人UTP14a蛋白表達抑制劑在製備細胞增殖抑制劑中的應用的製作方法

2023-08-03 19:15:06

專利名稱：人UTP14a蛋白表達抑制劑在製備細胞增殖抑制劑中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及人UTP14a蛋白表達抑制劑在製備細胞增殖抑制劑中的應用。
背景技術：
核仁(nucleolus)是一個高度緻密、動態的亞細胞結構。核仁的主要功能是為核 糖體生物發生提供場所，核糖體生物發生包括三個重要的步驟1)核糖體RNA轉錄；2) 核糖體RNA的加工；3)核糖體大、小亞基的組裝。哺乳動物細胞中，47S的rRNA前 體在核仁由RNA polymerase I轉錄生成。47S的rRNA前體含有三個轉錄區以及四個轉 錄間隔區。三個轉錄區包括18S、5.8S、28S rRNA序列。四個轉錄間隔區包括5，外 部轉錄間隔區(5，external transcribe spacer, 5' ETS)，位於 I8S rRNA 序列的上遊；兩 個內部轉錄間隔區(internal transcribe spacer，ITS1，ITS2)，分別位於5.8S rRNA序列的 兩側；以及較短的3』外部轉錄間隔序列(3，external transcribe spacer, 3，ETS)位於 28S rRNA的下遊。47S rRNA前體在核酸內切酶作用下經過剪切加工生成成熟的18S、 5.8S和28S rRNA。5S rRNA由RNA polymerase III轉錄，在核漿轉錄完成後被轉運至核 仁。在真核生物中18S rRNA和34種核糖體小亞基蛋白組裝成40S小亞基，28SrRNA、 5S rRNA、5.8S rRNA和49種核糖體大亞基蛋白組成60S大亞基。rRNA的加工過程包括rRNA的修飾與剪切。rRNA的修飾與剪切主要由小核仁 核糖核蛋白體顆粒(small nucleolar ribonucleoprotein particals, snoRNPs)來完成。snoRNPs 由小核仁RNA (small nucleolar RNA, snoRNA)和相關蛋白結合而成，通過其snoRNA與 核糖體RNA前體鹼基配對介導核糖體RNA前體的修飾和剪切。在18S rRNA的剪切加工過程中U3 snoRNA起重要作用。U3 snoRNA在真核細 胞中普遍存在，生化與基因分析顯示U3 snoRNA主要通過與核糖體RNA前體通過鹼基 配對來介導核糖體RNA前體的剪切。U3 snoRNA和40餘種蛋白組成核糖核蛋白體複合 物(U3snoRNPs，U3 snoRNA particle)發揮剪切加工作用。在酵母中U3 otoRNPs所含的 40餘種蛋白包括四種與U3 snoRNA結合的核心蛋白fibrillarin，Nop58p, Nop56p, Snul3p(在哺乳動物中是15.5kDa蛋白)；六種與U3 snoRNA特異結合的蛋白Sofl， MpplO, Imp3, Imp4, Dhrl, Rrp9 ；五種核糖體蛋白 Rps4，Rps6, Rps7, Rpsl4 和 Rps28 ；還包括參與18S rRNA加工的蛋白Rrp5和一些與U3 snoRNA結合的蛋白。這些與 U3 snoRNA結合的蛋白命名為UTP (U three protein)。 目前在酵母中發現的有Utpl_17， 18，20-22。小亞基加工體(small subunit processome，SSU)是 U3 snoRNP 中的一組蛋 白，它們是與U3 snoRNA結合的核仁蛋白，參與18S rRNA加工。Bernstein等制定了鑑 定SSU組分的標準(1)定位於核仁；⑵與U3 snoRNA結合；(3)參與18S rRNA的 加工。在脊椎動物，參與5.8和28S rRNA前體的剪切生成過程的是U8 snoRNPs, U8 snoRNPs由U8 snoRNA與相關蛋白結合而成。核糖體生物發生是細胞的一個重要生命過程，與細胞生長和增殖等正常生命活動的維持密切相關，因此受到嚴密的調控。當核糖體生物發生發生異常時，會引起p53 的改變。在正常細胞中p53以低水平無活性形式存在，p53的穩定性與活性調控的主要機 制包括調控p53的亞細胞定位、p53的降解調控和p53的翻譯後修飾。在大多數應激情況 下p53主要通過翻譯後修飾快速活化並維持其穩定性。蛋白酶體-泛素系統是p53主要 的降解方式。Mdm2是p53的E3泛素連接酶，介導p53泛素依賴蛋白酶體依賴的降解。 Mdm2結合p53後，促進p53蛋白在26S的蛋白酶體中降解。Mdm2也是p53下遊的靶基 因產物，p53反饋調節Mdm2的轉錄。