一種金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝的製作方法

2023-05-05 15:05:31 1

專利名稱：一種金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種金屬硫蛋白脂質體的生產工藝，具體地說涉及一種金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝，屬於生物製藥領域。
發明背景
金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸基團，對多種重金屬有高度親和性，在一定的酸鹼度(PH值)及細胞氧化-還原電位環境(可藉細胞器某處穀胱甘肽有還原型和氧化型比例，GSH/GSSG比例顯示)條件下易與多個鎘、鋅等金屬離子結合的多肽蛋白質。哺乳動物的金屬硫蛋白由約61個胺基酸組成，含有20個半胱氨酸和7個金屬離子。金屬硫蛋白作為一種應激蛋白、抗自由基氧化劑、細胞鋅離子介導劑等，具有提高人體免疫力、抵抗重金屬中毒、參與微量元素的貯存、運輸和代謝、排鉛補鋅、抗輻射、延緩衰老、保護人體心肺各器官等多種獨特有效的生物學功能。可是，金屬硫蛋白作為一個無細胞膜跨膜傳遞序列 (MTS)以及細胞核定位序列(NLS)的非膜蛋白大分子，在單獨裸露使用、或作為金屬離子螯合金屬硫蛋白使用、或作為金屬硫蛋白與其它物質複合體(如普通納米脂質體)使用時，難以自由穿過細胞膜或細胞核膜而發揮其功效。將金屬硫蛋白製成柔性納米脂質體，可提高其穩定性、尤其是細胞膜透過性可穿過比脂質體本身小數百倍的微孔通道。發明內容
本發明的目的是，針對無論是裸體金屬硫蛋白、金屬離子螯合金屬硫蛋白還是現有已知金屬硫蛋白與其它物質複合體(如普通納米脂質體)都難以自由穿過細胞膜的缺點，提出了具有更好細胞膜孔等生物微小孔道透過性金屬硫蛋白產品，一種金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝。
本發明的技術方案是這樣實現的一種金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝， 實現該工藝的方法的主要特徵包括下列步驟
1、取一定量的任何一種來源的金屬硫蛋白、蛋白質穩定劑或凍幹保護劑(0. l-5w/ v% ),配製成濃度為10-500mM的(緩衝)水溶液，控制溶液的pH值在6. 5到9. 0之間。
2、取一定比例的磷脂(0. 5-10w/v % )、膽固醇(0. 5-10w/v % )、表面活性劑 (0. 5-10w/v% )、溶劑(5-95V/V% )等製成有機相液；
3、將以上緩衝液與有機相溶液導入高壓泵，在包括氮氣保護的條件下充分混合製成混合分散液；
4、將以上混合分散液在均質工作壓力5_480MPa、均質工作溫度4 80°C，包括氮氣保護的條件下通過超高壓納米均質機，製成納米分散液；
5、將以上納米分散液經過孔徑為100-200nm的超濾膜，包括氮氣保護條件下過濾，製成金屬硫蛋白柔性納米脂質體；
6、將以上金屬硫蛋白柔性納米脂質體經冷凍乾燥、裝瓶、充氮氣、封口，於4 20°C保存。
本發明的理論依據是
嵌入金屬硫蛋白柔性納米脂質體包膜層的表面活性劑分子能在高壓力部位蓄積而產生形變，形成較大的高曲度結構；這種結構可減少納米粒子形成及儲存過程中的能量耗散，從而使柔性納米脂質體具有高度的形狀可變性，使之能高效地穿透孔徑比它本身粒徑小5倍的微孔通道，而普通的納米脂質體當其粒徑為微孔通道的1. 7倍時，則完全不能通過。柔性納米脂質體還賦予了脂質體高度的親水性、滲透性與穩定性，從而克服了金屬硫蛋白由於缺少跨膜傳遞序列(MTS)以及細胞核定位序列(NLS)引起的向細胞體、細胞器、生物體遞送的諸多障礙。
本發明的效果作用是
