人輪狀病毒毒株及其分離，培養與鑑定方法
2023-08-04 05:33:26 1
專利名稱：人輪狀病毒毒株及其分離，培養與鑑定方法
技術領域：
本發明涉及輪狀病毒，尤其是人輪狀病毒毒種毒株的分離、鑑定及毒株的免疫學效果評價。
背景技術：
人輪狀病毒(human rotavirus)是世界範圍內引起嬰幼兒腹瀉最主要的病原體之一。在全球5歲以下的嬰幼兒中，每年因輪狀病毒感染導致的急性胃腸炎達1700萬例，引起約4萬名嬰幼兒死亡，這些死亡病例中的80%發生在亞洲和非洲的低收入發展中國家。在我國，因腹瀉住院的5歲以下的嬰幼兒輪狀病毒檢測陽性率約為50%。輪狀病毒感染在嬰幼 兒主要表現為突然發病、水樣便、嘔吐、發熱和脫水，最終重症嬰幼兒因嚴重脫水、電解質紊亂等導致死亡。目前尚沒有治療輪狀病毒感染的特效藥，多採用對症治療，如靜脈或口服補液，以糾正脫水和電解質紊亂。滅活輪狀病毒疫苗是一種安全有效地預防兒童因感染輪狀病毒所引起疾病的疫苗。但至今仍未有滅活輪狀病毒疫苗產品上市。目前臨床前研究或投放市場的輪狀病毒疫苗均為口服減毒活疫苗，減毒活疫苗儘管有一定效果，但在安全性方面存在缺陷，例如引發腸套疊和毒力回復突變及產生新的變異株的風險；以及冷鏈保存系統要求費用高，因此，研製安全、有效的滅活輪狀病毒疫苗不僅在避免減毒活疫苗使用中存在的問題方面具有優勢，也為未來研製聯合疫苗提供基礎。綜上所述，研製滅活輪狀病毒疫苗具有重要意義及應用前景。
發明內容
本發明的目的在於提供一種人源性輪狀病毒野生型單一純化毒株，該毒株病毒複製能力強，遺傳穩定性好；該毒種可應用於開發人用輪狀病毒疫苗的生產毒種，適用包括減毒型輪狀病毒口服疫苗及滅活型人輪狀病毒注射疫苗；並提供上述毒株的分離、鑑定方法以及免疫學效果評價。本發明公開了一種人輪狀病毒毒種毒株ZTR-5,於2011年06月27日向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提交保藏，保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，編號CGMCC No. 4977，建議分類命名輪狀病毒Rotavirus A。本發明所涉及ZTR-5毒株的分離方法
(1)獲取病毒樣本
收集醫院兒科腹瀉病患幼兒腹瀉排洩物標本，重懸於0.01 M PBS, pH 7.2溶液中，12000 g離心20分鐘取上清液，並使用0. 22 um濾器除菌過濾，_20°C保存備用；
(2)ZTR-5毒株病毒在MA104細胞上的適應
採用0.25%胰酶-EDTA消化已形成單層的P 38代MA104細胞，待細胞經消化形成單個後，以DEME-8% BCS重懸細胞，稀釋至105_°細胞/ml，按2X 105_°細胞/瓶接種小方瓶，37°C培養3 4天後，將輪狀病毒感染的患兒腹瀉樣本稀釋液200 接種於細胞單層，37°C吸附2小時，隨後加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養並觀察細胞病變，至3 4天出現細胞病變後，收穫培養物後繼續同法接種MA104細胞傳代或凍存備用。在本發明的輪狀病毒分離方法中，通過改良傳統輪狀病毒分離方法，採用12000 Xg離心20分鐘取上清液，獲得較高的病毒回收得率和除雜效果，並採用不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養並觀察細胞病變，改善了輪狀病毒初代培養效率。本發明所涉及ZTR-5毒株的培養方法
(1)ZTR-5毒株病毒在Vero細胞上的適應