Mdm2結合p53的N端轉錄活性區後，p53的轉 錄活性被阻斷，Mdm2的表達水平也會隨之減少。p53與Mdm2的這種相互作用形成了 自身反饋環來維持Mdm2和p53的正常水平。當核糖體RNA的轉錄和加工受到幹擾時， 核糖體蛋白如RPL11，RPL23, RPL5, RPS7等與Mdm2特異結合，使Mdm2對p53的 泛素連接酶活性受到抑制，p53的活性和穩定性增加。這一通路又被稱為RP-Mdm2-p53 信號途徑。在這一通路中起中心作用的是p53蛋白。在應激反應中p53蛋白穩定性增加、水平增高並通過翻譯後修飾及四聚化變成 能結合DNA的活性形式，聚集於細胞核。作為一種特異的轉錄因子p53在細胞核中激 活p2嚴「⑶115』 16和其它一些生長停滯基因產物如GADD45 (growth arrest and DNA damage induction gene 45)的轉錄表達，p21和GADD45能夠引起細胞周期停滯並刺激DNA修 復。如果DNA損傷無法修復，由p53誘導促凋亡相關基因表達使細胞發生程序性死亡。 因此p53通過激活或抑制下遊基因的表達，引起細胞周期停滯、DNA的損傷後修復和/ 或細胞凋亡等。

發明內容
本發明的目的是提供人UTP14a(hUTP14a)蛋白表達抑制劑在製備細胞增殖抑制 劑中的應用。本發明提供了人UTP14a蛋白表達抑制劑的如下應用(1)在製備細胞增殖抑制劑中的應用；(2)在製備促進細胞中p53蛋白表達的產品中的應用；所述p53蛋白如序列表的 序列3所示；所述人UTP14a蛋白的胺基酸序列如序列表的序列1所示。所述人UTP14a蛋白表達抑制劑可為序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序 列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種。所述細胞可為U20S細胞或HeLa細胞。本發明還保護一種細胞增殖抑制劑，為序列表的序列5所示的siRNA、序列表的 序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種。所述細胞可為U20S細胞或HeLa細胞。本發明還保護一種促進細胞中p53蛋白水平升高的產品，為序列表的序列5所示 的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種。所述細胞可為U20S細胞或HeLa細胞。本發明在MCF-7細胞中幹擾hUTP14a後通過流式細胞計數對細胞周期進行了分 析，結果發現hUTP14a表達減少後S期細胞減少，而G2/M的細胞數無明顯變化。該結果提示hUTP14a幹擾後引起的p53增多抑制了細胞周期從Gl期向S期轉變。小亞基加工體(SSU)參與rRNA前體在AO，Al，A2位點的剪切最後形成18S rRNA。在剪切加工過程中，U3 snoRNA與rRNA前體通過鹼基配對介導U3 snoRNPs與 rRNA前體的相互作用。本發明中發現hUTP14a和1A6/DRIM(UTP20)在細胞核仁內存 在共定位，hUTP14a與U3 snoRNA相互作用，是U3 snoRNPs的組分之一，阻斷hUTP14a 蛋白的表達可減少18S rRNA的生成，hUTP14a可與1A6/DRIM (UTP20)結合。以上結 果說明，hUTP14a是SSU加工體組成成分之一，參與18S rRNA的加工。rDNA的轉錄和rRNA前體的加工是核糖體生物發生的關鍵步驟。核糖體生物發 生包括三個重要的步驟①核糖體RNA和核糖體蛋白的協調表達；②核糖體RNA的加 工；③40S和60S核糖體亞基的組裝。40S和60S核糖體亞基從核仁被轉運至核漿，最 終轉運至胞漿並在胞漿中組裝成80S核糖體並為蛋白質的合成提供場所。三個步驟中任 何一個受到幹擾都會引起核仁應激，觸發一些核糖體蛋白(如RPL11，RPL23, RPL5, RPS7等)與Mdm2特異結合，使Mdm2對p53的泛素連接酶活性受到抑制，p53的活性 和穩定性增加。這一通路又被稱為RP_Mdm2-p53信號途徑。p53的半衰期很短，正常 情況下保持在低水平，在細胞內外的應急信號作用下p53能夠被誘導活化而穩定在較高 的蛋白水平。應急情況下p53蛋白水平增高並從胞漿轉移至胞核，在細胞核中主要作為 一種序列特異的轉錄因子發揮功能，激活p21Wafl/ap115』 16和其它一些生長停滯基因產物如 GADD45(GADD45, growth arrest and DNA damage induction gene 45)的轉錄表達，p21 禾口 GADD45能夠引起細胞周期停滯並刺激DNA修復。