使用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的肝癌細胞的檢測法的製作方法

2023-08-03 12:05:11

專利名稱：使用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的肝癌細胞的檢測法的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測受試者體內肝癌細胞的存在的體外免疫測定方法。
技術背景
由於磷脂醯肌醇蛋白聚糖3在肝癌中頻繁地高度表達，所以認為肝癌中的磷脂 醯肌醇蛋白聚糖3的表達概況分析可能對磷脂醯肌醇蛋白聚糖3在肝癌中的功能鑑定、肝 癌的治療或診斷及肝癌預後預測有用。通常進行蛋白質表達分析時，在病理診斷中廣泛 採用免疫組織化學，特別是酶抗體法。免疫組織化學是使用抗體或酶等生物學試劑以高 靈敏度且特異性地檢測生物體內物質(抗原)的存在和分布的方法。作為免疫組織化學 的特徵，可以舉出以下特徵1、操作簡便；2、可以廣泛應用於將所得生物化學信息用 於形態學信息等；3、提供生物學和病理學方面的重要信息；4、需要注意因使用生物學 試劑所以與通常的方法不同。另外，免疫組織化學染色還具有下述優點，即，能夠使用 新鮮冷凍切片、細胞學樣本或固定組織的石蠟切片等廣泛的樣本，將其用於目標病理診 斷或形態學觀察。
在免疫組織化學法中，由於基於酶抗體法的免疫染色可以採用通常病理診斷中 使用的福馬林固定石蠟包埋組織，所以其應用範圍非常廣泛。但是，如果不充分注意 由於是福馬林固定組織而引起的人為產物(Artifacts)等，那麼不僅染色會失敗，有時還 會引起因福馬林固定及包埋導致的抗原變化、及抗體的滲透和反應性的變化，結果產 生假陽性或假陰性。上述假陽性或假陰性有時會導致對染色結果的曲解。
通常的組織學檢索中使用的福馬林固定對形態保持有用，但從保持與抗體的 結合性的觀點考慮，福馬林不是理想的固定液。因此，除福馬林之外有時還使用乙 醇等作為固定液，但尚未確立形態保持優異、能夠保存所有抗原與抗體的結合性的固定 法。因此，雖然福馬林固定在保持與抗體的結合性方面存在問題，但仍然是廣泛使用 的實際固定法。
因此，為了減弱福馬林固定對保持與抗體的結合性的影響，已經公開了幾種 方法。第一種方法是選擇識別下述表位的抗體用於免疫染色，所述表位不受福馬林固 定影響。在識別同一抗原的抗體中，通過將識別抗原中的不易受福馬林固定影響的表 位的抗體用於免疫染色，可以減少假陰性。但是磷脂醯肌醇蛋白聚糖3在細胞表面表達 後，經過蛋白酶等翻譯後修飾，因此限定了能夠與抗體結合的表位，從而不存在用於選 擇合適的表位的表位多樣性。
第二種方法是通過提高免疫染色的靈敏度檢測出用通常的方法無法進行可視化 的抗原。最簡便的方法是在顯色時向通常免疫染色中使用的DAB(3，3』 -二氨基聯苯 胺四鹽酸鹽)中加入銅等重金屬，但不能期待靈敏度顯著提高。還嘗試了下述方法，即 ABC (抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶複合體(avidin-biotinylatedperoxidase complex)) 法及LSAB (標記鏈黴抗生物素蛋白生物素化抗體(labeled streptavidin biotinylated antibody))法等，所述方法通過使生物素化的二次抗體和ABC或酶標記的抗生物素蛋白與切片反覆反應來提高靈敏度，但確認了存在隨著反應次數增加背景的非特異性染色也 增強的傾向。進而，已經開始採用下述方法，即使用酶標記葡聚糖聚合物的EPOS (增強 聚合物一步染色(enhanced polymerone-step staining))法、及組合了生物素化Tyramide與 ABC法的CSA(催化信號擴增(catalyzed signal amplification))法，可以顯著提高染色的靈敏度。但是，採用ABC法等現有方法檢測福馬林固定組織中的抗原時，將腫瘤組織判 斷為陽性，並且將正常或非腫瘤組織判斷為陰性，基於以上判斷可以識別腫瘤組織和非 腫瘤組織，但由於使用高靈敏度方法時也會檢測出非腫瘤組織內的微量抗原，所以有時 利用抗原也無法進行上述識別。另外，在使用高靈敏度方法的情況下，由於靈敏度高， 所以仍然存在背景染色增強的問題。
第三種方法是將因福馬林固定導致與抗體的反應性減弱的抗原的反應性活化 的方法。在20世紀70年代引入的利用了蛋白酶的消化切片的方法(蛋白酶誘導表位活 化法(protease_:induced epitoperetrieval method)，以下稱作 「PIER 法」或「蛋白酶抗原活 化法」)中，在免疫染色之前利用胰蛋白酶、胃蛋白酶等進行消化切片。該方法存在下 述問題因切片自身被消化導致的切片從玻璃上剝離、及染色結果不穩定等。
之後，在20世紀90年代開發了熱誘導抗原活化法(heat-inducedepitope retrieval method,以下稱作「HIER法」或「熱誘導抗原活化法」)。已知利用微波、煮沸或高 壓釜進行加熱時，通過高溫處理抗原會水解，結果表位能夠與抗體結合。目前為止，磷 脂醯肌醇蛋白聚糖3在肝癌中的表達也通過HIER法(非專利文獻1 5及專利文獻1)檢 測。但是，由於抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體對血管及肝竇的上皮細胞顯示出交叉反應 性，所以需要進行下述繁瑣的處理預先進行與來自正常肝細胞的蛋白質溶胞產物的封 閉反應，排除上述交叉結合(非專利文獻4)。因此，目前使用的HIER法無法以下述方 式準確地檢測出肝癌組織中磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的表達觀察到在原有細胞膜中表達 的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3細胞質性地表達(非專利文獻2)。要求開發出代替現有HIER 法的準確檢測該表達的方法。
[非專利文獻l]CapurroM，Wanless IR，Sherman Μ, Deboer G，Shi W, Miyoshi Ε, Filmus J.，(2003) Gastroenterology 125 (1), 89-97
[非專利文獻 2]Yamauchi N，Watanabe A, Hishinuma Μ, Ohashi K, Midorikawa Y, Morishita Y, Niki Τ, Shibahara J, Mori Μ, Makuuchi Μ, Hippo Y, Kodama Τ, Iwanari H, Aburatani H, Fukayama Μ.，(2005) Mod Pathol 18 (12)，1591—8
[非專利文獻3]LibbrechtL，Severi Τ, Cassiman D, Vander BorghtS，Pirenne J, Nevens F, Verslype C, van Pelt J, Roskams T.，(2006) Am J Surg Pathol 30 (11), 1405-11
[非專利文獻4]Grozdanov PN, Yovchev MI, Dabeva MD.，(2006) Lab Invest 86(12)， 1272-84