採用0. 25%胰酶-0. 01%EDTA消化已形成單層的P 148代Vero細胞，並以DMEM_8%BCS重懸細胞，按105_°細胞/瓶接種小方瓶，37°C培養3 4天至形成緻密細胞單層後，接種原MA104細胞收穫的病毒液I ml，接種量約為IO5.0 IO6.0 CCID5(l/ml，37°C吸附2小時，隨後加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養並觀察細胞病變，收穫培養物後繼續同法接種Vero細胞傳代或凍存備用；
(2)病毒毒株ZTR-5的克隆純化
在Veix)細胞上已適應傳代到第5代次的輪狀病毒收穫液，稀釋至lO'lO'lO—5三個稀釋度，接種於已形成單層的Veix)細胞六孔培養板，37°C吸附2小時，加入不含小牛血清的DMEM維持液，48小時後去除培養液，加入含0. 8%瓊脂糖-DMEM，待瓊脂固化後，反置培養於37°C，3天後於鏡下觀察蝕斑形成，用巴氏管吸取出蝕斑，置於1.5 ml離心管，加入0.5 mlDMEM維持液，漩渦振蕩至均勻，隨即接種於Veix)細胞單層，37°C培養3 4天，待細胞病變後收穫病毒，收穫病毒繼續接種於Vero細胞生長傳代；
本發明涉及的輪狀病毒培養及製備方法是基於傳統病毒型疫苗毒種製備的方法進行適應於人輪狀病毒的改良。本發明所涉及ZTR-5毒種的鑑定方法
(OZTR-5毒株病毒滴度測定
取毒種10倍系列稀釋，接種MA104單層細胞進行病毒FFA滴定，按104_°細胞/100 Ul/孔加入MA104細胞，37°C培養3 4天細胞生長為緻密單層，加入10倍系列稀釋的毒種，每個稀釋度10個孔，3 7 °C吸附2小時後加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37 °C培養16小時，採用50%甲醛溶液4°C固定細胞板2小時，洗淨甲醛，隨後加入含I :500稀釋由中國醫學科學院醫學生物學研究所製備的抗輪狀病毒豚鼠血清的5%BSA-PBS pH 7.2溶液，37 °C培養I小時，洗板後加入含I :2000稀釋的Millipore公司製造的羊抗豚鼠FITC抗體的5% BSA-PBS pH 7.2溶液，37 °C培養I小時，洗板後在突光顯微鏡下判定結果，結果計算按Reed-Muench Method公式計算
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dilution above 50%) + (Proportionate distance X log dilution factor)。(2)中和鑑別實驗
將分離毒株病毒抗血清按梯度稀釋後，100 u I/孔接入96孔平底組織培養板，加入梯度稀釋的收穫病毒，37°C CO2孵箱中和I小時後，按104細胞/100 Ul/孔加入經消化懸浮的Vero細胞，37°C CO2孵箱中培養8 10天，觀察結果；
(3)ZTR-5毒株病毒基因組核酸及逆轉錄、cDNA質粒構建病毒基因組的核酸提取按TAKARA MiniBEST病毒基因組RNA提取試劑盒操作手冊進行，病毒基因RNA逆轉錄使用TAKARA OneStep RT-PCR試劑盒，按操作手冊進行，並根據A組輪狀病毒G3型基因型全基因序列設計合成針對11個RNA片段的11對引物，並分段以RT-PCR方法獲得11個cDNA基因片段，克隆入pMD19-T載體中，逐一進行測序；
(4)不同代次ZTR-5毒株病毒基因組穩定性及序列比較
