一種結合了sars抗原肽的四聚體及其製備和用途的製作方法

2023-08-04 03:15:01

專利名稱：一種結合了sars抗原肽的四聚體及其製備和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種結合了SARS抗原肽的四聚體及其製備和用途。
背景技術：
1996年，Altman在Science上發表文章，首先提出四聚體的概念，他將人的MHCI(主要組織相容性抗原I類分子)HLA-A2(人白細胞抗原A基因座A2位點)組織的重鏈胺基酸C末端加上一段生物素酶識別的胺基酸片段，將HLA-A2重鏈，輕鏈，和兩個主要的HLA-A2限制性HIV抗原決定簇Gag，或Pol摺疊成單體，將此單體與藻紅蛋白標記的去糖基化的鏈酶親和素4∶1混合，形成四聚體。實驗證明應用這兩種HLA-A2/Gag，HLA-A2/Pol四聚體在體外可直接定量分析對Gag，Pol特定抗原有特異性的細胞毒性T細胞數量，(science，1996274，94)，HLA-A2/Gag，Pol四聚體著色試劑還可識別抗原特異性的HLA-A2 CD8+T細胞/Gag，Pol片段。因而MHC四聚體技術提供了定量抗原特異性T細胞群體頻率的測定方法。通過流式細胞術，這些試劑還被直接應用於分析體內抗原特異性的T細胞的頻率和表型。
其原理是MHC/小肽四聚體為由四個相同的、能刺激特異性的T細胞的核心蛋白組成的複合物，當T細胞識別了其臨近細胞表面的靶蛋白的片段上的肽和MHC分子時，T細胞就被激活。目前與MHC/小肽四聚體有關的臨床及基礎研究發展十分迅速。MHC/小肽四聚體已被應用於①定量分析機體對某一抗原肽具有反應性的T細胞水平；②確定機體患自身免疫性疾病的易感性(如II型糖尿病)；③預測某些疾病的發展及愈後；④調節機體細胞免疫力(誘導免疫耐受或產生抗腫瘤/病毒免疫反應的疫苗)。
SARS(嚴重急性呼吸道綜合症)病毒是一種新近發現的冠狀病毒，其表面蛋白可與細胞上的相應受體結合，導致人類發生嚴重急性呼吸道綜合症。SARS病毒與常見的人類冠狀病毒相比，其編碼的蛋白中可以被人類免疫系統識別的抗原決定簇明顯改變和減少。由此表明，SARS病毒引起人類產生嚴重疾病的原因可能與該病毒逃避機體免疫識別有關。因此，尋找一個對SARS感染患者的診斷、愈後的預測方法非常必要。

發明內容
本發明的目的在於利用MHC/小肽四聚體技術，提供一種能直接定量檢測人外周血樣品中對SARS病毒有特異反應性的T細胞水平高低，並能夠引起抗SARS特異的免疫應答的結合了SARS抗原肽的四聚體。
本發明的另一目的在於提供所述結合了SARS抗原肽的四聚體的製備方法。
本發明的再一目的在於提供所述結合了SARS抗原肽的四聚體的用途。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供一種結合了SARS抗原肽的四聚體，包括一分子鏈酶親和素，結合於其上的四分子生物素，每一個生物素分子通過生物素酶識別的胺基酸片段上的賴氨酸與一個HLA-A2.1(人白細胞抗原A基因座A2位點01亞型)分子的α3重鏈的胺基酸C末端相結合，該HLA-A2.1分子由一條43kd的重鏈多肽，及11kd的輕鏈多肽組成，其重鏈有三個功能區α1，α2、α3，其中α1和α2多肽通過多重的摺疊，形成盒狀結構，其特徵在於在α1和α2多肽形成的盒狀結構內的空間中插入一段SARS抗原肽，該SARS抗原肽的胺基酸序列如下1)具有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示的胺基酸序列；2)將1)中的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代，且具有相同功能的多肽。
所述的生物素酶識別的胺基酸片段為Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp。
所述的輕鏈為β-微管蛋白。
所述的SARS抗原肽為SARS病毒的N蛋白解旋酶的一段九肽。
本發明提供一種所述結合了SARS抗原肽的四聚體的製備方法，包括如下的步驟1)HLA-A2.1及人的β-微球蛋白基因的克隆按常規方法，將人的白細胞離心沉澱後，使用mRNA提取試劑盒，分別製備HLA-A2.1及β-微球蛋白的mRNA，cDNA；然後通過基因重組的方法將生物素酶識別的胺基酸片段的cDNA序列與HLA-A2.1的α3重鏈基因連接後，經PCR克隆後插入表達載體，得到含有HLA-A2.1重鏈重組cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA的質粒；
2)蛋白質的分離和純化誘導步驟1)克隆的含有HLA-A2.1重鏈重組cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA的質粒分別在大腸桿菌體內大量合成HLA-A2.1重組重鏈蛋白，β-微球蛋白；收集菌體，純化，得到初步提純的含有HLA-A2.1重組重鏈蛋白和β-微球蛋白的包涵體蛋白，將此蛋白溶於6M尿素中，於-80℃冰箱中備用；3)蛋白摺疊於10℃冷卻的摺疊緩衝液中，邊攪拌邊加入30mg/L的SARS抗原肽的DMSO(二甲基亞碸)溶液，再將含有步驟2)製得的1μM HLA-A2.1重組重鏈蛋白、2μM β-微球蛋白的注射緩衝液迅速加入反應體系，在常溫下攪拌24～72小時，每24小時再加入1μM HLA-A2.1重組重鏈蛋白，得到摺疊了的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體，10℃貯存備用；4)濃縮及透析經步驟3)摺疊的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白進行超濾濃縮100～200倍；然後用生物素化緩衝液於4℃透析，直到透析袋中的沉澱溶解；將透析袋中的溶液離心，除去沉澱，加入400μM生物素，5 mM ATP，200mMPMSF(苯甲基磺醯氟)，0.1μM生物素-蛋白連接酶，室溫下孵育過夜，將此溶液經分子篩柱層析和離子交換柱層析提純後，用含蛋白抑制劑的緩衝液透析並保存，得到生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白溶液；5)四聚體的形成在室溫、避光條件下，將鏈酶親和素偶聯物的水溶液緩慢加入步驟4)的生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白溶液中，得到結合了SARS抗原肽的四聚體，並於4℃避光保存。
所述步驟1)的生物素酶識別的胺基酸片段為Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp。
所述步驟1)的表達載體為pET載體(Novogen)，cDNA插入該質粒的EcoR I和BamH I酶切位點之間。
