50mg/L激動素培養基上的表型。圖6為梯度激動素培養基上黑暗培養的Col-0、ein2-5、aptl突變體和過量表達植株的根(A)和下胚軸(B)的長度統計。圖7為aptl和APTl過量表達植株對不同形式細胞分裂素毒性的反應。圖8為aptl突變體內細胞分裂素信號通路激活相關的五個證據A，細胞分裂素通路marker基因的表達；B，暗處理導致的葉片衰老和葉綠素分解；C，花青素積累；D，細胞分裂素誘導的乙烯通路的激活；E，愈傷組織的形成。圖9為基本培養基MS和50mg/L激動素培養基上生長5天的aptlein2雙突變體 (A)及aptl CKX3ox雙突變體(B)幼苗的根長。圖10為APTl蛋白關鍵位點的胺基酸替換導致酶活性的顯著降低或喪失。圖11為酵母中ScAPRT與擬南芥APTl對玉米素和腺嘌呤的催化能力的比較，A，以玉米素為底物，B,以腺嘌呤為底物。 圖12為轉基因過量表達擬南芥APRT家族五個基因ΑΡΤΙ、APT2、APT3、APT4、APT5 以及酵母中ScAPRT基因的植株在50mg/L激動素培養基上生長5天的表型。aptl-Ι突變體作為對照Col-O。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。以下實施例中使用的玉米素、激動素、2-異戊烯基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤、2，4-D、 植物培養用MS salt均購自Sigma公司。乙烯突變體ein2_9、ein2_5、細胞分裂素的受體突變體ahk3-7crel_2及ahk2_5 crel-2雙突變體、aptl-1、aptl-2和aptl-3均購自ABRC擬南芥突變體庫，通過雜交得到 ahk2-5 ahk3_7 crel-2 三重突變體。擬南芥APRT基因家族五個基因APT1、APT2、APT3、APT4、APT5以及酵母中ScAPRT 基因的轉基因過量表達植物的構建利用PDr雙元表達載體。pDr載體來源於pEGAD載體 (GenBank :AF218816. 1)並經過改造切除了 EGFP基因並重新連接而成。通過分子克隆手段將APT2、APT3、APT4、APT5和ScAPRT基因的CDS導入pDr載體並利用農桿菌侵染法導入擬南芥。農桿菌菌株為GV3101。體外酶活測定的目的基因以Col-O生態型擬南芥和酵母AH109菌株的cDNA為模板擴增得到相應基因的⑶S並通過分子克隆手段導入pCOLD-TF載體中，pCOLD-TF載體購自Takara公司。His親和層析純化使用的Ni柱購自Qiangen公司。實施例1擬南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或APT5在植物細胞分裂素毒性以及細胞分裂素代謝調控方面的應用首先建立一個新的細胞分裂素突變體篩選體系。由於之前的突變體篩選往往在低濃度細胞分裂素條件下篩選，往往得到乙烯合成通路和乙烯信號轉導通路的突變體，為此本發明進行了濃度梯度的實驗以找到一個合適的細胞分裂素處理濃度。在高濃度玉米素 (大於100 μ Μ)處理時，黑暗生長的野生型幼苗下胚軸和根伸長被強烈抑制，乙烯不敏感突變體也有同樣的反應，說明這一濃度條件下細胞分裂素的作用主要通過一條獨立於乙烯信號轉導的通路(圖1)。本發明中所述的高濃度細胞分裂素處理及毒性濃度均為大於或等於 100 μ M的濃度。如圖2所示，細胞分裂素的受體ahk2-5ahk3-7Crel-2三重突變體對高濃度細胞分裂素也沒有抗性。說明細胞分裂素的毒性產生是不依賴於細胞分裂素的信號通路的。用乙烯不敏感的擬南芥突變體ein2-9 tt4做背景進行EMS誘變和篩選，用高濃度 (300 μ M)的激動素處理下是不敏感的。這一濃度下，野生型的根發育和子葉變綠過程受到強烈抑制。發現一株突變體C9，在這種處理條件下能正常生長。通過圖位克隆的方法找到了對應的突變位點，發現C9的突變位點位於一個腺嘌呤核糖磷酸轉移酶APTl (Atlg27450) 內。