病毒通過在Vero細胞傳代培養,收穫Pl代次至PlO代次的病毒收穫液,病毒基因組的核酸提取按TAKARA MiniBEST病毒基因組RNA提取試劑盒操作手冊進行，非變性PAGE凝膠 電泳11小時，硝酸銀染顯色後於凝膠成像儀記錄圖像，根據輪狀病毒基因序列設計合成針對VP4基因和VP7基因的2對引物，病毒基因RNA逆轉錄使用TAKARA OneStep RT-PCR試劑盒，按操作手冊進行，通過克隆測序後，使用MEGA軟體對不同代次的病毒VP4和VP7基因序列進行比較，其基準序列使用本實驗室對該分離毒株接種Vero傳代至第2代所獲取的基因，共比較I 10代病毒的VP4和VP7基因序列。本發明涉及的輪狀病毒毒種鑑定方法是基於傳統病毒型疫苗毒種製備的方法進行適應於人輪狀病毒的改良。其中病毒滴度的檢測方法改良傳統TCID5tl檢測方法，採用FITC免疫螢光方法測定病毒感染性滴度CCID5tlt
圖I電子顯微鏡下的輪狀病毒形態。圖2輪狀病毒基因組編碼蛋白質模式圖。圖3部分腹瀉病例排洩物輪狀病毒特異性VP4，VP7基因RT-PCR快速檢測。M，Marker ;1 15 :部分腹瀉病例排洩物樣本；C，陰性對照樣本。圖4分離毒株ZTR-5在MA104細胞上傳代培養情況。圖5分離毒株ZTR-5在細胞上的病變情況。圖6 ZTR-5毒株在MA104細胞P2代次FFA方法測定CCID5tl螢光結果 A, C, E, I，K，M，螢光圖片；B，D，F，H，J, L，N，可見光圖片。圖7輪狀病毒形成的蝕斑，圖中A:對照細胞孔；B : ZTR-5株10_4稀釋度接種細胞；C ZTR-5株10_5稀釋度接種細胞；D ZTR-5株10_6稀釋度接種細胞。圖8分離毒株ZTR-5在Veix)細胞上傳代培養情況。圖9分離毒株ZTR-5在Vero細胞上增殖情況。圖10分離毒株ZTR-5在細胞上的病變情況。
具體實施例方式實施例I、輪狀病毒{Rotavirus A ) ZTR-5毒株的分離、培養及鑑定 樣品來源
原始樣品收集雲南省昭通市醫院兒科2009年秋季住院及門診病例，腹瀉病患幼兒腹瀉排洩物標本。ZTR-5毒株來源於一例4月齡男性腹瀉樣品，該病例症狀為中度腹瀉，嘔吐，大便呈黃色稀水樣，2009年10月5日住院治療，病程為4天，樣品採集於2009年10月6日，該患兒接受輸液治療後病情好轉，並於2009年10月9日出院，無既往病史，排洩物中檢測到輪狀病毒抗原陽性，確診病例為輪狀病毒感染引起急性腹瀉。
I、ZTR -5毒株的分離方法
(1)獲取病毒樣本
收集醫院兒科腹瀉病患幼兒腹瀉排洩物標本，重懸於0.01 M PBS, pH 7.2溶液中，12000 g離心20分鐘取上清液，並使用0.22 Pm濾器(購自Millipore公司)除菌過濾，_20°C保存備用；
(2)病毒在MA104細胞上的適應
採用0.25%胰酶-EDTA消化已形成單層的P 38代MA104細胞，待細胞經消化形成單個後，以DEME-8% BCS重懸細胞，稀釋至105_°細胞/ml。按2X 105_°細胞/瓶接種小方瓶，37°C培養3 4天後，將輪狀病毒感染的患兒腹瀉樣本稀釋液200 Ul接種於細胞單層，37°C吸附2小時，隨後加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養並觀察細胞病變。至3 4天出現細胞病變後，收穫培養物後繼續同法接種MA104細胞傳代或凍存備用。該輪狀病毒分尚方法通過改良傳統輪狀病毒分尚方法，米用12000 g尚心20分鐘取上清液，獲得較高的病毒回收得率和除雜效果，並採用不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養並觀察細胞病變。改善了輪狀病毒初代培養效率。、ZTR-5毒株的培養方法
(1)病毒在Vero細胞上的適應
採用0. 25%胰酶-0. 01%EDTA消化已形成單層的P 148代Vero細胞，並以DMEM_8%BCS重懸細胞，按105_°細胞/瓶接種小方瓶，37°C培養3 4天至形成緻密細胞單層後，接種原MA104細胞收穫的病毒液I ml(約為IO5.0 IO6.0 FFA/ml)，37。。吸附2小時，隨後加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養並觀察細胞病變。收穫培養物後繼續同法接種Vero細胞傳代或凍存備用