所述步驟2)的誘導是將步驟1)克隆的含有HLA-A2.1重鏈重組cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA的質粒，分別轉化到大腸桿菌BL21菌株，通過加入終濃度為1mM的IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，使細菌在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中擴增至OD值0.5～1.0，誘導含有HLA-A2.1重鏈重組cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA質粒在大腸桿菌體內大量合成HLA-A2.1重組重鏈蛋白，此誘導過程重複3～4次。
所述步驟2)的純化是將收集到的菌體，重懸於重懸液，邊攪拌邊滴入1.2ml 50mg/ml的溶菌酶(終濃度為1mg/ml)，300μl 1.0M MgCl2(終濃度5mM)，1.0ml 2mg/mlDNA酶(溶於50％甘油，75mM NaCl)，600μl Triton-X100(終濃度為1％)，600μDTT(二硫蘇糖醇)1M(終濃度10mM)；超聲波破碎，離心分離，得到初步提純的含有HLA-A2.1重組重鏈蛋白，β-微球蛋白的包涵體蛋白。
所述步驟2)的重懸液為50mM Tris-HCL(pH 8.0)，25％(w/v)蔗糖，1mM EDTA，0.1％(w/v)疊氮鈉，10mM DTT。
所述步驟3)的SARS抗原肽的胺基酸序列如下1)具有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示的胺基酸序列；2)將1)中的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代，缺失或添加且具有相同功能的多肽。
所述步驟3)的摺疊緩衝液為400mM L-Arginine，100mM Tris，2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH 8.3的水溶液，臨用前加入終濃度為5mM的還原型穀胱甘肽，終濃度為0.5mM的氧化穀胱甘肽，終濃度為0.2mM的PMSF。
所述步驟3)注射緩衝液為3M鹽酸胍，10mM己酸鈉，10mM EDTA，pH 4.2的水溶液。
所述步驟4)生物素化緩衝液為100mM Tris(pH 7.5)，200mM NaCl，5mM MgCl2的水溶液。
所述步驟4)的含蛋白抑制劑的緩衝液為1*PBS，含1μg/ml亮肽素，1μM胃酶抑素和2mM己二胺四乙酸。
本發明提供一種所述結合了SARS抗原肽的四聚體的用途，該四聚體可用於直接定量檢測人外周血樣品中對SARS病毒有特異反應性T細胞水平的高低。
本發明提供一種所述結合了SARS抗原肽的四聚體的用途，該四聚體可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
本發明提供的結合了SARS抗原肽的四聚體的優益之處在於1、HLA-A2.1是典型的MHC I類組織相容性抗原蛋白亞型，在人群中有較高頻率，HLA-A2.1/SARS抗原肽四聚體能夠模擬靶細胞表面HLA-A2.1/SARS抗原肽複合物因而該結合了SARS抗原肽的四聚體特異性更強；2、該結合了SARS抗原肽的四聚體對SARS病毒有特異性，可以檢測機體對SARS病毒細胞免疫力高低及應答狀態，迅速的測試新的疫苗的活性或確定入侵的微生物的哪些部分刺激了免疫反應的產生；
3、該結合SARS抗原肽的四聚體與T細胞的結合比單體更牢固，時間更長，因而在用於直接定量檢測人外周血樣品中對SARS病毒有特異反應性T細胞水平的高低時，更具有特異性高、敏感準確(可達幹分之幾)、方便可行(僅需病人血樣)等優點；該實驗方法的建立將有助於臨床SARS的診治及其愈後的預測。具有現實的臨床意義；4、該結合了SARS抗原肽的四聚體對與T細胞受體具有高親合力，可應用製備SARS病毒的免疫疫苗；與SARS DNA疫苗相比，該疫苗具有製備更簡易，並且對於免疫細胞具有更高的親和力，更強的特異性，應用更安全，方便等優點。


圖1是本發明提供的結合了SARS抗原肽的四聚體的結構示意圖；其中，鏈酶親和素分子1；生物素分子2；生物素酶識別序列的賴氨酸結合位點3，其通過化學鍵與生物素分子結合；HLA-A2.1分子的輕鏈4； HLA-A2.1分子α1重鏈5；HLA-A2.1分子α2重鏈6； HLA-A2.1分子α3重鏈7；插入的SARS抗原肽8；圖2是實施例1製備的結合了SARS抗原肽的四聚體HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體誘導HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖的刺激指數圖；其中□代表空白對照組；■代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組；圖3是實施例1製備的結合了SARS抗原肽的四聚體HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體體外誘導HLA-A2.1+小鼠外周血淋巴細胞增殖的刺激指數圖；其中■代表空白對照組；□代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組；圖4是實施例1製備的結合了SARS抗原肽的四聚體HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞CD69的表達情況；其中a代表空白對照組；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組；圖5是實施例1製備的結合了SARS抗原肽的四聚體HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率；其中a代表空白對照組；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組；
圖6是實施例1製備的結合了SARS抗原肽的四聚體HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體刺激後，HLA-A2.1+人外周血CD8+細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率；其中a代表空白對照組；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組。
具體實施例方式