如果DNA損傷無法修復，由p53誘 導促凋亡相關基因表達啟動細胞發生程序性死亡。因此p53通過激活或抑制下遊基因的 表達，引起細胞周期停滯、DNA的損傷後修復和細胞凋亡等。本發明發現，hUTP14a的 表達下調可引起p53蛋白水平的升高，hUTP14a過表達能引起內源p53水平的降低，在翻 譯途徑被阻斷後，hUTP14a過表達使p53的半衰期縮短。以上結果說明，hUTP14a可促 進p53蛋白的降解。p53蛋白的降解分為蛋白酶體非依賴和蛋白酶體依賴兩種降解途徑。蛋白酶體 非依賴的降解途徑較少見主要指鈣離子依賴的calpain蛋白酶剪切途徑。蛋白酶體依賴的 p53蛋白降解可被蛋白酶體抑制劑阻斷，並且蛋白酶體依賴的p53蛋白降解途徑又根據是 否依賴於泛素分為泛素非依賴的蛋白媒體途徑和泛素依賴的蛋白媒體途徑。當DNA損傷 應激反應時，細胞p53蛋白的水平主要通過泛素依賴的蛋白酶體降解途徑來調控。泛素 依賴的蛋白媒體途徑中E3泛素連接酶起著重要的作用。p53蛋白的E3泛素連接酶最常見 的是HECT-domain，RING-finger兩種類型。HECT-domain型的E3泛素連接酶較常見的 有ARF-bpl、E6AP (HPVE6相關蛋白)。RING-finger類型的E3泛素連接酶有Mdm2、 pirh2、COPU SCF等。Mdm2是p53最重要的特異內源E3連接酶。並且Mdm2依賴 泛素依賴的蛋白酶體途徑是p53蛋白最主要的降解途徑。本發明中，在U20S細胞中轉 染hUTP14a後，用MG132阻斷蛋白酶體對蛋白質降解後對p53蛋白水平進行進行分析。 結果顯示MG132處理後，hUTP14a不再降解p53蛋白，這一結果說明hUTP14a通過蛋 白酶體途徑降解p53蛋白。p53、Flag_hUTP14a質粒共轉染不表達p53蛋白的H1299細 胞，轉染後用抗p53蛋白單克隆抗體進行免疫沉澱實驗，在p53蛋白的免疫沉澱中檢測到 hUTP14a,說明hUTP14a與p53蛋白在細胞內結合。用大腸桿菌中誘導表達的GST_p53
5融合蛋白與體外轉錄翻譯的Flag_hUTP14a蛋白進行的GST pull-down實驗說明hUTP14a
與p53蛋白直接結合。對p53蛋白進行修飾的蛋白與p53存在直接結合。發明人發現
hUTP14a通過242-267和646-771胺基酸序列與p53蛋白的C端和M段結合。 本發明有助於對於細胞增殖和凋亡的研究，對抗癌藥物的開發具有深遠影響。


圖1為人類UTP14a與小鼠和酵母同源物的比較。圖2為Western blot對hUTP14a多克隆抗體的鑑定。圖3為用hUTP14a多克隆抗體檢測UTP14a在多種細胞的細胞核和細胞漿中的表達。圖4為人UTP14a在細胞內的定位。圖5為人UTP14a siRNA通過抑制人UTP14a抑制p53蛋白的降解。圖6為人UTP14a與p53結合。圖7為人UTP14a siRNA抑制細胞增殖。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實 驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說 明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。Hela細胞購自ATCC ，CCL-2 。U20S細胞 購自ATCC ,HTB-96 。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。siRNA寡核苷酸片段由上海吉瑪製藥技術有限公司合成，序列如下siRNA-NC 5，-ACUACCGUUGUUAUAGGUG-3，(序列表的序列 4)；siRNA-A-1 5' -AAUCCGCUAGUUCUUCCUG-3，(序列表的序列 5);siRNA-A-2 5，-UUAAUGAGAACCGGCGUC-3，(序列表的序列 6)；siRNA-A-3 5，-UGUGGAUCCGUUCAAUCU-3，(序列表的序列 7)。10XPBS(pH7.4) 80g NaCl, 14.4g Na2HPO4, 2g KCl, 2Ag KH2PO4,溶於 1000ml去離子水中；10XPBS(pH7.4)稀釋至10倍體積即為PBS。細胞總蛋白裂解液(EBC250) 0.5 % NP-40，250mM NaCl, 50mM Tris-HCl (pH7.4), ImM EDTA, ImM PMSF, ImMNaF, lmMNa3V04, 2yg/ml 亮肽素 (Ieupeptin)，2 μ g/ml 蛋白酶抑制劑(aprotinin)。細胞漿蛋白裂解液IOmMHEPES (pH7.9)，1.5mM MgCl2, IOmM KCl, 0.5mM DTT, 0.5mMPMSF, 0.2mMpefa。細胞核蛋白提取液50mMTris-HCl (pH7.4-8.0)，4 5 OmM NaCl，，