1、通過使用高壓泵混合、超高壓納米均質機造粒、超濾膜過濾等一系列現代納米藥劑製作技術，嚴格控制納米脂質體的質量，製備出粒徑分布更均勻、可控的納米脂質體；
2、通過上述製備工藝，選用合理的脂質、表面活性劑、蛋白質穩定保護劑配方，得到高性能的柔性納米脂質體；
3、通過氮氣保護、柔性納米脂質體製備技術，提高了脂質體的穩定性，包括儲存穩定性；
4、通過上述製備工藝，所製得的納米脂質體粒徑分布為30-300nm、典型的為 80-120nm,平均粒徑為80_200nm、典型的為lOOnm，包裹率為50-99%、典型的為80-90%，儲存穩定期為4-12個月，典型的為6-8個月；
5、通過製得的柔性納米脂質體，使金屬硫蛋白高效地透過孔徑小至10-30nm的細胞體、細胞器、生物體上的微孔通道等。
具體實施方式
實施例一將IOOmg由兔肝提取的純度為99%的金屬硫蛋白、1.5g海藻酸鈉、 IOOmg穀胱甘肽，溶解在IOOml由注射級水配成的pH值為6. 8濃度為IOOmM磷酸鹽PBS緩衝溶液中，混合均勻，過濾除去不溶物，置於5°C冰浴或冰箱中；取3g卵磷脂、IOOmg膽固醇、 200mg膽酸鈉、200mg 二硬脂醯磷脂醯膽鹼，溶解在由25ml水及75ml無水乙醇組成的混合溶劑中，混合均勻，過濾除去不溶物，置於5°C冰浴或冰箱中。
將以上緩衝液與有機相溶液導入高壓泵中，在小於15°C、氮氣保護的條件下充分混合5分鐘，製成混合分散液。
將以上混合分散液導入均質工作壓力進料器，開通氮氣保護，在150MPal5°C條件下通過超高壓納米均質機，製成納米分散液。
將以上納米分散液經過孔徑為IOOnm的超濾膜，在氮氣保護條件下過濾，製成金屬硫蛋白柔性納米脂質體，其粒徑分布為60-120nm、包封率為91%。
將以上金屬硫蛋白柔性納米脂質體經冷凍乾燥、裝瓶、充氮氣、封口，於4°C保存。
實施例二 將150mg由兔肝提取的純度為99%的金屬硫蛋白、2. Og甘露醇、200mg 葡聚糖，溶解在IOOml由注射級水配成的pH值為6. 8濃度為IOOmMTris-HCl緩衝溶液中， 混合均勻，過濾除去不溶物，置於5°C冰浴或冰箱中；取5g卵磷脂、150mg膽固醇、250mg膽酸鈉、200mg聚山梨酯、250mg 二硬脂醯磷脂醯膽鹼，溶解在由20ml水及IOOml無水乙醇組成的混合溶劑中，混合均勻，過濾除去不溶物，置於5°C冰浴或冰箱中。
將以上緩衝液與有機相溶液導入高壓泵中，在小於15°C、氮氣保護的條件下充分混合5分鐘，製成混合分散液。
將以上混合分散液導入均質工作壓力進料器，開通氮氣保護，在150MPal5°C條件下通過超高壓納米均質機，製成納米分散液。
將以上納米分散液經過孔徑為IOOnm的超濾膜，在氮氣保護條件下過濾，製成金屬硫蛋白柔性納米脂質體，其粒徑分布為75-120nm、包封率為87%。
將以上金屬硫蛋白柔性納米脂質體經冷凍乾燥、裝瓶、充氮氣、封口，於4°C保存。
權利要求
1.一種金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝，其特徵包括下列步驟A、取一定量的金屬硫蛋白、蛋白質穩定劑或凍幹保護劑，配製成一定濃度的緩衝溶液。B、取一定比例的磷脂、膽固醇、表面活性劑、蛋白質穩定劑或凍幹保護劑、溶劑等製成有機相溶液。C、將以上緩衝液與有機相溶液通過高壓泵充分混合製成混合分散液。D、將混合分散液通過超高壓納米均質機製成粒徑比較均勻分布的納米脂質體。E、將納米脂質體通過納米超濾膜過濾。F、冷凍乾燥、保存。
