一種短肽、其異構體及其應用的製作方法
2023-08-04 06:40:16
專利名稱：一種短肽、其異構體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種短肽、其異構體及其應用。特別是涉及以該短肽、其異構體為活性成分的舒血管、降血壓、抗血栓、控制心率失常並有抗癌功效的藥物。
背景技術：
天冬氨酸-精氨酸-纈氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-組氨酸-脯氨酸 (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro)，簡寫為DRWIHP，它是一個內源性七肽也被稱為 angl-7，廣泛分布於體內各種組織及體液中。這個七肽主要由血管緊張素II經血管緊張素轉化酶2水解，或由血管緊張素原由其他途徑少量合成而釋放。在血液中的濃度一般為納摩爾級。angl-7的藥代動力學研究發現，angl-7靜脈注入體內後，很快就被降解，半衰期僅為8 12秒。angl-7在人體內通過四種機制從血漿中清除①血管緊張素轉換酶(ACE)介導的水解作用；②中性內肽酶(NEP)介導的水解作用③亮氨酸內肽酶(LAP)介導的水解作用④腎小球濾過作用。其中酶解介導的水解作用是angl-7代謝的主要途徑。angl-7是腎素-血管緊張素調控系統內的一個重要組成部分。血管緊張素轉化酶 2在把血管緊張素II水解為angl-7降低了血管緊張素II在血液中的含量。同時angl-7 的特異性受體Mas受體因結合angl-7活化後可直接降低ATl對血管緊張素II的結合活性，angl-7長期刺激可降低ATl受體的表達。因此在體內血管緊張素轉化酶2水解血管緊張素II產生angl-7的途徑是體內腎素血管緊張素系統中平衡調節血管緊張素II生理功能的主要內源平衡抑制劑。在多種心腦血管系統疾病中內源產生的血管緊張素II是重要的致病因子，因此除了現在市面上大量使用ACE酶抑制劑(抑制ANGII的生成 ) 和其受體阻斷劑(主要阻斷ATl受體作用 )外，ANG1-7作為ANGII的內源平衡抑制劑也納入了人們的視線範圍。angl-7作為一種主要為平衡血管緊張素II功能的多功能性生理調控因子，具有多種生物學活性。早期報導，angl-7可以促進內皮細胞生成NO並舒張血管的功效。隨後發現angl-7在細胞上擁有獨立於AT1受體和AT2受體以外的血管緊張素受體Mas受體， 並通過該受體發揮多種調節拮抗血管緊張素II功能的生物學活性，包括抗血管增生、抗血栓、抗心肌肥、抗心律失常等一系列有益的生物學活性。此外angl-7還被發現具有獨特的抑制和VEGF於PIGF表達相關的異體移植瘤功效。雖然angl-7具有非常顯著的抗心腦血管疾病的特點，但由於其進入人體後，在體內多種酶的作用下迅速降解，使其濃度大大下降，極大地限制了其生物活性的發揮。
發明內容
本發明為一種短肽及其異構體，它的結構式(以下簡稱發明短肽1)為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-NH2其中Ac-代表氮末端乙醯化，-NH2代表碳末端醯胺化。其異構體的(以下簡稱發明短肽2)結構式為
Ac-Asp-Arg-Val-Tyr(D)-Ile-His(D)-Pro其中「D」表示此胺基酸殘基為D構型。該短肽及其異構體的獲得，採用現有技術中的公知方法進行，可以用常規的化學合成方法，或生物合成方法獲得。該短肽及其異構體分別與ACE酶、NEP酶、LAP酶作用，HPLC檢測分析，確定其都能抵抗這三種酶降解。分別以該短肽及其異構體為活性成份的抗高血壓藥物、抗血栓藥物和抗癌藥物，具有與天然angl-7基本相同甚至優於天然angl-7的特性，而且在體內抵抗上述三種降解酶降解，含酶條件下其半衰期延長超過原型100倍以上，使其更能夠持續有效的發揮功能。該短肽及其異構體可製備如舒血管降血壓藥物，它的活性成份是治療有效量的本發明短肽或其異構體；抗血管增生藥物，它的活性成份是治療有效量的本發明短肽或其異構體；抗心律失常藥物，它的活性成份是治療有效量的本發明短肽或其異構體；抗癌藥物， 它的活性成份是治療有效量的本發明短肽或其異構體。需要的時候，在上述藥物中還可以含有一種或多種藥學上可以接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。本發明的藥物可以製成片劑、粉劑、粒劑、膠囊、及凍乾粉注射液等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法製備。上述藥物的用量一般為每天100 μ g/kg體重。
