鈉(離子)診斷/測定試劑盒及鈉(離子)濃度測定方法

2023-08-04 06:04:51 1

專利名稱：鈉(離子)診斷/測定試劑盒及鈉(離子)濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種鈉(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鈉 (離子)濃度的方法，屬於醫學/食品檢驗測定技術領域。
背景技術：
血清中鈉離子含量(簡稱"血鈉")在臨床上有著非常重要的意義，醫學
上有三個決定水平，依次為水平1——115mmo1/1，水平2——135mmo1/1， 水平3——150mmo1/1。當患者血鈉濃度等於或低於水平1時，可出現神志不 清、疲勞、噁心、頭痛、嘔吐和厭食等症狀，表明機體內水的比例大於鈉， 應採用相應治療措施；當血鈉濃度低於水平2時，應査找低鈉血症的原因， 進一步測定血清滲透壓、血鉀並進行尿液分析，以確定診斷；當血鈉濃度高 於水平3時，應檢查其它試驗項目，尋找導致高鈉血症的原因。
現有技術中測定鈉離子含量的常用方法有火焰光度計法、離子選擇電 極法、化學測定法、原子分光光度法、酶動力學法等。
火焰光度計法——1950年開始使用並一直沿用至今，可檢測血清、尿液、 腦脊液及胸腹水中的Na+和K+，是一種發射光譜分析法，其結果準確可靠， 廣為臨床採用。該方法分為內標準法和外標準法兩種。外標準法操作誤差較 大， 一般不採用。現在主要使用內部標準法，即向標本及標準液中加進相同 濃度的內部標準元素鋰或銫進行測定，操作時，將含鋰的溶液作為稀釋液， 同時測定K+、 Na+和Li+的濃度，以標本與標準液的Na+/Li+與K+/Li+比值， 計算Na+、 K+濃度。由於血清稀釋倍數大，血清蛋白質粘性的影響幾乎可以 忽略不計。
離子選擇電極法一一簡稱ISE法，是採用靈敏的特定專用電極，在專用 儀器上進行血清和尿等體液中的K+、 Na+的測定，因標本用量少，快速準確，
4幾乎有取代其它方法的趨勢。其測定原理是，用離子選擇電極與參比電極組 合起來，浸泡在待測標本溶液中進行檢測。目前已有的電極種類有①玻璃 膜電極，感應材料為玻璃薄膜，有PH電極、K+電極和Na+電極；②固相膜電 極，由難溶性金屬物質加壓成型，以固體膜或單日膜作為感應膜，有C卜電極
和F-電極；(D液態膜電極，將環氧樹脂或內裝聚氯乙稀作為感應膜，有Ca2— 電極；④用纈氨黴素膜製成的K+電極。上述電極均有一定的使用壽命，因為 電極使用-段時間後就會自動老化，有效期長短不一。目前離子選擇電極法 應用也較為普遍，但是電極成本昂貴。
此外，化學測定法主要利用復環王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，作為離 子載體進行測定。由於大環結構內有空穴，分子內部的氧原子有未共用電子 對可與金屬離子結合，根據空穴大小，可選擇性結合不同直徑的金屬離子， 從而達到測出離子濃度的目的；原子分光光度法也可用於檢測血清中K+、 Na + ，但操作繁雜，誤差較大，不及火焰光度法簡便。
酶法測定鈉離子含量的方法，與火焰光度計法或離子選擇電極法都有較 好的一致性，這種方法抗幹擾性強、穩定性好，但用生化分析儀不能同時測 定鈉離子和鉀離子各自的含量，導致這種方法不能得到推廣應用。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環擴增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯 法(Couple Reaction)技術，計量/連續監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鈉(離子)濃度的方法，同時，本 發明還將給出用以實現該方法的鈉(離子)診斷/測定試劑盒，採用該試劑不 僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行鈉(離子)濃度 測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明鈉(離子)濃度測定方法原理如下
乳糖+水 (3-半乳糖苷酶/>^+葡萄糖+半乳糖葡萄糖+葡萄糖1-磷酸麥芽糖磷酸化酶麥牙糖+磷酸根 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油酸-l,3-雙磷酸+還原型輔酶
這種方法應用需要鈉離子激活的卩-半乳糖苷酶((3-galactosidase ; EC 3.2丄23)具有乳糖酶(lactase ; EC3.2丄108)的特性，酶(偶)聯麥芽糖磷酸 化酶(Disaccharide phosphorylases; EC 2.4.1.8)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶《足反應速率比色 法。在鈉離子的激活下，P-半乳糖苷酶酶解乳糖反應產生葡萄糖，再通過(偶) 聯合麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nrn 處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定 還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的 速度，可以測算鈉(離子)的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明鈉(離子)診斷/測定試劑
盒較為理想
緩衝液 100mmol/L
穩定劑 500 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
卩-半乳糖苷酶 10000 U/L
麥芽糖磷酸化酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
乳糖 20 mmol/L
葡萄糖1-磷酸 5 mmol/L甘油醛-3-磷酸 6mmol/L
本發明的鈉(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩衝液、穩定劑、輔酶、(3-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、輔酶、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸。
試劑2
緩衝液、穩定劑、卩-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸
脫氫酶。
輔酶、卩-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乳糖、葡 萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可 以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使 用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1
緩衝液、穩定劑、輔酶、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸。
試劑2
緩衝液、穩定劑、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 試劑3
緩衝液、穩定劑、P-半乳糖苷酶。輔酶、卩-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乳糖、葡 萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，
直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定鈉(離子)濃度的方法，其輔酶 可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一 種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的鈉(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑 50Ommol/L
輔酶 3 mmol/L
卩-半乳糖苷酶 10000 U/L
麥芽糖磷酸化酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶 12000 U/L
乳糖 20 mmol/L
葡萄糖1-磷酸 5 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 6mmol/L 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用前，
加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鈉(離子)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約2分鐘左