(2)病毒滴度測定
取毒種10倍系列稀釋，接種MA104單層細胞進行病毒FFA滴定。按104_°細胞/100 Ul/孔加入MA104細胞，37°C培養3 4天細胞生長為緻密單層，加入10倍系列稀釋的毒種，每個稀釋度10個孔，3 7 °C吸附2小時後加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37 °C培養16小時，採用50% (v/v)甲醛溶液4°C固定細胞板2小時，洗淨甲醛，隨後加入含I :500稀釋抗輪狀病毒豚鼠血清(中國醫學科學院醫學生物學研究所製備)的5%BSA-PBS pH 7.2溶液，37 °C培養I小時，洗板後加入含I :2000稀釋的羊抗豚鼠FITC抗體(Millipore公司)的5%BSA_PBS pH 7.2溶液，37 °C培養I小時，洗板後在突光顯微鏡下判定結果，結果計算按Reed-Muench Method公式計算
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dilution above 50%) + (Proportionate distance X log dilution factor)。(3)毒的克隆純化
在Vero細胞上已適應傳代到第5代次的輪狀病毒收穫液，稀釋至10_3、10_4、10_5三個稀釋度，接種於已形成單層的Veix)細胞(六孔板)，37°C吸附2小時，加入不含小牛血清的DMEM維持液，48小時後去除培養液，加入含0. 8%瓊脂糖-DMEM，待瓊脂固化後，反置培養於37°C，3天後於鏡下觀察蝕斑形成。用巴氏管吸取出蝕斑，置於I. 5 ml離心管，加入0.5 ml DMEM維持液，漩渦振蕩至均勻，隨即接種於Veix)細胞單層，37°C培養3 4天，待細胞病變後收穫病毒。收穫病毒繼續接種於Veix)細胞生長傳代。(4)病毒純化
採用超濾一CsCl2密度梯度離心方案進行病毒的純化。具體方法如下輪狀病毒收穫液經過室溫--20反覆凍融3次，經過8000 rpm離心處理30分鐘去除病毒液中較大的細胞碎片及其它成分，使病毒液進一步澄清。採用超濾膜堆設備(ul traf i ltrate, Mi 11 ipore公司)超濾濃縮病毒液，獲得濃縮的病毒，同時也清除病毒液中小於病毒顆粒的降解片段及其它雜質成分。將初步純化濃縮的病毒液經CsCl2密度梯度離心方法純化病毒，作為實驗對照，具體方法如下取經離心初步澄清的輪狀病毒液，加入7% PEG6000，在4°C持續攪拌15小時左右，IOOOOrpm 離心 30min，棄上清，將沉澱用 TNMC(50mM TrisCl, IOOmM NaCl, IOmMCaCl2, ImM MgCl2, pH值7. 4)重懸，再8000rpm離心，收集上清液，獲得初步純化的濃縮病毒液。濃縮病毒液中加入56%的CsCl2,18°C，200 000 X g，離心22小時獲得純化輪狀病毒顆粒。( 5 )病毒滅活及滅活效果檢測
將純化的輪狀病毒液用0. 22 um濾器過濾除菌，盛於50 ml滅菌離心管中，加入終濃度0. 00925%甲醛，先於56°C搖床振蕩30min，再於37°C搖床振蕩72小時進行滅活。其中滅活24小時，將病毒液換至新的滅菌離心管，再繼續在37°C振蕩至72小時。滅活後病毒液加入適量的亞硫酸氫鈉中和殘餘的甲醛。用培養輪狀病毒的Vero細胞對滅活輪狀病毒進行3代盲傳，觀察細胞病變情況，檢測滅活效果。、ZTR-5毒種的鑑定方法
(I)無菌檢測及支原體檢測實驗