實施例1、製備插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚體1)HLA-A2.1及人的β-微球蛋白基因的克隆將人的白細胞離心沉澱後，使用mRNA提取試劑盒(Pharmacia)，按常規方法分別製備HLA-A2.1及β-微球蛋白的mRNA，cDNA；通過基因重組的方法將生物素酶識別的胺基酸片段Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp的cDNA序列與HLA-A2.1的α3重鏈基因連接後，將此重組的HLA-A2.1重鏈連有生物素酶識別序列的cDNA和β-微球蛋白的cDNA經PCR克隆後插入表達載體pET(Novogen)的EcoR I和BamH I酶切位點之間，得到含有HLA-A2.1重鏈連有生物素酶識別序列cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA的質粒；2)蛋白質的分離和純化將步驟1)克隆的含有HLA-A2.1連有生物素酶識別序列cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA的質粒，分別轉化到大腸桿菌BL21，通過加入終濃度為1mM的IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)，使細菌在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中擴增至OD值0.75，誘導含有HLA-A2.1 cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA質粒在大腸桿菌體內大量合成HLA-A2.1重組重鏈蛋白，β-微球蛋白，經4次的誘導後，離心收集菌體，重懸於60ml重懸液(50mM Tris-HCL(pH 8.0)，25％(w/v)蔗糖，1mM EDTA，0.1％(w/v)疊氮鈉，10mM DTT)，倒入100ml燒杯，在磁力攪拌器中攪拌，邊攪拌邊滴入1.2ml 50mg/ml的溶菌酶(終濃度為1mg/ml)，300μl.0M MgCl2(終濃度5mM)，1.0ml 2mg/ml DNA酶(溶於50％甘油，75mM NaCl)，600μl Triton-X100(終濃度為1％)，600μl 1M DTT(終濃度10mM)，超聲波破碎，離心分離，得到初步提純的含有HLA-A2.1重組重鏈蛋白，β-微球蛋白的包涵體蛋白，收集此蛋白，於6M尿素中溶解，存於-80℃冰箱中備用；3)蛋白復性(摺疊)預先在1L的燒杯中準備1L摺疊緩衝液(400mM L-Arginine，100mM Tris，2mMEDTA，5mM的還原型穀胱甘肽，0.5mM的氧化穀胱甘肽，0.2mM的PMSF，pH 8.3的水溶液)，內放一個磁力攪拌棒，置於10℃水浴冷卻，將裝有摺疊緩衝液的燒杯置磁力攪拌器上高速攪拌，將SARS特異抗原小肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val用500μl DMSO稀釋，用吸管加入反應體系，終濃度為30mg/L，將步驟2)所述的HLA-A2.1重組重鏈蛋白、β-微球蛋白分別加入5.0ml注射緩衝液(3M鹽酸胍，10mM己酸鈉，10mM EDTA，pH 4.2的水溶液)，在室溫下分別吸入兩支注射器，急速用26號針頭注入反應體系，其終濃度分別為1μM，2μM，在常溫下攪拌72小時，每24小時再加入1μM HLA-A2.1重組重鏈蛋白，得到摺疊了含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體，10℃貯存備用；4)濃縮樣本及透析經步驟3)摺疊的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白用超濾裝置(Amiconl)進行常規超濾濃縮，濃縮100倍，然後用IL生物素化緩衝液(100mM Tris(pH 7.5)，200mM NaCl，5mM MgCl2的水溶液)4℃透析，直到透析袋中的沉澱溶解。吸出透析袋中的樣品，在低溫臺式離心機中以最大速度離心，以除去沉澱；在上述樣品中加入生物素(Tris-base稀釋)，終濃度為400μM；ATP，終濃度為5mM；PMSF終濃度為200mM；生物素-蛋白連接酶，終濃度為0.1μM，室溫下孵育過夜，生物素和含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白在生物素-蛋白連接酶的作用下結合，收集樣品；經S-300分子篩柱層析，分離提純，進一步以離子交換柱層析(mono Q HR5/5柱)，經收集的樣品，用ultrafree-4離心過濾器濃縮到體積100-300μl，用含蛋白抑制劑的緩衝液(1*PBS，含1μg/ml亮肽素，1μM胃酶抑素和2mM EDTA)透析，置換緩衝液，保存在含蛋白抑制劑的PBS緩衝液中；5)四聚體的形成在室溫黑暗中，將1mg/ml鏈酶親和素偶聯物水溶液320μl分10次緩慢加入濃度為2mg/ml的經上述過程製備的生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白100μl中，每個鏈酶親和素分子都有4個生物素結合位點，即可以結合4個上述單體，形成四聚體；將上述得到的結合了SARS抗原肽的四聚體避光，4℃保存。
上述方法所製備的結合了SARS抗原肽的四聚體——HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體其結構示意圖如圖1所示，對該結合了SARS抗原肽的四聚體進行如下的實驗
實驗1-1、誘導HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖實驗取HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞與HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體共培養4天，另設一不加HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體的空白對照組，用3H慘入法測定其增殖率。結果如圖2所示，其中□代表空白對照組；■代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組，加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的脾淋巴細胞刺激指數為3.23，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖。
實驗1-2、體外誘導HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴細胞增殖實驗取HLA-A2.1+轉基因老鼠外周血淋巴細胞與HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體共培養4天，另設一不加HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體的空白對照組，用3H慘入法測定其增殖率。結果如圖3所示，其中■代表空白對照組；□代表HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組，加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的外周血淋巴細胞刺激指數為3.22，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠外周血淋巴細胞增殖。