圖1所示為本發明短肽對比血管緊張素1-7的耐酶解效果HPLC圖譜；A圖血管緊張素1-7標準品；
B圖發明短肽1標準品；
C圖發明短肽2標準品；
D圖血管緊張素1-7被ACE酶水解結果
E圖發明短肽1被ACE酶水解結果；
F圖發明短肽2被ACE酶水解結果；
G圖血管緊張素1-7被LAP酶水解結果
H圖發明短肽1被LAP酶水解結果；
I圖發明短肽2被LAP酶水解結果；
J圖血管緊張素1-7被NEP酶水解結果
K圖本發明短肽1被NEP酶水解結果；
L圖發明短肽2被NEP酶水解結果。圖2所示為本發明短肽1刺激HUVEC釋放NO的含量測定對比。圖3所示為血管緊張素1-7、本發明短肽1、本發明短肽2抑制HUVEC細胞形成小管對比圖；A圖為小管數目統計圖；B圖無藥物刺激情況下HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管；
C圖血管緊張素1-7抑制HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管；D圖本發明短肽1抑制HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管；E圖本發明短肽2抑制HUVEC細胞形成光鏡下可見的小管。圖4所示為本發明短肽抑制A549細胞增殖的對比結果，其中A圖為血管緊張素1-7抑制A549細胞生長結果；B圖為本發明短肽1抑制A549細胞生長結果；C圖為本發明短肽2抑制A549細胞生長結果。
具體實施例方式實施1本發明短肽及其異構體對比血管緊張素1-7的耐酶解效果用PBS溶解血管緊張素1-7、發明短肽1、發明短肽2至5mmol/L。用PBS溶解血管緊張素1-7、發明短肽1、發明短肽25μ1+20μ1 PBS 37°C水浴 30min+5 μ 1乙腈過HPLC作標準圖譜。發明短肽15μ 1+10μ 1 ACE 或 NEP 或 LAP 酶(0. 05U)+10PBS 37°C 水浴 30min+5 μ 1 乙腈過HPLC。發明短肽25μ 1+10μ 1 ACE 或 NEP 或 LAP 酶(0. 05U)+10PBS 37°C 水浴 30min+5 μ 1 乙腈過HPLC。色譜條件A液0.1%磷酸溶液B液100%乙腈溶液C18 柱流速0. ;35ml/min12% B溶液平衡柱子後上樣，B液濃度15min中逐漸梯度升至M%，24% B液濃度繼續衝洗15min。結果見圖1，如圖所示，相比於血管緊張素1-7標準品，兩種發明短肽可以更好的抵抗降解血管緊張素1-7相關酶的降解。實施例2本發明短肽及其異構體刺激HUVEC釋放一氧化氮消化HUVEC細胞後以每孔2X IO5個細胞鋪入12孔板加入10% FBS DMEM37°C 5% CO2培養過夜。取10% FBS DMEM分別稀釋angl-7、本發明短肽其結構式為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr -Ile-His-Pro-NH2,和 Ac-Asp-Arg-Val-Tyr (D)-Ile-His (D)-Pro-NH2,為 1 μ m/L。12 孔分為無藥組、angl-7、本發明短肽1、發明短肽2，四組每組2個副孔吸取培養液後加入新鮮培養基或藥物900 μ 1 37°C培養30min。取出12孔板每孔取50 μ 1培養液做一氧化氮含量測定。結果見圖2，如圖所示，加入改構體後改構體可刺激血管內皮細胞(HUVEC)釋放一氧化氮，而一氧化氮是一種強效的舒血管活性物質並對機體氧化損傷有保護作用。實施例3本發明短肽及其異構體抑制HUVEC細胞形成小管預冷96孔板和200 μ 1槍頭，4°C過夜融化_20°C保存的matrgiel基質膠。