取硫乙醇酸鹽流體培養基、營養瓊脂斜面及改良馬丁培養基各4管，每管10 ml培養基接種0.5 ml病毒收穫物。接種後的硫乙醇酸鹽流體培養基、營養瓊脂斜面各2管置30 35°C培養，餘各2管置於20 25°C ;改良馬丁培養基置20 25°C培養；同時以0. 9%無菌氯化鈉溶液同法操作作為陰性對照。培養14天後判定結果。取支原體檢查用半固體培養基及肉湯培養基各4支,半固體培養基煮沸融化,冷卻至56°C .兩種培養基每支均加入預先以4 :1比例混合的滅能小牛血清和雙抗混合液2. 5 ml，迅速搖勻，然後每支培養基各加入待檢樣本0. 5 ml作原代培養，於35°C培養觀察。至第7天時，兩種原代培養基各取出2支轉種，每支培養基各轉種同種培養基2支，0. 5 ml/支，於35°C培養觀察至21天；原代繼續培養觀察至21天。(2)滅活病毒疫苗致病性觀察
取滅活純化的輪狀病毒疫苗樣品，按200 E.U. / 100 u I (Rotavirus ELISA Unit劑量，肌內注射6隻小鼠(BALB/c品系，體重約16g，年齡約3個月，公母個半)。注射病毒後，觀察動物臨床體徵，於14天時，活體取動物肝、心、腦組織進行病理檢查。(3)中和鑑別實驗
將分離毒株病毒抗血清(中國醫學科學院醫學生物學研究所製備)按梯度稀釋後，100U I/孔接入96孔平底組織培養板，加入梯度稀釋的收穫病毒，37°C C02孵箱中和I小時後，按104細胞/100 Ul/孔加入經消化懸浮的Vero細胞，37°C C02孵箱中培養8 10天，觀察結果。
(4)病毒基因組核酸及逆轉錄、cDNA質粒構建病毒基因組的核酸提取按TAKARA MiniBEST病毒基因組RNA提取試劑盒操作手冊進行。病毒基因RNA逆轉錄使用TAKARA OneStep RT-PCR試劑盒，按操作手冊進行。並根據A組輪狀病毒G3型基因型全基因序列設計合成針對11個RNA片段的11對引物，並分段以RT-PCR方法獲得11個cDNA基因片段，克隆入pMD19-T載體中，逐一進行測序。(5)不同代次病毒基因組穩定性及序列比較
病毒通過在Vero細胞傳代培養,收穫Pl代次至PlO代次的病毒收穫液。病毒基因組的核酸提取按TAKARA MiniBEST病毒基因組RNA提取試劑盒操作手冊進行。非變性PAGE凝膠電泳11小時，硝酸銀染顯色後於凝膠成像儀記錄圖像。根據輪狀病毒基因序列設計合成針對VP4基因和VP7基因的2對引物，病毒基因RNA逆轉錄使用TAKARA OneStep RT-PCR試劑盒，按操作手冊進行。通過克隆測序後，使用MEGA軟體對不同代次的病毒VP4和VP7基因序列進行比較。其基準序列使用本實驗室對該分離毒株接種Vero傳代至第2代所獲 取的基因。共比較I 10代病毒的VP4和VP7基因序列。
ZTR-5毒種的免疫效力評價
(I)滅活輪狀病毒疫苗樣品免疫原性分析
為了解滅後輪狀病毒疫苗樣品免疫原性的變化情況，選取第5代病毒收穫液，經純化滅活製備為免疫用疫苗樣品後，以40 E. U./ 100 u 1,80 E. U./ 100 u 1,160 E. U./ 100U I (Rotavirus ELISA Unit)三個劑量，每個劑量肌內注射6隻小鼠(BALB/c品系，體重約16g，年齡約3個月，公母個半)，陰性對照6隻注射PBS 100 Pi。免疫後2、4、6、8周取血分離血清進行血清抗體ELISA效價分析。(2)滅後輪狀病毒疫苗樣品免疫效力分析
為了解滅活輪狀病毒疫苗樣品免疫原性的變化情況，選取第5代病毒收穫液，經純化滅活製備為免疫用疫苗樣品後，以40 E. U./ 100 u 1,80 E. U. / 100 u 1,160 E. U./ 100U I (Rotavirus ELISA Unit)三個劑量，每個劑量肌內注射6隻小鼠(BALB/c品系，體重約16g，年齡約3個月，公母個半)，陰性對照6隻注射PBS 100 yl。免疫後2、4、6、8周取血分離血清進行中和抗體效價測定。免疫後4、8周取血進行基於流式細胞技術的細胞免疫分析。(3)免疫血清特異性輪狀病毒抗體ELISA效價評價實驗
