雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝的製作方法

2023-08-03 11:08:36 4

專利名稱：雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物酶製劑領域，特別涉及一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表 達發酵工藝。
背景技術：
漆酶是一種含銅的多酚氧化酶(p-diphenol oxidase, EC 1.10.3.2)，是木質素降解酶系的主 要成分之一。自然界中諸如雜色雲芝Cbr/o^^ ^i^ico7or等白腐菌均能分泌漆酶。白腐 菌是目前最重要的漆酶產生菌，但白腐菌生長周期長、酶活低，不利於工業化生產。目前， 國內主要圍繞如何提高白腐菌漆酶的產量而開展研究，採用菌種篩選和改造，培養方式及 培養條件優化來達到利用微生物生產漆酶的目的。
近年來，有關漆酶的研究越來越受到國際上的重視，由於漆酶能降解木質素，而且能 降解多種有毒化合物，所以漆酶在食品工業、造紙工業、保護環境及其他領域具有很大的 研究價值和應用潛力。因此研究漆酶的異源表達具有重要的現實意義。隨著分子生物學技 術的發展， 一些漆酶基因已經從木質素降解菌中隆並進行了性質分析，為實現漆酶基因 的異源表達奠定了堅實的理論基礎。19卯年Kojima首次將Con7ow Wa"/m的漆酶基因進 行了克隆並在酉良酒酵母Sacc/wra附;;cey cewv她e中表達(Kojima Y， TsukudaY， KawaiY." a/. Cloning, sequence analysis, and expression of ligninolytic phenoloxidase genes of the white-rot basidiomycete Co〃'o/ws /2frsw加[J]. Journal of Biological Chemistry, 1990， 265: 15224-15230 (白腐菌CoWo/m /z/^Wm漆酶基因的克隆，序列分析和表達，生物化學雜誌))。 2003年Liu等利用P/c/z/apastor^表達了 Fo/we "g"oras的漆酶(Liu W， Chao Y， Liu S. a/. Molecular cloning and characterization of a laccase gene from the basidiomycete Fowe //gwoyws and expression in ZVcW"Applied Microbiology and Biotechnology. 2003， 63: 174-181 (白腐菌Fowe //gmmAS漆酶基因的特性和分子克隆及在巴斯德畢赤酵母戶/c/z/fl /7"ston's中 表達，應用微生物和生物技術))。
白腐菌漆酶為胞外蛋白，它是由一系列同工酶組成的，典型的分子量在60-80kDa。雜 色雲芝是一種典型的木材白腐菌，對木質素的降解能力較強。雜色雲芝在液體培養基中產 生的漆酶同工酶主要是Lccl 。利用甲醇畢赤酵母(戶/c/z/a附"/^"0//0^對雜色雲芝漆酶Lccl 進行了異源表達構建基因工程菌己有報導(郭梅，白東清，蒲軍，杜連祥，路福平.去自身 信號肽漆酶基因的克隆及轉化甲醇畢赤酵母，2005年全國工業微生物年會論文，200'5.4: 66-70。)(郭梅，蒲軍，杜連祥，路福平，白東清.雜色雲芝漆酶基因(Lccl)的克隆及 在甲醇畢赤酵母中的表達，菌物學報，2005， 24 (2): 221-226)。
甲醇畢赤酵母(i^/z/awe^^o/ZcY^PMADlG,是一種新型外源基因表達系統，異源蛋 白的表達僅需少量甲醇作為誘導劑。甲醇畢赤酵母PMAD16高密度發酵時培養基的組成以及發酵條件直接影響菌體的生長和外源基因的表達。PMAD16可以甲醇為唯一碳源生長， 因此利用甲醇畢赤酵母表達外源蛋白時，往往需要生長培養基與誘導表達培養基分丌，通 常採用傳統轉換培養基誘導法，先用葡萄糖為碳源的BMDY培養基增殖酵母，再離心收集 菌體，然後重懸在含甲醇的BMMY培養基中誘導外源基因的表達，這種表達方法本研究也 有報導，(郭梅，路福平，蒲軍，白東清，杜連祥.雜色雲芝漆酶基因在甲醇畢赤酵母中表 達條件研究，食品研究與開發，2006， 27 (4): 82-84)，但這種方式操作繁瑣，浪費培養基， 同時增加了染菌機會，尤其在用發酵罐大量培養酵母生產外源蛋白時極為不利，不適宜工 業化生產。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異