將融化的matrgiel基質膠50 μ 1每孔快速加入預冷的96孔板，室溫放置IOmin待matrgiel基質膠凝固。消化HUVEC細胞調節細胞密度2 X IO5HiL取144 μ 1細胞懸液加入凝固的matrgiel 基質膠上。DMEM調配1 μ m/L angl_7、本發明短肽1、本發明短肽2，16孔分為無藥組、angl_7、 本發明短肽1、本發明短肽2四組，每組3個副孔加入16 μ 1藥液於加好細胞的96孔板中。370C 5% CO2培養他觀察小管形成效果並計算小管數目。結果見圖3，如圖所示，本發明短肽可以比原型更好的抑制血管內皮細胞的小管形成，內皮細胞遷移、相互融合併形成管狀結構是血管形成過程中的重要環節，如能抑制這一環節，就可以抑制血管的形成和增生。實施例4本發明短肽抑制Α549細胞增殖消化Α549細胞每孔1 X IO4鋪入M孔板加入10% FBS164037°C 5% CO2培養培養過夜。熱壓PBS(PH7. 2)並用其稀釋本發明短肽。取出M孔板後消化第一列孔中細胞計數，其餘孔中細胞吸去培養液4行分別加入PBS，本發明短肽0. 1 μ m/L、1 μ m/L、10 μ m/L衝洗細胞並在37°C孵育30min。吸去洗液加入FBS 164037°C 5% CO2培養培養Id。第二天重複第二段步驟，消化計數第二列孔中細胞並以此類推直到第六天完成實驗，沒孔細胞數描點繪製細胞生長曲線。結果見圖4，如圖所示，本發明短肽1和本發明短肽2擁有類似Angl-7的抑制A549 細胞(肺癌)的增殖的效果。
權利要求
1.一種短肽，其結構式為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-IIe-HiS-Pro-NH2其中Ac-代表氮末端乙醯化，-NH2代表碳末端醯胺化。
2.一種短肽，其結構式為Ac-Asp-Arg-Val-Tyr(D)-Ile-His(D)-Pro其中「D」表示此胺基酸殘基為D構型。
3.—種舒血管降血壓藥物，它的活性成份是治療有效量的權利要求1所述短肽或權利要求2所述短肽。
4.一種抗血管增生藥物，它的活性成份是治療有效量的權利要求1所述短肽或權利要求2所述短肽。
5.一種抗心律失常藥物，它的活性成份是治療有效量的權利要求1所述短肽或權利要求2所述短肽。
6.一種抗癌藥物，它的活性成份是治療有效量的權利要求1所述短肽或權利要求2所述短肽。
7.權利要求1所述短肽或權利要求2所述短肽在製造降壓藥物中的應用。
8.權利要求1所述短肽或權利要求2所述短肽在製造抗心律失常藥物中的應用。
9.權利要求1所述短肽或權利要求2所述短肽在製造抗血栓藥物中的應用。
10.權利要求1所述短肽或權利要求2所述短肽在製造抗癌藥物中的應用。
11.權利要求7、8、9、10所述藥物應用中含有一種或多種藥學上可以接受的載體包括藥學領域常規的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、溼潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等所製成的片劑、粉劑、粒劑、膠囊、及凍乾粉注射液等藥用形式和保健品及食品添加劑形式。
全文摘要
本發明公開了一種短肽、其異構體，其結構如下Ac-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-NH2和Ac-Asp-Arg-Val-Tyr(D)-Ile-His(D)-Pro，兩種改構體擁有促進HUVEC細胞釋放NO遷移和形成小管的能力並且能夠抑制A549細胞生長等類似於血管緊張素1-7的生物學活性；與此同時，該改構體擁有抵抗ACE、NEP、AP這3三種降解酶降解的能力，從而保證其比血管緊張素1-7原型更長的半衰期；該改構體獲得簡單，對開發成為新型心腦血管治療用多肽藥物有重要應用價值。
文檔編號A61P9/06GK102532265SQ201110449129
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者張英起, 王增祿, 郭翰文, 黃同列 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學