APTl屬於腺嘌呤核糖磷酸轉移酶(APRT)家族，催化了腺嘌呤的磷酸核糖轉移反應，是細胞內腺嘌呤單核苷酸的補救合成途徑中重要的酶。在C9突變體中，經過測序發現，由於G 到A的核苷酸替換導致第168位甘氨酸變成穀氨酸，從而導致蛋白功能的部分喪失。這一胺基酸位點在真核生物的APRT家族中非常保守，暗示它對於酶的構象維持和催化活性有非常重要的作用(圖3)。因此，本發明建立了 APTl基因和細胞分裂素毒性之間的關係，即 APTl直接參與了細胞分裂素的代謝，其代謝產物導致了植物的代謝紊亂並產生了毒性。發現aptl的另外三個等位突變體(aptl-1、aptl_2、aptl-3)，也對高濃度細胞分裂素不敏感，子葉可以變綠，根可以伸長生長(圖4)。進行互補實驗，發現將野生型的APTl基因過量表達到C9突變體或野生型中，能互補C9的細胞分裂素不敏感表型。過量表達APTl導致植物對高濃度的細胞分裂素超敏感， 在較低濃度激動素處理(100 μ M)時種子萌發就被強烈抑制，而且這種抑制是不可逆的。這一結果說明細胞分裂素的毒性由於體內APTl酶的表達量增高而增加，這種毒性作用導致了細胞無法正常分裂和分化而死亡。這些結果同樣說明擬南芥中APTl是細胞分裂素產生毒性作用的充分必要條件(圖5)。如圖6所示，暗中生長的aptl突變體對高於30 μ M的玉米素不再敏感，而APTl 過量表達植物對高於30μΜ的玉米素超敏感，根和下胚軸的伸長明顯受到抑制，對大於 100 μ M的玉米素處理下APTl過量表達導致種子萌發後即停止生長甚至不能萌發。由此，通過調控植物體內的APTl基因表達水平，可以改變植物對細胞分裂素毒性的耐受性.對於不同的細胞分裂素分子，包括玉米素、異戊烯基腺嘌呤、，6-苄基腺嘌呤和激動素，aptl突變體都表現出不敏感的表型，而APTl過量表達植物則有不同程度的超敏感。 異戊烯基腺嘌呤，6-苄基腺嘌呤的毒性作用最強，濃度為100 μ M時可以抑制過量表達植物的萌發，而激動素毒性較弱，玉米素最弱。由此本發明提供了 APTl基因的底物廣譜性。這一方面說明APTl對於不同的細胞分裂素都有催化活性，另一方面，不同細胞分裂素形式具有不同強度的毒性，可能來源於APTl對不同底物反應活性和結合能力的差異(圖7)。本發明進行了五個方面的研究，結果都支持活性細胞分裂素在aptl突變體中積累量增加。首先通過RT-PCR方法檢測aptl突變體內的細胞分裂素marker基因的表達。 細胞分裂素信號通路的marker基因在aptl突變體中表達量增加，說明細胞分裂素信號通路在aptl突變體中有較強的活性，增強的細胞分裂素信號可能由於aptl突變體中活性細胞分裂素的積累；第二，對aptl突變體的離體葉片進行避光處理，觀察到aptl的葉片在黑暗誘導的葉片衰老過程中衰老明顯延遲；第三，通過分光光度法檢測兩周的幼苗體內花青素的含量，發現aptl突變體幼苗有花青素積累的表型；第四，成株aptl突變體植株瘦小， 但aptl和ein2的雙突變體的生長則大大快於aptl，暗示aptl中由於細胞分裂素的通路激活，乙烯通路也被激活，從而抑制植物的營養生長；第五，通過組織培養的方法，觀察到 aptl突變體的下胚軸在特定激素條件下比野生型更容易受誘導形成愈傷組織。這些結果支持了本發明中APTl參與到植物體內細胞分裂素的代謝調控(圖8)。通過外源過量表達一個細胞分裂素的氧化酶CKX3以降低aptl突變體內的細胞分裂素水平，結果轉基因植物的根伸長明顯增長，但是並不能回復到野生型的程度，說明雖然 aptl調控的細胞分裂素可能部分參與了植物根長的調控，另外影響根長的原因推測是由於腺嘌呤或其他腺嘌呤類似物的代謝缺陷。同樣aptl ein2雙突變體的根長明顯長於aptl， 但沒有野生型長，暗示乙烯也並非是aptl根變短的最主要的因素。這些證據支持APTl參與到細胞分裂素的代謝過程(圖9)。以300 μ M激動素作為篩選體系，進一步的篩選得到多個新的突變體。這些突變體的APTl基因經過測序發現都存在突變。其中發現五個突變體有L99F、G195D、G196R、Ρ85Τ和R149K的胺基酸替換突變。