右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鈉(離子)的濃度大
小
;施例二
本實施例的鈉(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 10Ommol/L
穩定劑
乳糖
葡萄糖1-磷酸 甘油醛-3-磷酸
50 mmol/L 3 mmol/L 20 mmol/L
5 mmol/L
6 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
(3-半乳糖苷酶
麥芽糖磷酸化酶
甘油醛-3-磷酸脫氫酶
10000 U/L 12000U/L 12000 U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鈉(離子)樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大 約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鈉(離子)的濃度大
實施例:
本實施例的鈉(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括:
試劑1
二 f給
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液
穩定劑
乳糖
葡萄糖1-磷酸
甘油醛-3-磷酸
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 穩定劑
麥芽糖磷酸化酶
甘油醛-3-磷酸脫氫酶
試劑3
穩定劑
卩-半乳糖苷酶
10Ommol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 20 mmol/L
5 mmol/L
6 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L 12000 U/L
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液 100mmol/L
500 mmol/L
10000U/L試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定鈉(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時
間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被 測鈉(離子)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方
向為正反應(上升反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀 下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鈉(離子)的濃度大 小。
申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達 到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.018;吸光度 時間反應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形範圍可 達50—200 mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測 試的精密度(重複性)的變異係數(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.00016 ± 0.00008 AA/mmol/L——本發明靈敏度高、精確度好，線形範圍寬廣，足 以便於推廣應用。
ii
權利要求
1. 一種酶比色法及酶聯法的鈉(離子)的濃度測定方法，其方法原理如下乳糖+水 β-半乳糖苷酶/Na+ 葡萄糖+半乳糖葡萄糖+葡萄糖1-磷酸 麥芽糖磷酸化酶 麥牙糖+磷酸根磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出鈉(離子)的濃度大小測定結果。
2. —種鈉(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩衝液20—一500 mmol/L穩定劑1——-4000 mmol/L輔酶l一6 mmol/L卩-半乳糖苷酶畫O-——80000 U/L麥芽糖磷酸化酶IOOO-——80000 U/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶IOOO-——80000 U/L乳糖l一50 mmol/L葡萄糖1-磷酸l一50 mmol/L甘油醛-3-磷酸1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限於上述範圍；在此範圍內效果較好，在此範 圍外，試劑仍會反應作用。其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也 可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述鈉(離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、輔酶、P-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷 酸脫氫酶、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述鈉(離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、卩-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷 酸脫氫酶、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸組成雙劑試劑；試劑l， 由緩衝液、穩定劑、輔酶、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸組成；試 劑2，由緩衝液、穩定劑、p-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷 酸脫氫酶組成。輔酶、P-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫 氫酶、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑l或試劑2中的位置可 以不限。
5. 根據權利要求2所述鈉(離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、輔酶、P-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸組成多劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、輔S每、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸組成；試 劑2，由緩衝液、穩定劑、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成； 試劑3,由緩衝液、穩定劑、P-半乳糖苷酶組成。輔酶、p-半乳糖苷酶、 麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、乳糖、葡萄糖l-磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述鈉(離子)診斷/測定試劑盒，其特徵在於還包括 穩定劑1一4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的鈉(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鈉(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學/食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、輔酶、乳糖、葡萄糖1-磷酸、甘油醛-3-磷酸、β-半乳糖苷酶、麥芽糖磷酸化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出鈉(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464356SQ200710192149
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優先權日2007年12月19日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司