[非專利文獻5]Llovet，J.M., Chen, Y., Wurmbach, E.，Roayaie, S., Fiel, M.I., Schwartz, M., Thung, S.N.，Khitroy, G.，Zhang, W.，Villanueva, A., Battiston, C., Mazzaferro, V., Bruix, J.， Waxman, S., Friedman, S.L., (2006) Gastroenterology 131 (6)，1758-1767
[專利文獻1]W02003100429
[專利文獻2]W02006006693
[專利文獻3]W02004022739 發明內容
本發明是鑑於上述情況完成的，其目的在於提供能夠準確地檢測出肝癌組織中 磷脂醯肌醇蛋白聚糖3表達方式的方法。
本發明人等發現檢測肝癌組織中的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗原表達時，通過將 利用熱誘導抗原活化法的抗原活化處理和利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化處理組合， 能夠採用免疫組織化學染色法檢測出磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗原的表達量和表達方式的 差異，從而完成了本發明。由此，可以根據磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的表達量，對利用現 有HIER法確認到磷脂醯肌醇蛋白聚糖3高度表達的樣本進行等級分類。
BP,本申請發明提供以下發明
[1] 一種用於檢測受試者體內肝癌細胞的存在的體外免疫測定方法，包括下述步 驟
(a)提供來自同一受試者的至少兩種能夠視為相同的一組組織標本作為石蠟包埋 切片，所述組織標本在由上述受試者製備之後，被包埋在石蠟中並安裝在透明性支持體 上；
(b)對上述一組組織標本進行除石蠟處理；
(c)對進行了上述(b)處理的能夠視為相同的一組組織標本的一方，進行利用 熱誘導抗原活化法的抗原活化處理，對另一方進行利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化處 理；
(d)在適合於形成存在於經過上述(C)處理的組織標本中的磷脂醯肌醇蛋白聚糖 3和抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的複合體的條件下，使抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體與 上述標本接觸；
(e)檢測複合體的存在，此處，存在複合體時判定受試者體內存在肝癌細胞。
[2]如[1]所述的方法，其中，上述熱誘導抗原活化法利用微波加熱。
[3]如[1]所述的方法，其中，上述熱誘導抗原活化法利用高壓釜加熱。
[4]如[1]至[3]中任一項所述的方法，其中，上述蛋白酶抗原活化法中使用的蛋 白酶選自胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K。
[5]如[1]至[4]中任一項所述的方法，其中，用於檢測複合體的檢測反應為酶反應。
[6]如[1]至[5]中任一項所述的方法，其中，上述抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體 為與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽鍵合的抗體。
[7]如[6]所述的方法，其中，磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽為包含序列號 1表示的第359號胺基酸至第580號胺基酸的多肽，或者為包含第375號胺基酸至第580 號胺基酸的多肽。
[8]如[6]或[7]所述的方法，其中，上述抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體為GC33 抗體。
[9]如[1]至[5]中任一項所述的方法，其中，上述抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體 為1G12抗體。
[10]如[1]至[9]中任一項所述的方法，其中，步驟(e)中，將複合體的存在經過 數值化並檢測。
[11]如[10]所述的方法，其中，上述數值化按照下式算出
IRcp = PR+ (SI-Cp) +SP
式中，
IRcp為磷脂醯肌醇蛋白聚糖3表達量的評分；
PR為對顯微鏡下檢測出上述複合體的細胞比例進行評分得到的數值；
SI-Cp為對在顯微鏡下上述複合體在視野中細胞的細胞質中被檢測出的染色強度 進行評分得到的數值；
SP為對在顯微鏡下的視野中細胞的細胞膜中顯示出完全膜染色的細胞比例進行 評分得到的數值。
[12]如[10]所述的方法，其中，上述數值化按照下式算出
IRcm = PR+ (SI-Cm) +SP
式中，
IRcm為磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的膜局部化的評分；
PR為對在顯微鏡下檢測出上述複合體的細胞比例進行評分得到的數值；
SI-Cm為對在顯微鏡下檢測出上述複合體在視野中細胞的細胞膜中的染色強度 進行評分得到的數值；
SP為對在顯微鏡下的視野中細胞的細胞膜中顯示出完全膜染色的細胞比例進行 評分得到的數值。
[13] —種對肝癌細胞分類的方法，上述方法基於利用[11]及[12]所述的方法算出 的評分，對存在於受試者的肝癌細胞進行分類。
[14] 一種確定是否給與抗癌劑的方法，上述方法基於利用[11]及[12]所述的方法 算出的評分，確定是否給與受試者含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑。
[15]—種確定抗癌劑給與量的方法，上述方法基於利用[11]及[12]所述的方法算 出的評分，確定對受試者進行肝癌治療中含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑的給與量。


[圖1]為表示幻評分的各級的圖。
[圖2]為表示SP評分的各級的圖。
[圖3]為表示HuH-7及HepG2細胞移植模型標本的染色結果的圖。
[圖4]為表示由人肝癌的臨床樣本製備的標本的染色結果的圖。
[圖5A]為表示hGC33抗體在人肝癌移植小鼠模型中的抗腫瘤效果的圖。
[圖5B]為表示hGC33抗體在人肝癌移植小鼠模型中的抗腫瘤效果的圖。
[圖5C]為表示hGC33抗體在人肝癌移植小鼠模型中的抗腫瘤效果的圖。
[圖5D]為表示hGC33抗體在人肝癌移植小鼠模型中的抗腫瘤效果的圖。
本說明書包含記載在作為本申請優先權基礎的日本專利申請2008-068316號說 明書中的內容。
具體實施方式
組織標本
本說明書中使用的用語「組織標本」，是指由個體、體液(例如血液、血清、 血漿及脊髓液)、組織培養物或組織切片等得到的任意生物學標本。作為用作生物學標 本的例子，可以優選舉出受試者標本。優選的受試者標本是由受試者得到的組織，更 優選受試者的肝組織。作為採集肝組織的方法，優選採用作為公知方法的活組織檢查 (Biopsy)。肝活組織檢查是指將細長的針直接從皮膚表面刺入肝臟採集肝臟組織的方 法。通常針穿刺的部位是右胸下部的肋間。手術之前，使用超聲波檢查裝置確認穿刺部 位的安全性，並且對穿刺部位進行消毒。進而，以從皮膚至肝臟表面作為麻醉對象，將 穿刺部位的皮膚切開小口後，用穿刺針進行穿刺。