將點突變 的基因構建到pCOLD-TF載體中，在體外表達並用鎳柱進行親和層析的純化，純化後的酶用來進行酶活性測定，發現L99F和G168E導致酶活性大大降低，而G195D，G196R，P85T和R149K突變體酶活性幾乎檢測不到(圖10)。採用相同的方法構建了酵母ScAPRT基因的體外表達質粒並進行體外表達和純化。體外表達的酵母的ScAPRT基因與擬南芥APTl對玉米素和腺嘌呤有不同的催化能力。 擬南芥APTl對腺嘌呤的催化能力遠遠低於酵母ScAPRT，而APTl對細胞分裂素的催化活性高於酵母ScAPRT酶(圖11)。本發明通過多序列比對的方法還發現，APTl第90位甲硫氨酸與人(纈氨酸)和酵母(亮氨酸)中的不同，由於這一位的胺基酸是與腺嘌呤的6位N形成氫鍵，而細胞分裂素和腺嘌呤的區別在於腺嘌呤上的6位N被異戊烯基等側鏈取代，增加了空間位阻。從而第90位的胺基酸可能決定了 APRT催化的底物偏好性。由此可見，通過敲除APTl基因，獲得了高濃度細胞分裂素毒性耐受和內源活性細胞分裂素積累的植物，而過量表達APTl基因則導致植物對細胞分裂素毒性的敏感性增強。實施例2擬南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或APT5在培育腺嘌呤和/或細胞分裂素調控轉基因植物方面的應用將ΑΡΤΙ、APT2、APT3、APT4和/或APT5基因全長通過PCR方法擴增，並通過分子克隆方法構建到雙元表達載體PDr上，然後通過農桿菌侵染法轉化擬南芥，獲得了過量表達八 11、4 12、4 13、4 14和/或4 15基因的轉基因植物(圖12)。結果表明，轉基因的植物具有不同的細胞分裂素抗性。在正常條件下生長的轉基因植物與野生型沒有顯著差異，但是在細胞分裂素的處理下，五個基因的表型具有較大的分化，支持了五個基因的功能的分化。APTl對細胞分裂素的毒性最為敏感，APT3和APT4明顯的超敏感反應但較弱，APT2，APT5的轉基因植物與野生型沒有明顯差異(圖12)。實施例3敲除APRT家族基因增強植物細胞分裂素抗性或減少毒副作用方面的應用用乙烯不敏感的擬南芥突變體ein2-9 tt4做背景進行EMS誘變和篩選，用高濃度(300 μ M)的激動素處理下是不敏感的。這一濃度下，野生型的根發育和子葉變綠過程受到強烈抑制。發現一株突變體C9，在這種處理條件下能正常生長(圖3)。通過圖位克隆的方法找到了對應的突變位點，發現C9的突變位點位於一個腺嘌呤核糖磷酸轉移酶 APTl(Atlg27450)內。發現aptl的另外三個等位突變體(aptl-1、aptl_2、aptl-3)，也對高濃度細胞分裂素不敏感，子葉可以變綠，根可以伸長生長(圖4)。如圖6所示，暗中生長的aptl突變體對高於30 μ M的玉米素不再敏感，對於不同的細胞分裂素分子，包括玉米素、異戊烯基腺嘌呤、，6-苄基腺嘌呤和激動素，aptl突變體都表現出不敏感的表型(圖7)。由於細胞分裂素本身並沒有代謝毒性，只是作為一種信號分子激活信號轉導通路。在APRT酶存在的情況下，外源施加大量的細胞分裂素可以被轉化成過量的細胞分裂素核苷酸，細胞分裂素核苷酸具有與細胞內的重要分子AMP類似的結構，從而競爭體內AMP代謝所需的酶體系，從而影響能量代謝和核酸代謝，引起毒性。敲除APRT家族基因可導致外源施加的鹼基形式的細胞分裂素不能被催化成核苷酸形式的細胞分裂素，從而避免了細胞分裂素核苷酸造成的代謝毒性。
由此本發明中以APRT基因敲除突變體為材料，得到了對細胞分裂素毒性耐受型的植株。所得抗性植株對不同形式的細胞分裂素(包括玉米素、異戊烯基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤和激動素)都有耐受性。在細胞分裂素濃度高於100 μ M時有明顯毒性，而耐受性植株具有顯著的抗性。 實施例4擬南芥基因ΑΡΤ1、其同源基因ΑΡΤ2、ΑΡΤ3、ΑΡΤ4和/或ΑΡΤ5作為抗性篩選標記方面的應用構建過表達擬南芥基因ΑΡΤ1、其同源基因ΑΡΤ2、ΑΡΤ3、ΑΡΤ4和/或ΑΡΤ5的轉基因植物，其是通過PCR方法擴增體內的五個基因CDS，並通過分子克隆方法構建到雙元載體 PDr上，以CaMV35S作為強啟動子。