源表達發酵工藝，本發明的技術方案概述如下
雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，包括如下歩驟
(1) 準備菌株和培養基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-Zcc7;
發酵培養基15 30g/L蛋白腖，5 30g/L葡萄糖，5 20g/L酵母粉，10 25g/L酵母氮 源，3 X 10-4~7X l(T4g/L生物素，0.1 0.6mmol/L的Cu2+，用pH為4.0~7.0的濃度為100mmol/L 的磷酸鹽緩衝液配製；
(2) 基因工程菌生長培養
將活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄"/接種在經滅菌的所述發酵培養基 中，在溫度25 3rC下，振蕩或攪拌培養15-36h;
(3) 基因工程菌的誘導培養
間歇或流加含3X1(T4~7X10—4g/L生物素的甲醇進行誘導培養，使甲醇終體積濃度為 0.2~2.0%，溫度15 30。C，誘導時間96 216h，得到雜色雲芝重組漆酶。
優選的是所述的發酵培養基為20 25g/L蛋白腖，10 20g/L葡萄糖，10 15g/L酵母 粉，15~23g/L酵母氮源，4xlO-4 6X10-4g/L生物素，0.2~0.4mmol/L的Cu2+，用pH為5~7 的濃度為10Ommol/L的磷酸鹽緩衝液配製。
所述的012+為硫酸銅或氯化銅中的離子。
所述歩驟(2)為將活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-i:cc7接種在經滅菌 的所述發酵培養基中，在溫度28 3(TC下，振蕩或攪拌培養20-30h;
所述步驟(3)為間歇或流加含5X10^6X10—、/L生物素的甲醇進行誘導培養，使 甲醇終體積濃度為0.5~1.3%，溫度18 25。C，誘導時間108~156h。
本發明的一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，不需更換培養基， 進行直接誘導培養。確定了發酵工藝參數，建立了一種操作簡便、工藝簡單、汙染率低、 成本低、發酵周期短、漆酶表達量高的發酵工藝。本發明為漆酶規模化生產奠定了基礎。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一歩說明。實施例1
一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，包括如下歩驟
(1) 準備菌株和培養基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-Zc";由天津農學院的實驗室構建 並保存(附有天津農學院提供的證明)；
發酵培養基20g/L蛋白腖，10g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，13.4g/L酵母氮源(YNB)， 4xl(T4g/L生物素，0.2mmol/L的Cu2+ (硫酸銅)，用pH為6.5的100mmol/L的磷酸鹽緩衝 液配製；
(2) 基因工程菌生長培養 從固體斜面上取少量活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cc7接種在經滅菌
的所述發酵培養基中，裝液量10%，培養溫度3(TC，振蕩培養20h; G)基因工程菌的誘導培養
間歇加含5X1(TVL生物素的甲醇進行誘導培養，每隔24h加一次，使甲醇終體積濃 度為0.8%,誘導培養溫度2(TC，誘導時間108h，過濾分離得到雜色雲芝重組漆酶(粗製 劑)。再經分離與純化得到純化雜色雲芝重組漆酶。
本發明的一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，使發酵液中漆酶酶 活可達4500U/L (丁香醛連氮法)。
雜色雲芝重組漆酶粗製劑，可直接應用於染料脫色、降解有毒汙染物、紙槳漂白等， 也可再進行分離純化得到純化漆酶，擴大漆酶的應用範圍。 漆酶活力測定