將羊抗輪狀病毒免疫多克隆抗體(Millipore公司)用碳酸鹽緩衝液(pH值9. 6)按I :1000稀釋，每孔100 u I在96孔ELISA板4 °C包被過夜；之後去除包被液，用含
0.5%Tween-20的PBS溶液(PBST溶液)洗板3次，每次3min ;用含有3%牛血清白蛋白的PBST溶液，100 iil/孔，37 °C封閉2小時；去除，PBST洗板，將純化輪狀病毒抗原每孔500FFA(CCID50)/100 U I加入ELISA板，37°C溫育Ih ;洗板後，2倍梯度稀釋待測小鼠免疫血清，100 yl/孔加入ELISA板，37 °C結合Ih ； PBST洗板，加入用PBST緩衝液I :5000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠抗體(Millipore公司)，100 U I/孔，37°C結合Ih ； PBST洗板，用TMB, 100 u I/孔，在室溫顯色15min，再用2M H2S04終止顯色；用酶標儀在450nm檢測光密度值。當待測血清的光密度值是陰性血清的2. I倍時，認為該待測血清為陽性，血清抗體的滴度用血清稀釋度的倒數表示。檢測體系採用經純化的滅活輪狀病毒免疫豚鼠血清作為陽性參考品，無輪狀病毒PBS免疫豚鼠血清作為陰性參考品，PBST緩衝液I : 5000稀釋的HRP標記的山羊抗豚鼠抗體(Millipore公司)作為酶標二抗標定檢測系統的有效性。(4)免疫血清輪狀病毒中和抗體效價評價實驗
將免疫血清按2被梯度稀釋後，按100 Ul/孔加入96孔平底組織培養板，每孔按100CCID50/100iil/孔加入稀釋後的收穫病毒液，37°C C02孵箱中和2小時後，加入已用不含小牛血清的DMEM維持溶液37°C C02處理I小時的培養成緻密單層的96孔平底組織培養板，370C C02孵箱培養24小時，吸出溶液，加入不含小牛血清的DMEM維持溶液37°C C02培養16小時後，用50% (v/v)甲醛溶液4°C固定細胞板2小時，除淨甲醛，隨後加入含I :500稀釋抗輪狀病毒豚鼠血清(中國醫學科學院醫學生物學研究所製備)的5% BSA-PBS pH 7.2溶液，37 °C培養I小時，洗板後加入含I : 2000稀釋的羊抗豚鼠FITC標記抗體(Mi 11 ipore公 司)的5%BSA-PBS pH 7. 2溶液，37°C培養I小時，洗板後在螢光顯微鏡下判定結果。記錄無螢光信號標記細胞的最高血清稀釋度，血清中和抗體的滴度用血清稀釋度的倒數表示。
權利要求
1.一種人輪狀病毒毒種毒株，其特徵在於該毒株為輪狀病毒Obteriry1S J)ZTR-5毒株，於2011年06月27日向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提交保藏，編號CGMCC No. 4977。
2.如權利要求I所述的人輪狀病毒A) ZTR-5毒株的分離方法，其特徵在於具體如下 (1)獲取病毒樣本 收集醫院兒科腹瀉病患幼兒腹瀉排洩物標本，重懸於0.01 M PBS, pH 7.2溶液中，12000 g離心20分鐘取上清液，並使用0. 22 um濾器除菌過濾，_20°C保存備用； (2)ZTR-5毒株病毒在MA104細胞上的適應 採用0.25%胰酶-EDTA消化已形成單層的P 38代MA104細胞，待細胞經消化形成單個後，以DEME-8% BCS重懸細胞，稀釋至105_°細胞/ml，按2X 105_°細胞/瓶接種小方瓶，37°C培養3 4天後，將輪狀病毒感染的患兒腹瀉樣本稀釋液200 Ul接種於細胞單層，37°C吸附2小時，隨後加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養並觀察細胞病變，至3 4天出現細胞病變後，收穫培養物後繼續同法接種MA104細胞傳代或凍存備用。