實驗1-3、使用實施例1製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率取HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞與HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體共培養3天，另設一不加HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體的空白對照組，用流式細胞儀測定其HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率。結果如圖5所示，其中a代表空白對照組；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組，用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組四聚體的陽性細胞百分率為15.1％，空白對照組為4.4％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
實驗1-4、使用實施例1製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞CD69的表達情況取HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞與HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體共培養3天，另設一不加HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體的空白對照組，用流式細胞儀測定其T細胞活化標誌抗原，CD69抗原的活化情況。結果如圖4所示，其中a代表空白對照組；b代表HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組，用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組CD69抗原表達值為10.1％，空白對照組為3.4％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞活化。
實驗1-5、使用實施例1製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+人外周血CD8+細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率取HLA-A2.1+人外周血淋巴細胞細胞與HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體共培養3天，另設一不加HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體的空白對照組，用流式細胞儀測定其HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率。結果如圖6所示，其中a代表空白對照組；b代表HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組，用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組陽性細胞百分率為11.6％，空白對照組為1.80％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
由上述實驗結果，可知HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體具有激發免疫反應的能力，可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
實施例2、製備插有Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚體將SARS抗原肽Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val(與實施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val僅在第2位不同，由Val取代了Leu)，按實施例1所述製備方法製備結合了SARS抗原肽Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val的四聚體。
用上述製備的HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體進行如下的實驗實驗2-1、誘導HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-1所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的脾淋巴細胞刺激指數為4.02，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖。
實驗2-2、體外誘導HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-2所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的外周血淋巴細胞刺激指數為3.53，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠外周血淋巴細胞增殖。
實驗2-3、使用實施例2製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-3所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組四聚體的陽性細胞百分率為12.8％，空白對照組為2.6％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
實驗2-4、使用實施例2製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞CD69的表達情況如實施例1中的實驗1-4所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARSIle-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組CD69抗原表達值為14.1％，空白對照組為3.9％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞活化。
實驗2-5、使用實施例2製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+人外周血CD8+細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-5所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組陽性細胞百分率為10.25％，空白對照組為2.43％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