本發明中，由於組織標本是在顯微鏡下通過透射光進行觀察，所以將組織標本 切成薄片，並且切至顯微鏡中使用的光線充分地透過的程度。作為切成薄片之前的步 驟，將組織標本固定。即，通過使組織 細胞的蛋白質脫水或變性使組織標本凝固，迅 速殺滅構成組織的細胞，使其結構穩定及不能溶解。首先，將作為固定對象的組織標本 用手術刀等刀具切成適於製作石蠟包埋切片的大小及形狀的片斷。接著，將該片斷浸漬 在用於進行固定的試劑即固定液中。作為固定液，優選使用福馬林，更優選中性緩衝 福馬林。可以根據組織標本的特性或物性適當選擇中性緩衝福馬林的濃度。濃度可 以在1 50%、優選5 25%、更優選10 15%之間適當改變後進行使用。對浸漬了 組織標本的固定液使用真空泵適當脫氣。固定如下進行在常壓及室溫條件下將組織標 本放置在固定液中數小時。固定所需要的時間可以在1小時 7日、優選2小時 3日、 更優選3小時 M小時、進一步更優選4小時 16小時的範圍內適當選擇。固定之後 再將其適當浸漬在磷酸緩衝液等中數小時(時間可以在2小時 48小時、優選3小時 24小時、更優選4小時 16小時的範圍內適當選擇)。
接著，可以由適於固定的組織標本利用冷凍切片法或石蠟切片法較好地製作切 片。作為冷凍切片法的優選例，可以舉出下述方法向O.C.T.compound(Miles.Inc.)中加 入組織並冷凍，將所得產物使用恆冷切片機(冷凍切片製作裝置)切成薄片。在石蠟切 片法中，通過將被固定的組織標本浸漬在包埋劑中並凝固，賦予該切片均與且適度的硬 度。作為包埋劑，可以優選使用石蠟。使用乙醇對被固定的組織標本進行脫水。具體 而言，通過將組織標本依次浸漬在70%乙醇、80%乙醇及100%乙醇中，對該組織標本 進行脫水。浸漬所需要的時間及次數可以在1小時至數日及1次至3次的範圍內適當選 擇。另外，也可以在室溫或4°C下進行浸漬。在4°C下進行浸漬時，浸漬時間優選徹夜 等其時間較長的情況。然後，將其液相置換為二甲苯後，將組織標本用石蠟包埋。將其 液相置換為二甲苯所需要的時間可以在1小時 數小時的範圍內適當選擇。此時，可以 在室溫下進行置換，也可以在4°C下進行置換，但在4°C下進行置換時，置換時間優選徹 夜等其時間較長的情況。石蠟包埋所需要的時間及次數可以在1小時至數小時及1次至 4次的範圍內適當選擇。此時，可以在室溫下進行包埋，也可以在4°C下進行包埋。在 4°C下進行包埋時，包埋時間優選徹夜等其時間較長的情況。另外，石蠟包埋反應可以通 過使用經自動化處理的石蠟包埋裝置(EG1160，Leica等)較好地對組織標本進行包埋。
如上所述，通過將被石蠟包埋的組織標本與支架Scaffold)連接來製作「組織 塊」(block)，使用切片機將該組織塊切成從Iym至20μιη厚度中選擇的所期望厚度的薄 片。通過將切成薄片的組織切片靜置在作為透明性支持體的玻璃載片上對其進行固定。 在上述情況下，為了防止組織切片的剝離，還可以優選使用在玻璃載片上塗布0.01% 聚-L-賴氨酸(Sigma)並乾燥的玻璃載片。被固定的組織切片可以在從數分鐘至1小時 之間選擇的適當時間內風乾。
本發明中，準備一組如上所述地製備的、安裝於透明性支持體上的兩種組織標 本。該組織標本優選組織學上能夠視為相同的兩種組織標本。所謂「能夠視為相同」， 是指相比較的兩種組織標本由提供該組織標本的受試者標本中基本相同的細胞或組織構 成。例如，作為相鄰切片製備的兩種組織標本是能夠視為相同的兩種組織標本。本發明 中，只要沒有特別說明，「能夠視為相同的兩種組織標本」，是指作為相鄰的切片製備 的兩種組織標本，除此之外，即使不是作為相鄰切片製備的組織標本，只要構成兩種組 織標本的細胞或組織的構成在該兩種組織標本之間能夠視為相同，則也屬於「能夠視為 相同的兩種組織標本」。作為細胞或組織的構成在該兩種組織標本之間能夠視為相同的 情況，例如可以優選舉出下述情況(1)在位於組織切片中的平面坐標上同一位置處存 在來自同一細胞的細胞切片；(2)位於該平面坐標上的同一位置處該細胞切片存在的比 例至少為50%以上，優選為60%以上，更優選為70%以上，更進一步優選為80%以上， 較優選為90%以上，特別優選為95%以上。
抗原活化
本發明的方法中，對因福馬林固定而減弱了與抗體的反應性的抗原反應性進 行活化。本發明中，對兩種組織標本中的一種標本使用蛋白酶誘導抗原活化法(PIER 法)，對另一種標本使用熱誘導抗原活化法(HIER法)，將與抗體反應時的兩者間的染色 程度的差異進行數值化。
熱誘導抗原活化法適當採用利用微波的加熱法、利用高壓釜的加熱法，或利用 煮沸處理的加熱法等。使液體溫度保持為約98°C、在780W的輸出功率下進行煮沸處 理時，處理等活化所需要的時間從5分鐘-60分鐘之間適當選擇，例如為10分鐘。抗 原活化處理可以在除IOmM檸檬酸鈉緩衝液之外的市售靶向活化溶液(TargetRetrieval Solution) (DakoCytomation)等中進行。在下述實施例中，使用靶向活化溶液。作為活化 處理的結果，只要可以獲得抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體識別的抗原中的表位與抗體的 結合性，檢測出下述抗原與抗體的複合體即可，可以使用任一種緩衝液、水溶液。
對蛋白酶誘導抗原活化法中使用的蛋白酶的種類及來源沒有特別限定，可以適 當選擇使用通常能夠購買到的蛋白酶。作為使用的蛋白酶的例子，可以優選舉出0.01N鹽 酸中濃度為0.05%的胃蛋白酶；進一步在pH 7.6的Tris緩衝液中含有濃度為0.1%的CaCl2 的濃度為0.1 %胰蛋白酶；含有IOmM EDTA及0.5% SDS的pH 7.8的IOmM Tris-HCl緩 衝液中濃度為1 50 μ g/ml的蛋白酶K。進而，使用蛋白酶K時，該反應液的pH在6.5 至9.5之間適當選擇，還可以適當使用SH試劑、胰蛋白酶抑制劑或糜蛋白酶抑制劑。本 說明書實施例中記載的Histofine Her2 kit (MONO) (Nichirei Bioscience)附帶的蛋白酶也可 以作為上述優選的蛋白酶的具體例。蛋白酶誘導抗原活化通常在37°C下進行，但反應溫 度可以在25°C至50°C的範圍內適當改變。蛋白酶誘導抗原活化在37°C下進行時，反應時9間例如在1分鐘至5小時之間適當選擇，例如為15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2 小時、3小時或4小時等。活化處理結束後，將進行了該處理的組織標本用清洗用緩衝液 清洗。清洗用緩衝液優選使用PBS (phosphate-buffered saKne)，除此之外，還可以優選使 用Tris鹽酸緩衝液。作為清洗條件，通常採用在室溫下清洗5分鐘且重複3次的方法， 但可以適當改變清洗時間及溫度。
抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體
本發明中使用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體只要具有與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 結合的活性即可，也可以優選使用任一種抗體。抗體的特別優選例包括下述實施例中公 開的GC33抗體(專利文獻2)及1G12抗體(專利文獻1)。另外，除上述公知的抗體之 外，也可以通過使用磷脂醯肌醇蛋白聚糖3作為免疫抗原對非人的動物進行免疫，由此 獲得本發明中優選使用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體。專利文獻1、專利文獻2記載了 上述抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的製作方法，對本領域技術人員來說基於該方法可以 適當獲得所期望的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體。
抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體對磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的結合可以優選採用本領 域技術人員公知的方法檢測。例如可以採用ELISA(酶聯免疫吸附測定方法)、EIA(酶 免疫測定方法)、RIA(放射免疫測定方法)或螢光免疫測定方法等。一般的教科書如"Antibody A Laboratory Manual.Ed Harlow, David Lane, Cold SpringHarbor Laboratory,1988」中記載了上述方法。
作為測定抗體對表達抗原的細胞的結合活性的方法，例如可以舉出Antibody A Laboratory Manual. (Ed Harlow, David Lane, ColdSpring Harbor Laboratory, 1988 中 的359-420頁中記載的方法。即，結合活性可以優選根據以細胞作為抗原的ELISA或 FACS (螢光激活細胞分選術(fluorescence activated cell sorting))的原理進行評價。在 ELISA format中，通過比較由酶反應產生的信號水平，定量評價抗體對細胞的結合活 性。即，將受試抗體加到固定有強制表達了抗原的細胞的ELISA板上，利用識別受試抗 體的酶標記抗體，檢測與細胞結合的抗體。或者在FACS中，製備受試抗體的稀釋系列， 確定對強制表達抗原的細胞的抗體集合效價(titer)，由此可以比較其對細胞的結合活性。
可以通過FACS format測定在細胞表面上表達的抗原與對應於該抗原的抗體之 間的結合，所述細胞不與ELISA板等載體結合併懸浮於緩衝液等中。作為用於上述測 定的流式細胞儀，例如可以舉出FACSCantoTMII、FACSAria 、FACSArray > FACS Vantage SE、FACSCalibur (以上 BD Biosciences)禾Π EPICS AL TRA HyPerSort、 Cytomics FC 500、EPICS XL-MCL ADC、EPICS XL ADC、Cell LabQuanta/Cell Lab Quanta SC (以上 Beckman Coulter)等。
作為測定抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體對抗原的結合活性的優選方法之一例， 可以舉出使用二次抗體的方法，所述二次抗體識別與表達抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體 的細胞反應的受試抗體。使表達磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的細胞與受試抗體反應，用經 FITC標記的二次抗體對細胞進行染色後，採用FACSCalibur(BD)進行測定，利用CELL QUEST軟體(BD)解析其螢光強度。根據本方法，採用FACSCalibur進行測定時，利用 CELL QUEST軟體解析其螢光強度，將根據上述方法得到的幾何平均值(受試Ge0-Mean 值)與利用對照抗體作為一次抗體時的對照Ge0-Mean值進行比較，由此可以判斷抗體對抗原的結合活性。求出Ge0-Mean(幾何平均值)的計算式記載在CELL QUEST軟體用 戶指南(BD biosciences公司)中。
會·示站貓睡朋廁戰·3秘白版@
對於經過利用熱誘導抗原活化法的抗原活化處理的組織標本及經過利用蛋白酶 誘導抗原活化法的抗原活化處理的組織標本，以抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體作為一次 抗體進行反應。在下述條件下進行該反應，所述條件適合於抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗 體識別抗原中的表位，並形成抗原抗體複合體。通常該反應在4°C下進行一夜，或者在 37°C下進行1小時，但反應條件可以在適合抗體識別抗原中的表位並形成抗原抗體複合 體的範圍內改變。例如，反應溫度可以在4°C至50°C的範圍內改變，反應時間可以在1 分鐘至7日之間改變。在低溫下進行反應時，優選反應較長時間。一次抗體反應結束 後，將組織標本用清洗用緩衝液清洗。清洗用緩衝液優選使用PBS(phosphate-buffered saline),除此之外，還可以優選使用Tris鹽酸緩衝液。通常作為清洗條件，可以採用在 室溫下清洗5分鐘並重複3次的方法，但可以適當改變清洗時間及溫度。
接著，使經過一次抗體反應的組織標本與識別一次抗體的二次抗體反應。通 常使用預先利用用於將二次抗體可見化的標記物質標記的二次抗體。作為標記物質， 優選舉出 FITC (異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate))、Cy2 (Amersham)及 Akxa488(MolecularProbes)等螢光色素，過氧化物酶及鹼性磷酸酶等酶，或膠體金等。
在下述條件下進行與二次抗體的反應，所述條件適合於使抗磷脂醯肌醇蛋白聚 糖3抗體與識別該抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的二次抗體形成抗原抗體複合體。通常 該反應在室溫或37°C下進行30分鐘至1小時，但可以在適合於使抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖 3抗體與二次抗體形成抗原抗體複合體的範圍內進行改變。例如，反應溫度可以在4°C至 50°C的範圍內進行改變，反應時間可以在1分鐘至7日的範圍內進行改變。在低溫下進行 反應時，優選反應較長時間。二次抗體反應結束後，將組織標本用清洗用緩衝液清洗。 清洗用緩衝液優選使用PBS (phosphate-buffered saline)，除此之外，還可以優選使用Tris 鹽酸緩衝液。通常作為清洗條件，採用在室溫下清洗5分鐘且重複3次的方法，但可以 適當改變清洗時間及溫度。
然後，使經過二次抗體反應的組織標本與將標記物質可見化的物質反應。使 用過氧化物酶作為二次抗體的標記物質時，用反應液培養組織標本，所述反應液如下得 到在即將培養前將0.02%過氧化氫水與用pH 7.2的0.1M Tris鹽酸緩衝液調節至濃度為 0.1 %的DAB ( 二氨基聯苯胺(diaminobenzidine))溶液等量混合。除DAB之外，還可以 適當選擇DAB-Ni及AEC+(以上DAKO)等顯色基質。在培養過程中，在時間間隔顯微 鏡下觀察顯色程度，在確認到適當顯色的階段，通過將組織標本浸漬在PBS中來終止可 見化反應。