通過農桿菌侵染的方法，將不同的質粒轉化植物，從而得到基因過表達的株系。在植物體內過量表達擬南芥APRT基因家族五個基因APT1、APT2、APT3、APT4、APT5 以及酵母中ScAPRT基因導致擬南芥對高濃度細胞分裂素有不同程度的超敏感反應。過量表達APTl導致植物對高濃度的細胞分裂素超敏感，在較低濃度激動素處理 (IOOuM)時種子萌發就被強烈抑制，而且這種抑制是不可逆的。這一結果說明細胞分裂素的毒性由於體內APTl酶的表達量增高而增加，這種毒性作用導致了細胞無法正常分裂和分化而死亡。這些結果說明擬南芥中APTl是細胞分裂素產生毒性作用的充分必要條件(圖 5)。過量表達APTl超敏感作用最強，APT3、APT4和ScAPRT作用次之，APT2和APT5基本沒有超敏感反應。這也與不同酶對細胞分裂素的催化能力對應。ScAPRT的轉基因表達的結果支持了體外酶活測定的結果(圖12)。過量表達APRT基因本身對植物無毒性，而且有利於腺嘌呤的補救合成代謝，利於能量代謝和遺傳物質的合成代謝。但在高於IOOuM的高濃度細胞分裂素及其腺嘌呤類似物處理條件下過量表達APTl即造成代謝毒性，符合作為篩選標記基因的特點，並且可以進行負篩選。在擬南芥APRT家族五個基因中，APTl由於功能最強，最適合作為篩選標記，其次為APT3，APT4以及酵母ScAPRT基因，而APT2和APT5幾乎檢測不到活性而無法進行此類應用。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
權利要求
1.APRT家族基因在植物細胞分裂素毒性、細胞分裂素代謝調控或作為抗性篩選標記方面的應用，其特徵在於，所述APRT家族基因包括擬南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、 APT4 和 / 或 APT5。
2.擬南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或APT5在製備細胞分裂素毒性敏感型或不敏感型轉基因植物方面的應用。
3.擬南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或APT5在培育腺嘌呤和/或細胞分裂素調控轉基因植物方面的應用，其特徵在於，將ΑΡΤΙ、APT2、APT3、APT4和/或APT5 基因全長克隆到不同種類的表達載體上，然後用這些表達載體轉化植物，獲得細胞分裂素代謝和/或腺嘌呤代謝調控相關的轉基因植物。
4.一種通過敲除APRT家族基因增強植物細胞分裂素抗性或減少毒副作用方面的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述細胞分裂素為玉米素、異戊烯基腺嘌呤、6-苄基腺嘌呤或激動素。
全文摘要
本發明提供APRT家族基因在植物細胞分裂素毒性、細胞分裂素代謝調控或作為抗性篩選標記方面的應用，所述APRT家族基因包括擬南芥基因APT1、其同源基因APT2、APT3、APT4和/或APT5。敲除APT1基因可以避免細胞分裂素的毒副作用，APRT類基因功能喪失的植物可以作為細胞分裂素毒性耐受品系用於農業育種。APRT家族基因可以被用來調控細胞分裂素的代謝，從而調節植物的生長發育過程，例如細胞分裂和分化，組織脫分化和再分化，根冠比例，葉片衰老等。此外，APRT家族基因可以作為抗性篩選標記基因。高濃度細胞分裂素處理條件下過量表達APT1蛋白即造成代謝毒性，但APT1蛋白本身對植物無毒性，符合作為篩選標記基因的特點，並且可以進行負篩選。
文檔編號A01H5/00GK102220349SQ20111011051
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月29日 優先權日2011年4月29日
發明者張新巖, 郭紅衛 申請人:北京大學