按照Galliano的測定方法進行(Galliano H， Gas Q Seris J L. Lignin degradation by 及/g/f/o/7o/"M51 Zigwoswi1 involves synergistic action of two enzyme: MnP and Laccase. Enzyme and Microbial Technology, 1991， 13: 478~482 (及/gitfo/ onw Z/gmwMS猛過氧4七 物酶和漆酶降解木質素的協作增效作用，酶和微生物技術))。3.5mL反應混合液中， 含0.2mL0.5mmol/L的丁香醛連氮液，1.5mL 50mmol/L磷酸緩衝液(pH5.8)和1.8mL 適當稀釋的酶液，25'C反應5min後，於525nm處測定吸光度。 一個酶活單位定義為 在25"條件下每分鐘使1 ix mol的底物轉化所需的酶量。(丁香醛連氮的摩爾消光係數 s 525=65000M"1. cm—')。
實施例2
一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，包括如下步驟 (1)準備菌株和培養基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETocA-丄c";由天津農學院的實驗室構建 並保存；
發酵培養基15g/L蛋白腖，30g/L葡萄糖，5g/L酵母粉，15g/L酵母氮源(YNB)， 3xlCT4 g/L生物素，0.2mmol/L的Cu2+ (氯化銅)，用pH為4.0的100mmol/L的磷酸鹽緩衝液配 制；(2)基因工程菌生長培養
從固體斜面上取少量活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cc7接種在經滅菌 的所述發酵培養基中，裝液量40%，培養溫度28'C、攪拌培養24h; G)基因工程菌的誘導培養
流加含6Xl(^g/L生物素的甲醇進行誘導培養，使甲醇終體積濃度為0.2%，誘導培養 溫度15°C，誘導時間216h，過濾分離得到雜色雲芝重組漆酶(粗製劑)。再經分離與純化 得到純化雜色雲芝重組漆酶。 實施例3
一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，包括如下步驟
(1) 準備菌株和培養基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETctA-丄cc7;由天津農學院的實驗室構建 並保存；
發酵培養基25g/L蛋白腖，15g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，10g/L酵母氮源(YNB)， 6xl(T4g/L生物素，0.4mmol/L的Cu2+ (硫酸銅)，用pH為7.0的100mmol/L的磷酸鹽緩衝 液配製；
(2) 基因工程菌生長培養 從固體斜面上取少量活化菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cc7接種在經滅菌的
所述發酵培養基中，裝液量30%，培養溫度31"C，攪拌培養15h;
(3) 基因工程菌詢誘導培養 間歇加含3Xl(^g/L生物素的甲醇進行誘導培養，每隔24h加一次，使甲醇終體積濃
度為1.3%，誘導培養溫度30°C，誘導時間96h，過濾分離得到雜色雲芝重組漆酶(粗製劑)。
再經分離與純化得到純化雜色雲芝重組漆酶。
實施例4
一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，包括如下步驟
(1) 準備菌株和培養基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄c";由天津農學院的實驗室構建 並保存；
發酵培養基30g/L蛋白腖，5g/L葡萄糖，15g/L酵母粉，25g/L酵母氮源(YNB)， 7xl0"4 g/L生物素，0.1mmol/L的Cu2+ (氯化銅)，用pH為7.0的100mmol/L的磷酸鹽緩衝液配 制；
(2) 基因工程菌生長培養 從固體斜面上取少量活化菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄c"接種在經滅菌的
所述發酵培養基中，裝液量20%，培養溫度25'C，攪拌培養36h;
(3) 基因工程菌的誘導培養 流加7X1(TVL生物素的甲醇進行誘導培養，使甲醇終體積濃度為2.0%，誘導培養溫
度18°C，誘導時間156h，過濾分離得到雜色雲芝重組漆酶(粗製劑)。再經分離與純化得到純化雜色雲芝重組漆酶。 實施例5
一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，包括如下步驟
(1) 準備菌株和培養基
菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-Zcc7;由本研究天津農學院的實驗 室並保存；
, 發酵培養基22g/L蛋白腖，20g/L葡萄糖，20g/L酵母粉，23g/L酵母氮源(YNB)， 5xlO'4g/L生物素，0.6mmol/L的Cu2+ (氯化銅)，用pH為5.0的10Ommol/L的磷酸鹽緩衝 液配製；
(2) 基因工程菌生長培養 從固體斜面上取少量活化菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETccA-Zc"接種在經滅菌的
所述發酵培養基中，裝液量20%，培養溫度25'C，攪拌培養30h;
(3) 基因工程菌的誘導培養 流加7X10— /L生物素的甲醇進行誘導培養，使甲醇終體積濃度為0.5%，誘導培養溫
度25。C，誘導時間156h，過濾分離得到雜色雲芝重組漆酶(粗製劑)。再經分離與純化得 到純化雜色雲芝重組漆酶。
權利要求
1. 雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，其特徵是包括如下步驟(1)準備菌株和培養基菌株基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETαA-Lcc1；發酵培養基15～30g/L蛋白腖，5～30g/L葡萄糖，5～20g/L酵母粉，10～25g/L酵母氮源，3×10-4～7×10-4g/L生物素，0.1～0.6mmol/L的Cu2+，用pH為4.0～7.0的濃度為100mmol/L的磷酸鹽緩衝液配製；(2)基因工程菌生長培養將活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETαA-Lcc1接種在經滅菌的所述發酵培養基中，在溫度25～31℃下，振蕩或攪拌培養15-36h；(3)基因工程菌的誘導培養間歇或流加含3×10-4～7×10-4g/L生物素的甲醇進行誘導培養，使甲醇終體積濃度為0.2～2.0％，溫度15～30℃，誘導時間96～216h，得到雜色雲芝重組漆酶。
2. 根據權利要求l所述的雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，其特徵在於 所述的發酵培養基為20 25g/L蛋白腖，10 20g/L葡萄糖，10~15g/L酵母粉，15~23g/L酵 母氮源，4xlO-4 6X l(T4g/L生物素，0.2~0.4mmol/L的Cu2+，用pH為5~7的濃度為100mmol/L 的磷酸鹽緩衝液配製。
3. 根據權利要求1或2所述的雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，其特徵 在於所述的Cu^為硫酸銅或氯化銅中的離子。
4. 根據權利要求l所述的雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，其特徵在於 所述步驟(2)為將活化的菌種甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETaA-丄cd接種在經滅菌的所 述發酵培養基中，在溫度28 30'C下，振蕩或攪拌培養20-30h;
5. 根據權利要求l所述的雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，其特徵在於 所述歩驟(3)為間歇或流加含5X10、6X104g/L生物素的甲醇進行誘導培養，使甲醇 終體積濃度為0.5~1.3%，溫度18 25。C，誘導時間108 156h。
全文摘要
本發明公開了一種雜色雲芝漆酶在甲醇畢赤酵母中異源表達發酵工藝，步驟為(1)準備基因工程菌甲醇畢赤酵母PMAD16/pMETαA-Lcc1和發酵培養基；(2)將活化的菌株接種在經滅菌的發酵培養基中，在25～31℃，振蕩或攪拌培養15-36h；(3)間歇或流加含生物素的甲醇進行誘導培養，使甲醇終體積濃度為0.2～2.0％，溫度15～30℃，誘導時間96～216h，得到雜色雲芝重組漆酶，本發明的工藝，不需更換培養基，進行直接誘導培養，確定了發酵工藝參數，建立了一種操作簡便、汙染率低、成本低、發酵周期短、漆酶表達量高的發酵工藝。
文檔編號C12N9/04GK101544964SQ20081005252
公開日2009年9月30日 申請日期2008年3月26日 優先權日2008年3月26日
發明者李託平, 鵬 梁, 娜 王, 白東清, 軍 蒲, 路福平, 梅 郭 申請人:天津農學院