3.如權利要求I所述的人輪狀病毒(Wahr心A) ZTR-5毒株的培養方法，其特徵在於具體如下 (1)ZTR-5毒株病毒在Vero細胞上的適應 採用0. 25%胰酶-0. 01%EDTA消化已形成單層的P 148代Vero細胞，並以DMEM_8%BCS重懸細胞，按105_°細胞/瓶接種小方瓶，37°C培養3 4天至形成緻密細胞單層後，接種原MA104細胞收穫的病毒液I ml，接種量約為IO5.0 IO6.0 CCID5(l/ml，37°C吸附2小時，隨後加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養並觀察細胞病變，收穫培養物後繼續同法接種Vero細胞傳代或凍存備用； (2)病毒毒株ZTR-5的克隆純化 在Vero細胞上已適應傳代到第5代次的輪狀病毒收穫液，稀釋至10' 10_4、10_5三個稀釋度，接種於已形成單層的Veix)細胞六孔培養板，37°C吸附2小時，加入不含小牛血清的DMEM維持液，48小時後去除培養液，加入含0. 8%瓊脂糖-DMEM，待瓊脂固化後，反置培養於37°C，3天後於鏡下觀察蝕斑形成，用巴氏管吸取出蝕斑，置於1.5 ml離心管，加入0.5 mlDMEM維持液，漩渦振蕩至均勻，隨即接種於Veix)細胞單層，37°C培養3 4天，待細胞病變後收穫病毒，收穫病毒繼續接種於Vero細胞生長傳代。
4.如權利要求I所述的人輪狀病毒Ofeteriry1SA)ZW~5毒株的鑑定方法，其特徵在於具體如下 (OZTR-5毒株病毒滴度測定 取毒種10倍系列稀釋，接種MA104單層細胞進行病毒FFA滴定，按104_°細胞/100 Ul/孔加入MA104細胞，37°C培養3 4天細胞生長為緻密單層，加入10倍系列稀釋的毒種，每個稀釋度10個孔，3 7 °C吸附2小時後加入不含小牛血清的DMEM細胞維持液，37 °C培養16小時，採用50%甲醛溶液4°C固定細胞板2小時，洗淨甲醛，隨後加入含I :500稀釋由中國醫學科學院醫學生物學研究所製備的抗輪狀病毒豚鼠血清的5%BSA-PBS pH 7.2溶液，37 °C培養I小時，洗板後加入含I :2000稀釋的Millipore公司製造的羊抗豚鼠FITC抗體的5% BSA-PBS pH 7.2溶液，37 °C培養I小時，洗板後在突光顯微鏡下判定結果，結果計算按Reed-Muench Method公式計算
全文摘要
一種人輪狀病毒毒株，其特徵在於該毒株為輪狀病毒(RotavirusA)ZTR-5毒株，於2011年06月27日向中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)提交保藏，編號CGMCCNo.4977。該毒株是一種人源性輪狀病毒野生型單一純化毒株，該毒株病毒複製能力強，遺傳穩定性好；該毒種可應用於開發人用輪狀病毒疫苗的生產毒種，適用包括減毒型輪狀病毒口服疫苗及滅活型人輪狀病毒注射疫苗；本發明提供上述毒株的分離、培養及鑑定方法。
文檔編號G01N33/569GK102618506SQ201210077750
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者吳晉元, 孫茂盛, 張光明, 易山, 李泓鈞 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所