1 % NP-40, 20 % glycerol, 2mM DTT, ImM PMSF, 0.2mM Na3VO4, 5mM β -glycerophosphate。實施例1、hUTP14a蛋白的發現和生物信息學分析在對核仁蛋白1A6/DRIM (Xing X.，Du, X.，Lu, Z.，Ning, T.，Su, X.， Ke, Y.Characterization of the promoter of 1A6/DRIM, a novel cancer-related gene andidentification of its transcriptional activator.Gene 2005, 344 161—169)進 亍研究時，發 明人以1A6/DRIM為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交得到了與1A6/DRIM相互作用的蛋白 hUTP14a (Human U three protein 14a)。hUTP14a蛋白的胺基酸序列如序列表的序列1所示，其編碼基因的核苷酸序列如 序列表的序列2所示。hUTP14a蛋白定位於人類染色體Xq25，cDNA全長2316bp，編碼 長為771個胺基酸殘基的蛋白產物。利用Clustal X軟體將UTP14a蛋白與資料庫所有的 蛋白質序列進行比對，結果顯示UTP14a蛋白與小鼠、酵母Utpl4a同源(比對見圖1)。實施例2、相關重組質粒的製備一、重組質粒pCI-neo-Flag (含有Flag的重組質粒)的製備1、合成 DNA 片段 pCI-Flag_pl3-F 和 DNA 片段 pCI-Flag_pl3-R，將 DNA 片段 pCI-Flag-pl3-F 和 DNA 片段 pCI_Flag-pl3-R 通過復性形成雙鏈 DNA。pCI-Flag-pl3-F 5，-CTAGACCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAG GAATTCAAGCTTGG GCCCGGTACCGCTAGCGC-3 『；pCI-Flag-pl3-R 5' -GGCCGCGCTAGCGGTACCGGGCCCAAGCTTGAATTC CTTGTCATCGTCGTC CTTGTAGTCCATGGTGGT-3 『。2、用限制性內切酶NheI和NotI雙酶切步驟1的雙鏈DNA，回收酶切產物。3、用限制性內切酶NheI和NotI雙酶切質粒pCI-neo (Promega公司)，回收載體骨架。4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒 pCI-neo-Flag。 二、重組質粒pCI-neo-Flag-UTP14a (含有Flag和hUTP14a的重組質粒)的製備1、以HeLa細胞的總RNA為模板，用F-1和R-2316組成的引物對進行RT-PCR 擴增，得到PCR擴增產物(UTP 14a全長cDNA)F-I 5，-ATCG GAATTC CTCGAG atg act gcg aac egg ctt-3，R-2316 5，-ATCG GGTACC-atc tac aga gca ttt ctt cag-3，2、用限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟1的PCR擴增產物，回收酶切產 物。3、用限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切重組質粒pCI-neo-Flag，回收載體骨
^K O4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒 pCI-neo-Flag-UTP 14a。三、重組質粒pCI-neo_UTP14a(含有hUTP14a的重組質粒)的製備1、以HeLa細胞的總RNA為模板，用F-1和R-2316組成的引物對進行RT-PCR 擴增，得到PCR擴增產物(UTP14a全長cDNA)F-I 5，-ATCG GAATTC CTCGAG atg act gcg aac egg ctt-3，