使用鹼性磷酸酶作為二次抗體的標記物質時，用BCIP (5-溴-4-氯_3_吲哚基磷 酸酯)/NBT (氮蘭四唑(nitro bluetetrazolium)) (Zymed)基質溶液(在含有濃度為IOmM的 MgC12及濃度為^mM的NaCl的pH 9.8的50mM碳酸鈉緩衝液中，溶解有濃度為0.4mM 的NBT及濃度為0.38mM下的BCIP)對組織標本進行培養。另外，除BCIP及NBT之 夕卜，還可以適當使用PermanentRed，Rist Red、或Richsin+(以上DAKO)等。在培養之 前，組織標本也可以用0.1M Tris鹽酸緩衝液(pH 9.5)在室溫下培養1分鐘至數小時，所述Tris鹽酸緩衝液含有濃度為ImM的鰲合鹼性磷酸酶抑制劑即鹽酸左旋咪唑(Nacalai)、 0.1M氯化鈉及50mM氯化鎂。在培養過程中，在時間間隔顯微鏡下觀察，在觀察到作為 反應最終產物的紫色的甲暨沉澱的階段，將組織標本用水洗或用含有2%聚乙烯醇的TBS 終止反應後，用TBST (含有0.1% Tween 20的TBS)清洗。使用膠體金作為二次抗體的 標記時，通過利用銀增感(silverenhancement)在金粒上附著金屬銀，由此使膠體金可見 化。銀增感的方法是本領域公知的。
使用FITC (異硫氰酸螢光素)、Cy2 (Amersham)及 Alexa488 (Molecular Probes)等螢光色素作為二次抗體的標記物質時，無需可見化物質的反應步驟，照射該螢光物質 的激發波長的光，放出的光可以通過使用螢光顯微鏡適當檢測。
肝癌組織的分類和治療效果的預測
已知磷脂醯肌醇蛋白聚糖3在肝癌組織中經過消化其N末端部分在血清中游離 (專利文獻幻。因此，本發明的方法中，使用與上述經過消化在血清中游離的磷脂醯肌 醇蛋白聚糖3的N末端的部分肽進行鍵合的抗體時，經過消化後，該抗體無法與仍錨定 在細胞表面上的C末端部分的多肽進行鍵合。另一方面，本發明的方法中，使用與C末 端部分的肽進行鍵合的抗體時，經過消化後，該抗體可以與仍錨定在細胞表面上的C末 端部分的多肽進行鍵合。即，根據目的適當選擇本發明中使用的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖 3抗體，由此無論消化與否都可以檢測出錨定在細胞表面上的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的部 分多肽，還可以檢測出直至消化錨定在細胞表面上的經過消化後血清中游離的磷脂醯肌 醇蛋白聚糖3的部分多肽。
已經發現抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體對肝癌的治療及預防有用(專利文獻3)。 上述治療用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體所發揮的殺滅細胞的活性主要通過抗體依賴性 細胞毒活性(ADCC活性)或補體依賴性細胞毒活性(CDC活性)發揮，所述細胞毒活性 通過效應細胞或補體與Fc部分結合而開始，所述Fc部分是與在錨定在細胞表面上的C末 端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的部分。因此，從抗磷脂醯肌醇蛋白 聚糖3抗體結合的表位是否存在於肝癌組織中的觀點考慮，預測利用治療用抗磷脂醯肌 醇蛋白聚糖3抗體的肝癌的治療效果時，在本發明的方法中，可以優選使用與C末端的部 分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體。
有文獻暗示磷脂醯肌醇蛋白聚糖3在肝癌組織中經過消化的部位為序列號1表示 的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的第358號和第359號胺基酸、或第374號和第375號胺基酸的 多肽鍵(專利文獻3)。因此，作為本發明中優選使用的與C末端的部分多肽鍵合的抗磷 脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，可以舉出與下述多肽鍵合的抗體，所述多肽為包含序列號1表 示的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的第359號至第580號胺基酸的多肽，或者為包含第375 號至第580號胺基酸的多肽。
另一方面，從磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子成熟的觀點考慮，預測利用治療用抗 磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的治療效果時，本發明的方法中能夠使用與N末端的部分多 肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體。上述情況下，將被與N末端的部分多肽鍵合的 抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體識別的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子作為沒有更成熟的治療 靶分子，將表達上述磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌細胞作為沒有更成熟的治療靶細 胞，可以分別對其賦予性格。與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽鍵合的12抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體無論是否成熟，檢測出磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子。另一 方面，與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖 3抗體檢測出成熟之前的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子，但沒有檢測出成熟之後的磷脂醯肌 醇蛋白聚糖3分子。S卩，通過使用與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽鍵 合的抗體、和與N末端的部分多肽鍵合的抗體這2種抗體，可以通過成熟的程度對利用本 發明的方法檢測出的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子及表達磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌 細胞進行分類。