由上述實驗結果，可知HLA-A2.1/SARS Ile-Val-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體具有激發免疫反應的能力，可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
實施例3、製備插有Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚體將SARS抗原肽Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val(與實施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val僅在第2位不同，由Ala取代了Leu)，按實施例1所述製備方法製備結合了SARS抗原肽Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val的四聚體。
用上述製備的HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體進行如下的實驗實驗3-1、誘導HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-1所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARSIle-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的脾淋巴細胞刺激指數為4.29，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖。
實驗3-2、體外誘導HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-2所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的外周血淋巴細胞刺激指數為4.31，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠外周血淋巴細胞增殖。
實驗3-3、使用實施例3製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-3所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組四聚體的陽性細胞百分率為15.1％，空白對照組為2.6％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
實驗3-4、使用實施例3製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞CD69的表達情況如實施例1中的實驗1-4所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組CD69抗原表達值為14.2％，空白對照組為4.0％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞活化。
實驗3-5、使用實施例3製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+人外周血CD8+細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-5所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS四聚體組陽性細胞百分率為9.01％，空白對照組為1.24％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
由上述實驗結果，可知HLA-A2.1/SARS Ile-Ala-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體具有激發免疫反應的能力，可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
實施例4、製備插有Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚體將SARS抗原肽Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val(與實施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val僅在第2位不同，由Met取代了Leu)，按實施例1所述製備方法製備結合了SARS抗原肽Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val的四聚體。
用上述製備的HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體進行如下的實驗實驗4-1、誘導HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-1所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的脾淋巴細胞刺激指數為4.51，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖。
實驗4-2、體外誘導HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-2所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的外周血淋巴細胞刺激指數為3.84，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠外周血淋巴細胞增殖。
實驗4-3、使用實施例4製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-3所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARSIle-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組四聚體的陽性細胞百分率為14.7％，空白對照組為2.0％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
實驗4-4、使用實施例4製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞CD69的表達情況如實施例1中的實驗1-4所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組CD69抗原表達值為13.5％，空白對照組為3.4％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞活化。