R-2316 5，-ATCG GGTACC-atc tac aga gca ttt ctt cag-3，2、用限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟1的PCR擴增產物，回收酶切產 物。3、用限制性內切酶EcoRI和NotI雙酶切質粒pCI-neo，回收載體骨架。
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4、將步驟2的酶切產物和步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒 pCI-neo-UTP14a。實施例3、hUTP14a多克隆抗體的製備、純化和特異性鑑定一、hUTP14a多克隆抗體的製備、純化利用DNAstar軟體，對UTP14a蛋白的全長一級結構進行分析，選擇具有較高的 親水性和抗原性、同時表面暴露性較強的多肽作為抗原，三條抗原多肽的胺基酸序列如 下Pl DGKNRRKLAERSEASLK ；針對自氨基末端第54-70位胺基酸殘基；P2 QQSERTPNNRPDAPKEKKKKEQM ；針對自氨基末端第 536-558 位胺基酸
殘基；P3 QRNPKRITTRHKKQLKKC ；針對自氨基末端第751-768位胺基酸殘基。分別將上述三條多肽與血藍蛋白(KLH)偶聯，得到三種偶聯物；將三種偶聯物 等摩爾混合後免疫紐西蘭兔(購自北京大學醫學部動物中心)。三種偶聯物混合(均為lOOug)，用PBS稀釋至Iml後與等量的弗氏佐劑充 分混合，進行初次免疫(於兩足踱部各0.25ml進行皮下注射，其餘0.5ml後背部多點 皮下注射)；之後每2周加強免疫1次，採用使用同等劑量的多肽與等體積的不完全 弗氏佐劑混合後全部後背皮下多點注射(Manabu Nakayama，Reiko Kikuno and Osamu Ohara.Protein-Protein Interactions Between Large Proteins Two-Hybrid Screening Using a Functionally Classified Library Composed of Long cDNAs.Genome Res.，2002, 12 1773-1784)。第2次加強免疫後14天取兔耳源靜脈血樣通過ELISA檢測效價，至效價 達1 105(體積比)以上後將免疫兔處死，心臟取血獲得血清。將血清用PBS稀釋後進行親和層析，親和層析的具體參數親和層析柱是將三 條抗原多肽(PI、P2和P3)偶聯的Sepharose 4B親和層析柱上得到的；將血清上樣於親和 層析柱，4°C孵育過夜；PBS衝洗柱料後使用pH2.4、O.lmol/L甘氨酸緩衝液洗脫抗體， 收集洗脫液；將洗脫液用pH2.4的0.1mol/L的Tris-HCl (pH9.0)中和並透析至PBS中， 獲得抗體I(Abl)。抗體1作為hUTP14a多克隆抗體，進行後續試驗。用BCA蛋白定 量試劑盒(美國Pierce公司)檢測抗體1的濃度。二、hUTP14a多克隆抗體的特異性鑑定為鑑定hUTP14a多克隆抗體的特異性，在Hela細胞中分別轉染重組質粒 pCI-neo-UTP14a 和重組質粒 pCI-neo_Flag-UTP14a，同時用重組質粒 pCI-neo-Flag 作為 對照。轉染24小時後收取細胞核蛋白，經SDS-PAGE電泳分離後轉至PVDF膜，用抗 Flag抗體M2 (Sigma, F3165)和hUTP14a多克隆抗體進行Western blot分析。如圖2A所 示，Flag_hUTP14a蛋白由於Flag的存在比內源的hUTP14a略大。hUTP14a的多克隆抗 體可以同時識別外源的hUTP14a蛋白、Flag_hUTP14a蛋白和內源的hUTP14a蛋白。抗 Flag抗體M2僅特異識別外源表達的Flag-hUTP14a(圖2B)。這一實驗結果表明製備 的hUTP14a多克隆抗體可以特異的識別hUTP14a蛋白，同時正確的克隆了編碼hUTP14a 的質粒。實施例4、UTP14a在多種細胞系的表達及在細胞內的定位為明確UTP14a在多種細胞系的表達情況，提取十二種細胞系的細胞核蛋白和細胞漿蛋白，經SDS-PAGE電泳分離、轉膜後，分別用Topoimerase I多克隆抗體、Rho A單克隆抗體和hUTP14a多克隆抗體進行Western blot分析。如圖3所示細胞核蛋白 Topoimerase I僅在細胞核蛋白中檢測到，而細胞漿蛋白Rho A僅在細胞漿蛋白中檢測到， 說明細胞核和細胞漿之間沒有互相汙染；hUTP14a在這十二種細胞都有表達且只存在於 細胞核蛋白中。