以下具體說明上述分類方法。作為一次抗體，準備2種抗體與磷脂醯肌醇蛋 白聚糖3分子的C末端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，和與磷脂醯肌醇 蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體。由同一受試 者製備2種組織標本，使其中的1種組織標本與作為一次抗體的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 抗體反應，所述抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體鍵合於磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的N末端 的部分多肽；使另一種組織標本與作為一次抗體的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體反應， 所述抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體鍵合於磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多 肽。使用與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚 糖3抗體檢測的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子，從其成熟程度的觀點考慮，可以評價為沒有 更成熟的分子，表達上述磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的肝癌細胞可以評價為沒有更成熟 的細胞。另外，使用與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯 肌醇蛋白聚糖3抗體沒有檢測出、但是使用與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分 多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體檢測出的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子，從其成熟 程度的觀點考慮，可以評價為更成熟的分子，表達上述磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的肝 癌細胞，可以評價為更成熟的細胞。
與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖 3抗體和與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖 3抗體屬於互不相同的抗體亞型時，或者是在不同種類的動物中產生時，可以使用1種組 織標本進行測定。在上述情況下，通過將二次抗體用不同種類的酶或螢光標記，可以在 1種組織標本上使用2種抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體進行檢測，所述二次抗體為識別與 磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的N末端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的二 次抗體、和識別與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3分子的C末端的部分多肽鍵合的抗磷脂醯肌醇蛋 白聚糖3抗體的二次抗體。
ij抗磷H旨酉y幾醇3抗體的反應+牛的數倌化
本發明基於抗原活化反應(即，熱誘導抗原活化法及蛋白酶誘導抗原活化法)的 差異，提供下述方法將在顯微鏡下檢測出的由磷脂醯肌醇蛋白聚糖3和抗磷脂醯肌醇 蛋白聚糖3抗體形成的抗原抗體複合體的程度及形態的差異進行數值化。
在方案之一中，數值化如下進行
式(1)
IRcp = PR+ (SI-Cp) +SP
[式中，
IRcp為磷脂醯肌醇蛋白聚糖3表達量的評分；
PR為對顯微鏡下的檢測出上述複合體的細胞比例進行評分得到的數值；
SI-Cp為對在顯微鏡下上述複合體在視野中細胞的細胞質中被檢測出的染色強度 進行評分得到的數值；
SP為對在顯微鏡下視野中的細胞的細胞膜中顯示出完全膜染色的細胞比例進行 評分得到的數值]。
PR評分如下算出
(a)在使用4倍或10倍物鏡的顯微鏡下的視野中的細胞中，
⑴將檢測出上述複合體的細胞比例為0的樣本的評分作為0分，
( )將該比例小於20%的樣本的評價作為1分，
(iii)將該比例為20%以上且小於50%的樣本的評分作為2分，
(iv)將該比例為50%以上的樣本的評分作為3分；
SI-Cp評分如下算出
(b)在顯微鏡下視野中細胞的細胞質中，
⑴上述顯微鏡使用4倍或10倍的物鏡時，將檢測出上述複合體的細胞比例為0 的樣本的評分作為0分，
(ii)上述顯微鏡使用10倍的物鏡時，將雖然模糊但觀察到輕微的陽性反應的樣 本的評分作為1分，
(iii)將用4倍物鏡觀察到輕微的陽性反應的樣本的評分作為2分，
(iv)將即使用4倍物鏡也可以確認到能夠充分地識別的陽性反應的樣本的評分作 為3分，
(ν)將用4倍物鏡可以清楚地識別、確認到強陽性反應的樣本的評分作為4分；
SP評分如下算出
(c)在顯微鏡下視野中細胞的細胞膜中的上述複合體的檢測中，
(i)將未確認到細胞膜中的陽性反應的樣本的評分作為0分，
( )將確認有陽性反應的細胞中少於20%的細胞顯示出完全膜染色的樣本的評 分作為1分，
(iii)將確認有陽性反應的細胞中的20%以上且少於50%的細胞顯示出完全膜染 色的樣本的評分作為2分，
(iv)將確認有陽性反應的細胞中的50%以上的細胞顯示出完全膜染色的樣本的 評分作為3分。
另一個方案中，數值化根據下式( 進行，
式(2)
IRcm = PR+ (SI-Cm) +SP
[式中，
IRcm為磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的膜局部化的評分；
PR為對顯微鏡下檢測出上述複合體的細胞比例進行評分得到的數值；
SI-Cm為對在顯微鏡下檢測出上述複合體在視野中細胞的細胞膜中的染色強度 進行評分得到的數值；
SP為在顯微鏡下視野中的細胞的細胞膜中顯示出完全膜染色的細胞比例進行評分得到的數值]。
PR評分如下算出
(a)在使用4倍或10倍物鏡的顯微鏡下的視野中的細胞中，
⑴將檢測出上述複合體的細胞比例為0的樣本的評分作為0分，
( )將該比例小於20%的樣本的評價作為1分，
(iii)將該比例為20%以上且小於50%的樣本的評分作為2分，
(iv)將該比例為50%以上的樣本的評分作為3分；
SI-Cm評分如下算出
(b)在顯微鏡下視野中細胞的細胞膜中，
⑴上述顯微鏡使用4倍或10倍的物鏡時，將檢測出上述複合體的細胞比例為0 的樣本的評分作為0分，
( )上述顯微鏡使用10倍的物鏡時，將雖然模糊但觀察到輕微的陽性反應的樣 本的評分作為1分，
(iii)將用4倍物鏡時雖然模糊但用10倍物鏡時確認到可以充分識別的陽性反應 的樣本的評分作為2分，
(iv)將即使用4倍物鏡也可以確認到能夠充分地識別的陽性反應的樣本的評分作 為3分，
(ν)將用4倍物鏡可以清楚地識別、確認到強陽性反應的樣本的評分作為4分；
SP評分如下進行
(c)在顯微鏡下視野中細胞的細胞膜中的上述複合體的檢測中，
(i)將未確認到細胞膜中的陽性反應的樣本的評分作為0分，
( )將確認到陽性反應的細胞中少於20%的細胞顯示出完全膜染色的樣本的評 分作為1分，
(iii)將確認到陽性反應的細胞中的20%以上且少於50%的細胞顯示出完全膜染 色的樣本的評分作為2分，
(iv)將確認到陽性反應的細胞中的50%以上的細胞顯示出完全膜染色的樣本的 評分作為3分。
在上述情況下，針對經過熱誘導抗原活化法的組織標本和經過蛋白酶抗原活化 法的組織標本，分別確定基於上述式(1)及( 算出的評分。基於式(1)算出的評分是 反映磷脂醯肌醇蛋白聚糖3表達量的評分，基於式( 算出的評分是反映磷脂醯肌醇蛋白 聚糖3在細胞膜中的表達局部化的評分。可以基於本發明的數值化方法，根據磷脂醯肌 醇蛋白聚糖3的表達量及表達方式，對存在於受試者的肝癌細胞進行分類。如下述實施 例所示，確認到使用從實際肝癌患者中採集的組織標本，可以有效地對其進行分類。進 而，確認到即使在移植了磷脂醯肌醇蛋白聚糖3表達量被確定的肝癌細胞株即HuH-7或 HepG2的肝癌動物模型中，也可以有效地進行該分類。