實驗4-5、使用實施例4製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+人外周血CD8+細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-5所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組陽性細胞百分率為8.11％，空白對照組為1.22％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
由上述實驗結果，可知HLA-A2.1/SARS Ile-Met-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體具有激發免疫反應的能力，可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
實施例5、製備插有Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚體將SARS抗原肽Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val(與實施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val僅在第2位不同，由Ile取代了Leu)，按實施例1所述製備方法製備結合了SARS抗原肽Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val的四聚體。
用上述製備的HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體進行如下的實驗實驗5-1、誘導HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-1所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的脾淋巴細胞刺激指數為4.58，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖。
實驗5-2、體外誘導HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-2所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組的外周血淋巴細胞刺激指數為3.74，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠外周血淋巴細胞增殖。
實驗5-3、使用實施例5製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-3所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組四聚體的陽性細胞百分率為15.8％，空白對照組為2.3％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
實驗5-4、使用實施例5製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞CD69的表達情況如實施例1中的實驗1-4所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組CD69抗原表達值為14.2％，空白對照組為2.7％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞活化。
實驗5-5、使用實施例5製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+人外周血CD8+細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-5所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體組陽性細胞百分率為9.05％，空白對照組為2.10％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
由上述實驗結果，可知HLA-A2.1/SARS Ile-Ile-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val四聚體具有激發免疫反應的能力，可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
實施例6、製備插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala所示序列的SARS抗原小肽的四聚體將SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala(與實施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val僅在第9位不同，由Ala取代了Leu)，按實施例1所述製備方法製備結合了SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala的四聚體。
用上述製備的HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體進行如下的實驗實驗6-1、誘導HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-1所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體組的脾淋巴細胞刺激指數為5.01，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖。
實驗6-2、體外誘導HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-2所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體組的外周血淋巴細胞刺激指數為3.37，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠外周血淋巴細胞增殖。
實驗6-3、使用實施例6製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-3所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體組四聚體的陽性細胞百分率為14.4％，空白對照組為2.1％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
實驗6-4、使用實施例6製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞CD69的表達情況如實施例1中的實驗1-4所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體組CD69抗原表達值為15.5％，空白對照組為2.6％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞活化。