這說明hUTP14a在各細胞系廣泛表達，且主要定位於細胞核。利用抗hUTP14a多克隆抗體和抗1A6/DRIM單克隆抗體進行雙色螢光免疫染 色，在雷射共聚焦顯微鏡下進行觀察。1A6/DRIM顯示為紅色，hUTP14a顯示為綠色， 同時用DAPI染核，為藍色。圖4A顯示hUTP14a與1A6/DRIM共同定位於細胞核仁內。為進一步驗證hUTP14a在細胞內的定位，將GFP-UTPHa轉染細胞，DAPI染核 後螢光顯微鏡下觀察，圖4B顯示GFP-UTPHa與內源UTP14a呈現同樣的定位。為進一 步確定正確克隆了編碼hUTP14a的質粒，將重組質粒pCI-neo-Flag-UTP14a轉染Hela細 胞，轉染24小時後固定，用兔抗核仁素(micleolin)抗體和鼠抗Flag抗體M2進行雙色熒 光免疫染色，在雷射共聚焦顯微鏡下進行觀察。核仁素用FITC標記的羊抗兔IgG檢測， 顯示為綠色，Flag_hUTP14a用TRITC標記的羊抗鼠IgG檢測，顯示為紅色；用DAPI染 核，為藍色。圖4C顯示，Flag-hUTP14a(紅色)與核仁素(綠色)在細胞核仁內存在共 定位。實施例5、UTP14a的表達引起p53蛋白通過蛋白酶體降解一、抑制hUTP14a的表達引起細胞內p53的水平升高( 一 ) siRNA 轉染細胞將siRNA (siRNA-A-1、siRNA-A-2、siRNA-A-3 或 siRNA-NC)轉染 HeLa 細
胞，具體步驟如下1、將生長狀態良好的細胞接種至35cm2培養瓶中，至細胞密度達80%左右。2、將siRNA溶於140ul DEPC水中，使終濃度約為20uM ；然後95°C4min， 70 °C IOmin,室溫放置30min使其復性。3、在無血清培養基中，通過脂質體(Lipofectamine 2000，購自Invitrogen公 司)將siRNA轉染細胞，在37°C、5% CO2培養箱中培養。4、6h後，換上含有10% (體積百分含量)FCS的培養基。( 二)鑑定試驗轉染細胞72小時後，通過Western blot分析hUTP14a的表達情況和p53蛋白水平。1、分析hUTP14a的表達情況(1)提取細胞核蛋白①細胞用冷的PBS洗兩次，再加Iml冷的PBS刮取細胞入1.5ml EP管， 12,OOOrpm離心15秒，取沉澱。②沉澱中加入約3倍體積的細胞漿蛋白裂解液重懸細胞，12,OOOrpm振蕩10秒 鍾，冰上放置10分鐘。③12,OOOrpm離心15秒，取沉澱(上清為細胞漿提取物)。④向沉澱中加入約3倍體積的細胞核蛋白提取液重懸細胞，2,OOOrpm振蕩10秒 鍾，冰上放置15分鐘。
⑤4°C、12,OOOrpm離心30分鐘，收集上清，即為細胞核提取物。(2)檢測細胞核蛋白中hUTP14a的表達情況將細胞核提取物進行8 % SDS-PAGE凝膠電泳，然後進行Western Blot (以Actin
為上樣量對照)，一抗為實施例3製備的hUTP14a多克隆抗體(抗體1)。結果見圖5A，在上樣量基本一致的情況下，轉染siRNA-A-1、siRNA_A_2和 siRNA-A-3的細胞的細胞核內hUTP14a表達被沉默。2、分析細胞中p53蛋白的水平(1)提取細胞總蛋白①細胞用冷的PBS洗兩次，再加Iml冷的PBS刮取細胞入1.5ml EP管， 12,OOOrpm離心15秒，取沉澱。②沉澱中加入Iml細胞總蛋白裂解液重懸細胞。③冰上間歇超聲，45HZ、每次15秒，重複三次。④4°C、12,OOOrpm離心30分鐘，收集上清，即為細胞總蛋白。(2)檢測細胞中p53的水平將細胞總蛋白進行8 % SDS-PAGE凝膠電泳，然後進行Western Blot (以Actin為
上樣量對照)，一抗為鼠抗p53單克隆抗體(購自北京中杉金橋公司)。結果見圖5A，在上樣量基本一致的情況下，轉染siRNA-A-1、siRNA_A_2和 siRNA-A-3的細胞內p53含量均高於轉染siRNA_NC的細胞。結果表明，幹擾內源hUTP14a的表達後，p53蛋白的水平升高。二、過表達hUTP14a引起內源p53蛋白水平降低(一)質粒轉染細胞用重組質粒pCI-neo-Flag_UTP14a轉染HeLa細胞，具體步驟如下①在5X7cm培養瓶中種上細胞(1父106個細胞/瓶)，培養24h，使細胞達到
90%匯合。②將不同劑量的質粒(0 μ g、lug, 2yg、41^或61^)溶於200^1無血清的培