2.根據權利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝，其特徵是步驟A所述金屬硫蛋白包括天然提取、人工合成、基因工程-基因重組表達的、人-動物-植物-微生物來源的所有金屬硫蛋白；所述蛋白質穩定劑或凍幹保護劑為蔗糖、海藻糖、甘露醇、穀胱甘肽、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、葡聚糖、白蛋白、L-絲氨酸、穀氨酸鈉、丙氨酸、 甘氨酸、肌氨酸、磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、牛磺酸、殼聚糖、殼寡糖等的一種或兩種以上； 所述濃度為10-500mM ；所述溶液包括去離子水、無菌去離子水、注射用水、PBS或其它磷酸鹽緩衝液、Tris-HCl緩衝液等類似溶液。
3.根據權利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝，其特徵是步驟B所述磷脂為磷脂醯膽鹼(卵磷脂，PC)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂，PE)、磷脂醯絲氨酸(PS)，磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯甘油(PG)、二磷脂醯甘油(心磷脂)等甘油磷脂(含改性甘油磷脂、甘油磷脂衍生物如二硬脂醯磷脂醯膽鹼DSPC)的一種或兩種以上；所述表面活性劑為膽酸鈉、膽酸鉀、去氧膽酸鈉、去氧膽酸鉀、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯、蔗糖酯、二辛基琥珀酸磺酸鈉、月桂酸鈉等的一種或兩種以上；所述溶劑為乙醇、水等溶劑的等一種或兩種以上。
4.根據權利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝，其特徵是步驟C的條件是混合溫度-5-30°C，混合時間30秒至30分鐘、包括氮氣保護。
5.根據權利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝，其特徵是步驟D所述超高壓納米均質機均質工作壓力為5-480MPa、均質工作溫度為4 80°C， 包括氮氣保護；經此步驟製成的體系稱為納米分散液。
6.根據權利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝，其特徵是步驟E所述超濾膜孔徑為100-200nm，過濾過程包括氮氣保護，經此步驟製成的體系稱為柔性納米脂質體。
7.根據權利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝，其特徵是步驟A-E包含溶液的儲罐、溶液流量計量閥，以及由儲罐、閥門、高壓泵、超高壓納米均質機、生產過程質量檢測儀器儀表等構成的自動控制系統。
8.根據權利要求1所述金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝，其特徵是製得的金屬硫蛋白柔性納米脂質體粒徑分布為30-400nm、平均粒徑為80_200nm、包裹率為50-99 %、 儲存穩定期為4-12個月。
全文摘要
本發明針對金屬硫蛋白及金屬硫蛋白與其它物質複合體(如普通納米脂質體)都難以自由穿過細胞膜的缺點，向人們公開了一種金屬硫蛋白柔性納米脂質體的生產工藝。本生產工藝的步驟包括取一定量的金屬硫蛋白、蛋白質穩定劑或凍幹保護劑，配製成一定濃度的緩衝液；取一定比例的磷脂、膽固醇、表面活性劑、溶劑等製成有機相溶液；用高壓泵將緩衝液與有機相溶液充分混合製成混合分散液；將混合分散液通過超高壓納米均質機製成粒徑比較均勻分布的納米脂質體；將納米脂質體通過納米超濾膜過濾；冷凍乾燥、保存。根據本發明生產工藝所生產的產品具有更好的保存穩定性、細胞透過性，可廣泛的用於美容化妝品、心腦血管病等各種疾病的預防與治療。
文檔編號A61P37/04GK102512368SQ20111041888
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月15日 優先權日2011年12月15日
發明者汪志友 申請人:汪志友