實驗6-5、使用實施例6製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+人外周血CD8+細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-5所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體組陽性細胞百分率為8.31％，空白對照組為1.77％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
由上述實驗結果，可知HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ala四聚體具有激發免疫反應的能力，可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
實施例7、製備插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile所示序列的SARS抗原小肽的四聚體將SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile(與實施例1所述的SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val僅在第9位不同，由Ile取代了Leu)，按實施例1所述製備方法製備結合了SARS抗原肽Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile的四聚體。
用上述製備的HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體進行如下的實驗實驗7-1、誘導HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-1所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體組的脾淋巴細胞刺激指數為4.33，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠脾淋巴細胞增殖。
實驗7-2、體外誘導HLA-A2.1+老鼠外周血淋巴細胞增殖實驗如實施例1中的實驗1-2所述方法進行實驗，結果為加入HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體組的外周血淋巴細胞刺激指數為3.87，空白對照組為1.00，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體能夠非常明顯的刺激HLA-A2.1+轉基因老鼠外周血淋巴細胞增殖。
實驗7-3、使用實施例7製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-3所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體組四聚體的陽性細胞百分率為13.6％，空白對照組為1.6％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARSIle-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
實驗7-4、使用實施例7製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+轉基因老鼠CD8細胞CD69的表達情況如實施例1中的實驗1-4所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚表達值為13.7％，空白對照組為2.5％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞活化。
實驗7-5、使用實施例7製備的四聚體刺激後HLA-A2.1+人外周血CD8+細胞HLA-A2.1/SARS四聚體的陽性細胞百分率如實施例1中的實驗1-5所述方法進行實驗，結果為用HLA-A2.1/SARS四聚體刺激後，HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體組陽性細胞百分率為8.76％，空白對照組為1.56％，兩者比較有非常顯著的差異，說明HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體能夠非常明顯的刺激T細胞發生免疫應答。
由上述實驗結果，可知HLA-A2.1/SARS Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Ile四聚體具有激發免疫反應的能力，可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
實施例8、製備插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚體與實施例1中的製備方法相同，只是在步驟2)蛋白質的分離和純化時，使細菌在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中擴增至OD值0.5；誘導過程重複4次；在步驟3)蛋白復性時，將混合液在常溫下攪拌48小時；在步驟4)濃縮及透析時，將經步驟3)摺疊的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白超濾濃縮200倍。實施例9、製備插有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示序列的SARS抗原小肽的四聚體與實施例1中的製備方法相同，只是在步驟2)蛋白質的分離和純化時，使細菌在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中擴增至OD值1.0；誘導過程重複3次；在步驟3)蛋白復性時，將混合液在常溫下攪拌24小時；在步驟4)濃縮及透析時，將經步驟3)摺疊的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白超濾濃縮150倍。
權利要求
1.一種結合了SARS抗原肽的四聚體，包括一分子鏈酶親和素，結合於其上的四分子生物素，每一個生物素分子通過生物素酶識別的胺基酸片段上的賴氨酸與一個HLA-A2.1分子的α3重鏈的胺基酸C末端相結合，該HLA-A2.1分子由一條43kd的重鏈多肽，及11kd的輕鏈多肽組成，其重鏈有三個功能區α1，α2、α3，其中α1和α2多肽通過多重的摺疊，形成盒狀結構，其特徵在於在α1和α2多肽形成的盒狀結構內的空間中插入一段SARS抗原肽，該SARS抗原肽的胺基酸序列如下1)具有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示的胺基酸序列；2)將1)中的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代，且具有相同功能的多肽。