養基中。③將10 μ 1脂質體(Lipofectamine 2000)溶於200 μ 1無血清的培養基中。④將步驟②和步驟③的培養基混合，室溫放置20min。⑤將步驟①得到的待轉染的細胞換上4ml無血清的培養基。⑥將步驟④的混合物加入步驟⑤的培養基中，混勻，在37°C、5%032培養箱中培養。⑦6h後，換上含有10% (體積百分含量)FCS的培養基。(二)鑑定試驗轉染細胞24小時後，通過Western blot分析hUTP14a的表達情況和p53蛋白水平。1、分析hUTP14a的表達情況方法同步驟一的(二)的1。結果見圖5B，在上樣量基本一致的情況下，隨著質粒轉染劑量的增加，細胞核 內hUTP14a表達也增加。
2、分析細胞中p53蛋白的水平方法同步驟一的(二)的2。結果見圖5B，在上樣量基本一致的情況下，隨著質粒的轉染劑量的增加，細胞 內p53蛋白含量降低。結果表明，hUTP14a過表達導致p53蛋白水平的下降。三、細胞內p53蛋白的半衰期測定用重組質粒pCI-neo-Flag_UTP14a或重組質粒pCI-neo-Flag轉染U20S細胞，具
體步驟同步驟二的(一)，轉染劑量為4 μ g。轉染細胞16h後，加入放線菌酮(cycloheximide)，使其濃度為10 μ g/ml，以 阻斷蛋白質翻譯；分別在 Omin、5min、lOmin、15min、20min、30min、40min 收取細
胞，提取細胞總蛋白，對p53蛋白、hUTP14a蛋白和Flag_hUTP14a蛋白的表達量進行 分析。p53蛋白表達量分析方法同步驟一的(二)的2。hUTP14a蛋白表達量分析和 Flag-hUTP14a蛋白表達量分析方法同步驟一的(二)的1。結果見圖5C，在上樣量基本一致的情況下，轉染重組質粒pCI-neo-Flag的細胞 中p53蛋白的半衰期為20分鐘，轉染重組質粒pCI-neo-Flag-UTP14a的細胞中p53蛋白 的半衰期為10分鐘。結果表明，hUTP14a可以促進p53蛋白降解。四、機理分析p53的降解分為蛋白酶體非依賴和蛋白酶體依賴兩種降解途徑。很多原癌基因產 物與p53蛋白結合後通過蛋白酶體導致p53蛋白的降解，這種降解可被蛋白酶抑制劑所阻 斷。為探討hUTP14a引起的p53蛋白的降解是否通過蛋白酶體，在U20S細胞內轉染重 組質粒pCI-neo-Flag-UTP14a，用重組質粒pCI-neo-Flag作對照。轉染16h後，加蛋白 酶體阻斷劑MG132 (終濃度為10 μ Μ)後繼續培養4小時，同時溶劑DMSO作為對照， 收取細胞總蛋白對ρ53的水平進行分析。結果見圖5D。結果表明，用溶劑DMSO處理 的細胞內ρ53蛋白被hUTP14a降解，而MG132處理的細胞內hUTP14a不能再降解p53蛋 白。說明MG132能阻斷UTP14a引起的p53蛋白降解，也就是說UTP14a引起的p53蛋 白降解是依賴於蛋白酶體的。實施例6、UTP14a在細胞內和細胞外結合p53蛋白為研究hUTP14a與p53之間是否直接結合，用大腸桿菌中表達的GST和 GST-p53融合蛋白與體外轉錄翻譯的Flag_hUTP14a蛋白進行GST pull-down實驗。用 hUTP14a多克隆抗體進行Western blot檢測。結果顯示(圖6A) hUTP14a與p53直接
結合p53蛋白含有393個胺基酸殘基、分為四個主要的功能結構域，從N端到C 端它們依次是轉錄活化區(胺基酸1-97，p53-N)、序列特異的DNA結合區(胺基酸 98-292，p53-M)、含有寡聚化功能域(胺基酸324-355)和負性調節區(胺基酸363-393) 的C末端(胺基酸293-393，p53-C)。為了明確p53與hUTP14a結合的胺基酸序列， 用大腸桿菌表達的GST_p53及3個截斷體(圖6B下面的示意圖所示)GST_p53_N， GST-p53-M, GST-P53-C 與體外轉錄翻譯的 Flag_hUTP14a 蛋白進行 GST pull-down 實 驗，然後用hUTP14a抗體進行Western blot檢測。結果顯示(圖6B)，p53通過其aa 98-292 (M 段)和 aa 293-393 (C 端)與 hUTP14a 結合，而 aa 1-97 (N 端)不與 hUTP14a？口口。為研究hUTP14a與p53結合的最小結構，構建了 GST_hUTP14a系列截斷突變體 (圖 6C) Del-I aa 1-267，Del-2 aa 268-645，DeHB: aa 646-771，在大腸桿菌中表 達這些截斷體的GST融合蛋白，與體外翻譯的p53蛋白進行GST pull-down實驗。結果 (圖6C)顯示，aa 1-267和aa 646-771與p53結合，而aa268_645不與p53結合。提示 hUTP14a通過其N端和C端與p53結合。