本發明中，對肝癌動物模型給與治療用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體，結果證 實了根據本發明的方法通過數值化進行分類的肝癌中磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的表達量及 表達方式的差異，與利用治療用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體治療肝癌的治療效果的差 異相關。即，表明基於根據本發明進行數值化得到的評分的差異，可以判斷治療用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的治療效果的差異。基於根據本發明的數值化的方法，可以預 測使用含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體作為有效成分的肝癌治療劑的肝癌治療效果。 另外，基於根據本發明的數值化的方法，能夠確定為了在使用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3 抗體的肝癌治療中獲得所期望的效果所需的治療用抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的必需給藥量。
實施例
以下，根據實施例更詳細地說明本發明，但本發明並不限定於這些實施例。
(實施例1)
側__嶋驢朋廁械-3 _鹿_，耐__膽汰_旨 醯肌醇蛋白聚糖3的人肝癌細胞株移棺到小鼠腹部皮下
(1)細胞株
作為肝癌細胞株，使用HuH-7 細胞(Health Science ResearchResources Bank)、 HepG2 細胞(ATCC)。HuH_7 在含有 10% FBS (BIONET)的 Dulbecco，s Modified Eagle' s 培養基6IGMA)中維持並傳代培養，HepG2在含有10% FBS> lmmol/L MEM丙酮酸 鈉(Invitrogen)、lmmol/L MEM 非必需胺基酸(Invitrogen)的 Minimum Essential Medium Eagle培養基6IGMA)中維持並傳代培養。
(2)GPC3表達量的測定
(2-1)測定方法
HuH-7細胞及HepG2細胞中GPC3的表達量使用小鼠抗人GPC3單克隆抗體(克 隆名GC33，記載在 W02006/006693 中)，利用 QIFI-Kit(DakoCytomation)進行測定。測定方法根據附帶的說明書所述的方法進行。
將使用的GC33抗體在室溫下溶解後，用PBS調節至lmg/ml。作為陰性對照， 使用將凍幹狀態的mIgG&(l安瓿份)溶解在500 μ 1 「日本藥典注射用水大塚蒸餾水」 中得到的抗體。將5Χ IO5的各細胞懸浮在添加有98 μ 1 0.5w/v% BSA(Sigma-Aldrich)的 CellWASH細胞清洗溶液(Becton · Dickinson)中(以下稱作FACS-PBS)中。將分別添 加有2ylGC33及SylmIgGh的該各懸浮液在4°C下靜置30分鐘。之後，在4°C下將添 加有Iml FACS-PBS的該各懸浮液在以5000rpm進行離心分離操作1分鐘，由此對細胞進 行分餾。將該細胞再次懸浮在98 μ 1的FACS-PBS中。
另外，也可以與上述操作平行地進行以下操作。在IOOylQIFIKIT附帶的標準 顆粒(calibration beads)及測試顆粒(setup beads)中添加 Iml 的 FACS-PBS，在 4°C下以 5000rpm進行離心分離操作1分鐘由此進行清洗。將該顆粒懸浮在98 μ 1的FACS-PBS 中。向上述細胞及顆粒中分別添加QIFIKIT附帶的FITC標記山羊抗小鼠抗體各2ul， 使該細胞及顆粒在4°C下反應45分鐘。接著，在4°C下，將添加有Iml的FACS-PBS的 上述反應液以5000rpm進行離心分離操作1分鐘。將沉澱的細胞及顆粒懸浮在Iml的 FACS-PBS中。使用全自動細胞分析裝置EPICS-XL (Beckman Coulter)，調節輸出功率， 使通過測定經標記的測試顆粒而產生的2個峰進入測定畫面內。使用全自動細胞分析 裝置EPICS-XL，測定用於GC33抗體反應的細胞樣本、用於mlgGh反應的細胞樣本、 及標準顆粒發出的各種螢光的平均螢光強度(Mean fluorescence Intensity) (MFI)值。基 於標準顆粒的5個MFI值和抗體結合能力(Antibody-bindingcapacity) (ABC)值，利用Microsoft Office Excel 2003 SP2 (MicrosoftCorporation)繪製最佳直線。將各細胞的 MFI 值代入該直線的標準曲線求出ABC值。從用於GC33抗體反應的樣本的ABC值中扣除用 於mlgGh反應的樣本的ABC值，將所得的值作為抗體結合部位的數量。
結果，HuH-7中磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的表達量為每個細胞1.25X IO5個分子。 HepG2中磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的表達量為每個細胞9.67X IO5個分子。
(3) 月幹翩胞廉_至帽腳打隨雜賺
使用含有等量(1)所述的其維持傳代培養用培養基和MATRIGEL Matrix(BD Biosciences)的溶液分別製備HuH_7及HepG2細胞，使每Iml溶液中有5 X IO7個細胞。在將各細胞移植到小鼠的前一天，預先對雄性、5周齡的SCID小鼠(日本CLEA)腹腔內 給與100 μ 1抗脫唾液酸GMl抗體(和光純藥；將1安瓿的內容物溶解在Iml蒸餾水中， 再用4ml生理鹽水稀釋)。該抗脫唾液酸GMl抗體(和光純藥)如下製備將1安瓿的 內容物溶解在Iml蒸餾水中，再用4ml生理鹽水稀釋。次日，向該小鼠的腹部皮下移植 100 μ 1該各細胞懸浮液(即，每一隻小鼠為5X IO6個細胞)。
(4)腫瘤組織切片的製作方法的研究
使用手術刀將從⑶中製作的HepG2移植模型中採集的均勻的移植組織片四等 分。將其中一個斷片在10%中性緩衝福馬林中固定M小時。然後，使用自動包埋裝 置ETP-150C (Sakura FinetekJapan)，對被固定的組織片進行石蠟包埋，在4°C下保存(A法)。
接著，使用含有4%低聚甲醛的PLP固定液(濃度為IOmM的NaI04、濃度為 75mM的賴氨酸、濃度為37.5mM的磷酸緩衝液、濃度為2%的低聚甲醛)，在4°C下將另 一個斷片固定6小時，之後，於4°C用PBS (磷酸緩衝生理鹽水，10mM、pH 7.4)清洗。 然後，在4°C下將該斷片用丙酮脫水一夜，及在室溫下用丙酮脫水2小時。進而，將該斷 片用苯甲酸甲酯清洗1小時及用二甲苯清洗1小時，與上述同樣地對其進行包埋，在4°C 下保存(B法)。
在即將用於免疫組織染色之前，將A法及B法中製作的石蠟包埋標本在恆冷切 片機上切成薄片，風乾後進行除石蠟處理，並進行染色。