2.如權利要求1所述的結合了SARS抗原肽的四聚體，其特徵在於，所述的生物素酶識別的胺基酸片段為Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp。
3.一種權利要求1所述的結合了SARS抗原肽的四聚體的製備方法，包括如下的步驟1)HLA-A2.1及人的β-微球蛋白基因的克隆按常規方法，將人的白細胞離心沉澱後，使用mRNA提取試劑盒，分別製備HLA-A2.1及β-微球蛋白的mRNA，cDNA；然後通過基因重組的方法將生物素酶識別的胺基酸片段的cDNA序列與HLA-A2.1的α3重鏈基因連接後，經PCR克隆後插入表達載體，得到含有HLA-A2.1重鏈重組cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA的質粒；2)蛋白質的分離和純化誘導步驟1)克隆的含有HLA-A2.1重鏈重組cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA的質粒分別在大腸桿菌體內大量合成HLA-A2.1重組重鏈蛋白，β-微球蛋白；收集菌體，純化，得到初步提純的含有HLA-A2.1重組重鏈蛋白和β-微球蛋白的包涵體蛋白，將此蛋白溶於6M尿素中，於-80℃冰箱中備用；3)蛋白摺疊於10℃冷卻的摺疊緩衝液中，邊攪拌邊加入30mg/L的SARS抗原肽的DMSO溶液，再將含有步驟2)製得的1μM HLA-A2.1重組重鏈蛋白、2μM β-微球蛋白的注射緩衝液迅速加入反應體系，在常溫下攪拌24～72小時，每24小時再加入1μM HLA-A2.1重組重鏈蛋白，得到摺疊了的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體，10℃貯存備用；4)濃縮及透析經步驟3)摺疊的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白進行超濾濃縮100～200倍；然後用生物素化緩衝液於4℃透析，直到透析袋中的沉澱溶解；將透析袋中的溶液離心，除去沉澱，加入400μM生物素，5mM ATP，200mMPMSF，0.1μM生物素-蛋白連接酶，室溫下孵育過夜，將此溶液經分子篩柱層析和離子交換柱層析提純後，用含蛋白抑制劑的緩衝液透析並保存，得到生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白溶液；5)四聚體的形成在室溫、避光條件下，將鏈酶親和素偶聯物的水溶液緩慢加入步驟4)的生物素化的含有SARS抗原肽的HLA-A2.1分子單體蛋白溶液中，得到結合了SARS抗原肽的四聚體，並於4℃避光保存。
4.如權利要求3所述的結合了SARS抗原肽的四聚體的製備方法，其特徵在於，所述步驟1)的生物素酶識別的胺基酸片段為Leu-Gly-Gly-Ile-Phe-Glu-Ala-Met-Lys-Met-Glu-Leu-Arg-Asp。
5.如權利要求3所述的結合了SARS抗原肽的四聚體的製備方法，其特徵在於，所述步驟2)的誘導是將步驟1)克隆的含有HLA-A2.1重鏈重組cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA的質粒，分別轉化到大腸桿菌BL21菌株，通過加入終濃度為1mM的異丙基硫代半乳糖苷，使細菌在含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中擴增至OD值0.5～1.0，誘導含有HLA-A2.1重鏈重組cDNA的質粒和含有β-微球蛋白cDNA質粒在大腸桿菌體內大量合成HLA-A2.1重組重鏈蛋白，此誘導過程重複3～4次；所述步驟2)的純化是將收集到的菌體，重懸於重懸液，邊攪拌邊滴入1.2ml 50mg/ml的溶菌酶，300μl 1.0M MgCl2，1.0ml 2mg/ml DNA酶，600μl Triton-X100，600μl 1M；超聲波破碎，離心分離，得到初步提純的含有HLA-A2.1重組重鏈蛋白，β-微球蛋白的包涵體蛋白；所述步驟2)的重懸液為50mM Tris-HCL，25w/v％蔗糖，1mMEDTA，0.1w/v％疊氮鈉，10mM DTT。
6.如權利要求3所述的結合了SARS抗原肽的四聚體的製備方法，其特徵在於，所述步驟3)的SARS抗原肽的胺基酸序列如下1)具有Ile-Leu-Gly-Leu-Pro-Thr-Gln-Thr-Val所示的胺基酸序列；2)將1)中的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代，缺失或添加且具有相同功能的多肽。
7.如權利要求3所述的結合了SARS抗原肽的四聚體的製備方法，其特徵在於，所述步驟3)的摺疊緩衝液為400mM L-Arginine，100mM Tris，2mM EDTA，pH8.3的水溶液，臨用前加入終濃度為5mM的還原型穀胱甘肽，終濃度為0.5mM的氧化穀胱甘肽，終濃度為0.2mM的PMSF；所述步驟3)注射緩衝液為3M鹽酸胍，10mM己酸鈉，10mM EDTA，pH4.2的水溶液。
8.如權利要求3所述的結合了SARS抗原肽的四聚體的製備方法，其特徵在於，所述步驟4)生物素化緩衝液為100mM Tris，200mM NaCl，5mM MgCl2的水溶液；所述步驟4)的含蛋白抑制劑的緩衝液為PBS，含1μg/ml亮肽素，1μM胃酶抑素和2mM EDTA。
9.一種權利要求1所述的結合了SARS抗原肽的四聚體的用途，該四聚體可用於直接定量檢測人外周血樣品中對SARS病毒有特異反應性T細胞水平的高低。
10.一種權利要求1所述的結合了SARS抗原肽的四聚體的用途，該四聚體可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
全文摘要
本發明涉及一種結合了SARS抗原肽的四聚體及其製備和用途。該四聚體包括一分子鏈酶親和素，結合於其上的四分子生物素，每一個生物素分子與一個HLA－A2.1分子的α3重鏈的胺基酸C末端相結合，該HLA－A2.1分子重鏈有三個功能區α1，α2、α3，其中α1和α2多肽形成的盒狀結構中插入一段SARS抗原肽，該SARS抗原肽的胺基酸序列如Ile－Leu－Gly－Leu－Pro－Thr－Gln－Thr－Val所示，或是此序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代，且具有相同功能的多肽。該四聚體是通過將HLA－A2.1及人的β－微球蛋白基因的克隆、蛋白質的分離和純化、蛋白摺疊、濃縮及透析，最後形成四聚體製得。該結合了SARS抗原肽的四聚體可用於直接定量檢測人外周血樣品中對SARS病毒有特異反應性T細胞水平的高低，還可用於製備抗SARS病毒的免疫疫苗。
文檔編號A61P31/14GK1618802SQ20031011372
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優先權日2003年11月21日
發明者趙勇, 謝衛東, 邵蘭 申請人:中國科學院動物研究所