同時將3 個 hUTP14a 的 GFP_hUTP14a 截斷體 DeHl、Del-2 和 De:i-3 轉染至 H1299細胞，在雷射共聚焦顯微鏡下觀察GFP蛋白的定位，圖6D所示，與p53結合的 Del-I和Del-3是定位在細胞核內。為驗證hUTP14a與p53在細胞內的相互作用，將p53、Flag_hUTP14a質粒轉 染H1299細胞，轉染24h後提取細胞總蛋白，用抗p53單克隆抗體進行免疫沉澱，經 SDS-PAGE分離，用抗p53抗體和抗UTP14a多克隆抗體對沉澱下來的蛋白複合物進行 Western blot檢測，結果顯示(圖6E)用抗hUTP14a多克隆抗體可以從p53抗體沉澱下來 的蛋白複合物物中檢測出hUTP14a和Flag_hUTP14a。結果說明，hUTP14a在細胞內與 p53結合。實施例7、hUTP14a表達水平降低後抑制細胞增殖將siRNA(siRNA-A_l、siRNA_A_2、siRNA_A_3 或 siRNA-NC)轉染 U20S 細
胞，方法同實施例5的步驟一的(一)。轉染細胞72小時後分別進行細胞克隆形成實驗 和增殖曲線製作。細胞克隆形成實驗，步驟如下將500個細胞種於6孔板中，培養10天後，通 過乙醇/冰醋酸(3體積份乙醇和1體積份冰醋酸混合)固定細胞後，經蘇木素染色並拍 照，結果見圖7A。結果表明，轉染siRNA-A-1、siRNA_A_2和siRNA_A_3後，細胞增 殖明顯受到抑制。製作增殖曲線製作方法如下將IX IO4個細胞/孔種於96孔板，分別在不同時 間(24小時、48小時、72小時和96小時)加入CCK-8 (購自Dojindo公司)10 μ 1，繼續 培養4小時，測450nm的吸光值，每次實驗各測2個孔，將3次實驗的結果進行統計，用 每點的平均值作增殖曲線，結果見圖7B。轉染了 siRNA-A-1、siRNA_A_2和siRNA_A_3 後，細胞增殖明顯受到抑制。
權利要求
1.人UTP14a蛋白表達抑制劑在製備細胞增殖抑制劑中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述人UTP14a蛋白的胺基酸序列如序列 表的序列1所示。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特徵在於所述人UTP14a蛋白表達抑制劑為 序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的 siRNA中的至少一種；所述細胞為U20S細胞或HeLa細胞。
4.人UTP14a蛋白表達抑制劑在製備促進細胞中p53蛋白水平升高的產品中的應用； 所述p53蛋白如序列表的序列3所示。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於所述人UTP14a蛋白的胺基酸序列如序列 表的序列1所示。
6.如權利要求4或5所述的應用，其特徵在於所述人UTP14a蛋白表達抑制劑為 序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的 siRNA中的至少一種；所述細胞為U20S細胞或HeLa細胞。
7.—種細胞增殖抑制劑，為序列表的序列5所示的siRNA、序列表的序列6所示的 siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種。
8.如權利要求7所述的細胞增殖抑制劑，其特徵在於所述細胞為U20S細胞或 HeLa細胞。
9.一種促進細胞中p53蛋白水平升高的產品，為序列表的序列5所示的siRNA、序列 表的序列6所示的siRNA和序列表的序列7所示的siRNA中的至少一種；所述p53蛋白 如序列表的序列3所示。
10.如權利要求9所述的促進細胞中p53蛋白水平升高的產品，其特徵在於所述細 胞為U20S細胞或HeLa細胞。
全文摘要
本發明公開了人UTP14a蛋白表達抑制劑在製備細胞增殖抑制劑中的應用。p53蛋白通過激活或抑制下遊基因的表達，引起細胞周期停滯、DNA的損傷後修復和細胞凋亡等。本發明發現人UTP14a蛋白的表達下調可引起p53蛋白水平的升高，即人UTP14a蛋白表達抑制劑可以促進細胞中p53蛋白水平升高，從而抑制細胞增殖。本發明有助於對於細胞增殖和凋亡的研究，對抗癌藥物的開發具有深遠影響。
文檔編號A61K31/713GK102008725SQ20101053992
公開日2011年4月13日 申請日期2010年11月9日 優先權日2010年11月9日
發明者杜曉娟, 柯楊, 胡樂林 申請人:北京大學