接著，使用PLP固定液，在4°C下將另一個斷片浸漬6至8小時後，在4°C下依次 浸潤在具有梯度蔗糖濃度的PBS中(時間為在砂糖濃度為10%的PBS中4小時，在砂 糖濃度為15%的PBS中4小時，在20%砂糖中一夜)。然後，將該斷片包埋在Tissue-Tek OCTcompound (Sakura Finetechnical)中，在乾冰/丙酮浴中冷凍。將冷凍後的組織塊在 恆冷切片機上切成薄片，風乾後將薄切片在-80°C下保存(C法)。
於4°C，將另一個斷片包埋在Tissue-Tek OCT compound中，在乾冰/丙酮浴中 冷凍。將冷凍後的組織塊在恆冷切片機上切成多個薄片後，將該切片風乾，用下述不同 的方法將其固定。在4°C下，將其中一個切片在4%低聚甲醛中固定30分鐘(D法)。 在4°C下，將另一個切片在丙酮中固定10分鐘(E法)。進而，在室溫下，將另一個切片 在10%中性緩衝福馬林中固定30分鐘(F法)。用Tris緩衝生理鹽水(TBS，50mM、 pH 7.4),將利用D法、E法及F法固定的切片清洗5分鐘共3次後，風乾，在_80°C下保 存。
將如上所述製備的組織切片用於以下所示的免疫組織化學染色。作為一次抗體，GC33 抗體(IgG2a)及 1G12 抗體(BioMosaic，IgGl)分別以濃度為 2.5 μ g/ml 及 1.0 μ g/ml進行使用。染色時，染色所需的試劑使用LSAB_2kit(Dako Cytomation)中附帶的試劑。染色方法按照試劑盒附帶的說明書所述的方法進行。由於固定時間短，所以 不進行抗原活化。上述免疫組織化學染色過程中形成的抗原抗體複合體可以通過過氧化 物酶-二氨基聯苯胺(DAB)反應進行可見化。作為對照染色，使用蘇木精。需要說明 的是，作為一次抗體的對照抗體，在GC33的情況下使用小鼠IgG2，在1G12的情況下使 用[gGl。對每種方法用3個例子進行評價，結果示於表1。
[表1]
權利要求
1.一種用於檢測受試者體內肝癌細胞的存在的體外免疫測定方法，包括下述步驟(a)提供來自同一受試者的至少兩種能夠視為相同的一組組織標本作為石蠟包埋切 片，所述組織標本由所述受試者製備之後，被包埋在石蠟中並安裝在透明性支持體上；(b)對所述一組組織標本進行除石蠟處理；(c)對進行了所述(b)處理的能夠視為相同的一組組織標本中的一方，進行利用熱誘 導抗原活化法的抗原活化處理，對另一方進行利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化處理；(d)在適合於形成存在於經過所述(c)處理的組織標本中的磷脂醯肌醇蛋白聚糖3和 抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的複合體的條件下，使抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體與所述 標本接觸；(e)檢測複合體的存在，其中，當存在複合體時判定受試者體內存在肝癌細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述熱誘導抗原活化法利用微波加熱。
3.如權利要求1所述的方法，其中，所述熱誘導抗原活化法利用高壓釜加熱。
4.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中，所述蛋白酶抗原活化法中使用的蛋 白酶選自胃蛋白酶、胰蛋白酶及蛋白酶K。
5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中，用於檢測複合體的檢測反應為酶反應。
6.如權利要求1至5中任一項所述的方法，其中，所述抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體 為與磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽鍵合的抗體。
7.如權利要求6所述的方法，其中，磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的C末端多肽為包含序 列號1表示的第359號胺基酸至第580號胺基酸的多肽，或者為包含第375號胺基酸至第 580號胺基酸的多肽。
8.如權利要求6或7所述的方法，其中，所述抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體為GC33 抗體。
9.如權利要求1至5中任一項所述的方法，其中，所述抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體 為1G12抗體。
10.如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中，步驟(e)中，將複合體的存在進 行數值化並檢測。
11.如權利要求10所述的方法，其中，所述數值化按照下式算出IRcp = PR+ (SI-Cp) +SP式中，IRcp為磷脂醯肌醇蛋白聚糖3表達量的評分；PR為對顯微鏡下檢測出所述複合體的細胞比例進行評分得到的數值；SI-Cp為對在顯微鏡下所述複合體在視野中細胞的細胞質中被檢測出的染色強度進行 評分得到的數值；SP為對在顯微鏡下的視野中細胞的細胞膜中顯示出完全膜染色的細胞比例進行評分 得到的數值。
12.如權利要求10所述的方法，其中，所述數值化按照下式算出IRcm = PR+ (SI-Cm) +SP式中，IRcm為磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的膜局部化的評分；PR為對顯微鏡下檢測出所述複合體的細胞比例進行評分得到的數值；SI-Cm為對在顯微鏡下所述複合體在視野中細胞的細胞膜中被檢測出的染色強度進 行評分得到的數值；SP為對在顯微鏡下的視野中細胞的細胞膜中顯示出完全膜染色的細胞比例進行評分 得到的數值。
13.一種對肝癌細胞分類的方法，所述方法基於利用權利要求11及12所述的方法算 出的評分，對存在於受試者體內的肝癌細胞進行分類。
14.一種確定是否給與抗癌劑的方法，所述方法基於利用權利要求11及12所述的方 法算出的評分，確定是否給與受試者含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑。
15.一種確定抗癌劑給與量的方法，所述方法基於利用權利要求11及12所述的方法 算出的評分，確定對受試者進行肝癌治療中含有抗磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗體的抗癌劑 的給與量。
全文摘要
本發明涉及一種用於檢測受試者體內肝癌細胞的存在的體外免疫測定方法。在本發明的方法中，檢測肝癌組織中磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗原的表達時，通過將利用熱誘導抗原活化法的抗原活化處理與利用蛋白酶抗原活化法的抗原活化處理組合，能夠根據免疫組織化學染色法檢測出磷脂醯肌醇蛋白聚糖3抗原的表達量及表達方式的差異。由此，可以根據磷脂醯肌醇蛋白聚糖3的表達量，對利用現有HIER法確認到磷脂醯肌醇蛋白聚糖3高度表達的樣本進行等級分類。
文檔編號G01N33/574GK102027372SQ20098011681
公開日2011年4月20日 申請日期2009年3月16日 優先權日2008年3月17日
發明者加藤淳彥, 杉本正道, 片岡寬章, 鈴木雅實, 高居宏武 申請人:中外製藥株式會社, 國立大學法人宮崎大學