羧肽酶g2的t細胞表位的製作方法

2023-08-03 16:25:46

專利名稱：羧肽酶g2的t細胞表位的製作方法
技術領域：
本發明涉及尤其是用於對人施用的、特別是用於治療的多肽。所述的多肽是經修飾的多肽，其中所述的修飾使得上述多肽在施用於人類受試者時引起免疫應答的傾向減弱。本發明尤其涉及對細菌羧肽酶G2(CPG2)的修飾，該修飾使得體內使用時這些CPG2蛋白基本上無免疫原性，或比任一未經修飾的相應蛋白的免疫原性低。此外，本發明還涉及來源於所述的非修飾蛋白質的T細胞表位肽，通過它們使產生免疫原性降低的經修飾CPG2變體成為可能。
背景技術：
有許多例子表明治療蛋白的效率受限於針對所述治療蛋白的幹擾性免疫反應。已有若干種小鼠單克隆抗體表現出治療多種人類疾病的前景，但在某些情況下由於誘導出相當程度的人抗鼠抗體(HAMA)應答而未能成功應用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。對於單克隆抗體，已開發了多種技術以試圖減弱HAMA應答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。這些重組DNA方法通常是減少最終的抗體構建體中小鼠的遺傳信息，同時增加最終構建體中人的遺傳信息。儘管如此，在許多情況下，所得的「人源化」抗體仍然引起患者的免疫應答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗體不是唯一一類作為治療劑施用的可引起免疫應答的多肽分子。即使是人源的並在人與人之間具有相同胺基酸序列的蛋白質仍可在人體中誘導免疫應答。明顯的實例包括粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的治療性應用(Wadhwa，M.等人(1999)臨床癌研究(Clin.Cancer Res.)51353-1361)和幹擾素α2的治療性應用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)新英格蘭醫學雜誌(New Engl.J.Med.)3181409-1413)。在這些人蛋白具有免疫原性的情況下，可能發生了對這些蛋白的免疫耐受的破壞，否則對這些蛋白的免疫耐受將在這些受試者體內運行。
當人蛋白被作為替代治療，例如在蛋白的組成性缺乏如血友病A、血友病B、高歇氏病(Gauchers disease)和許多其他疾病的遺傳性疾病中，情況就不同了。在這些情況下，治療性替代蛋白可能一開始就作為外來分子而產生免疫應答，並且當個體能夠產生針對該治療劑的免疫應答時，該治療的功效將大打折扣。
不管該蛋白治療劑被宿主免疫系統視作外來分子還是本來存在的對該分子的耐受被克服了，對該蛋白的免疫反應的機理是相同的。誘導免疫應答的主要因素是在蛋白中存在可經由MHCII類分子的呈遞作用激活T-細胞活性的肽(即所謂的T-細胞表位)。此類T-細胞表位通常定義為任何能夠與MHCII類分子結合的胺基酸殘基序列。隱含地，″T-細胞表位″是指當其與MHC分子結合時可被T-細胞受體(TCR)識別的表位，並且至少原則上，這種表位可以通過與TCR相互作用而激活這些T-細胞以促進T-細胞應答。
MHCII類分子為一組在T輔助細胞的選擇和活化中起中心作用的高度多態性蛋白質。人類白細胞抗原群DR(HLA-DR)為該組蛋白質的主要同種型，但是，同種型HLA-DQ和HLA-DP行使相類似的作用。人群中的每一個體具有二至四個DR等位基因，兩個DQ和兩個DP等位基因。已解析了許多DR分子的結構，這些結構揭示了一個具有一些可結合肽的疏水殘基(口袋殘基)的疏水口袋的敞口肽結合溝[Brown等人，自然(Nature)(1993)36433；Stern等人(1994)自然(Nature)368215]。確定II類分子的不同同種異型的多態性促成了肽結合溝內用於結合肽的不同表面的大量多樣性，並在群體水平上確保了在識別外源蛋白質並引起對病原生物體的免疫應答的能力方面有最大的靈活性。
針對治療性蛋白的免疫應答通過MHCII類肽呈遞途徑進行。其間外來蛋白經吞噬和加工後與DR、DQ或DP型MHCII類分子結合以進行呈遞。MHCII類分子由專門抗原呈遞細胞(APC)如巨噬細胞、樹突狀細胞等表達。通過MHCII類肽複合體與T細胞表面的關聯性T-細胞受體的相互作用，及與某些其他共受體，如CD4分子的交聯結合可誘導T-細胞進入激活狀態。上述激活作用可導致細胞因子釋放，進一步激活其他淋巴細胞如B細胞產生抗體或激活T殺傷細胞形成完整的細胞免疫應答。
T細胞表位的鑑定是消除表位的第一步，然而，本領域中少有將表位鑑定和表位去除整合為一個方案的清楚的例子。因此，WO98/52976和WO00/34317中公開了鑑定具有與人MHCII類DR同種異型亞群結合的潛在能力的多肽序列的計算機穿線方法(computational threadingapproaches)。這些教導中，利用目的蛋白中合理的胺基酸置換除去預測的T細胞表位。然而，在該方案和其他基於計算的表位鑑定方法[Godkin，A.J.等人(1998)免疫學雜誌(J.Immunol.)161850-858；Stumiolo，T.等人(1999)自然生物技術(Nat.Biotechnol.)17555-561]中，預測的能夠結合MHCII類分子的肽可能不會在所有情況下(尤其是在體內由於加工途徑或其他現象)都起T細胞表位的作用。此外，對T細胞表位預測的計算方法一般不能預測具有DP或DQ限制的表位。
同樣，例如用限定的MHC同種異型B細胞系作為MHCII類結合表面的來源以測量合成肽結合MHCII類分子的能力的體外方法可以應用於MHCII類配體的鑑定[Marshall K.W.等人(1994)免疫學雜誌(J.Immunol.)1524946-4956；O′Sullivan等人(1990)免疫學雜誌(J.Immunol.)1451799-1808；Robadey C.等人(1997)免疫學雜誌(J.Immunol)1593238-3246]。然而，這些技術不適於篩選各種MHC同種異型的多種潛在表位，也不能確定結合肽能夠起T細胞表位的作用。
最近利用重組MHC分子與合成肽的可溶性複合體的技術已經得到應用[Kern，F.等人(1998)自然醫藥(Nature Medicine)4975-978；Kwok，W.W.等人(2001)免疫學趨勢(TRENDS in Immunology)22583-588]。這些試劑和方法用於鑑定人或實驗動物受試者的外周血樣中能結合特定MHC-肽複合物的T細胞克隆的存在，但是這些試劑和方法不適於篩選各種MHC同種異型的多種潛在表位。
T細胞活化的生物學測定提供了一個解讀試驗肽/蛋白序列引起免疫應答的能力的實用選擇。該類方法的例子包括Petra等人用對細菌蛋白葡萄球菌激酶的T細胞增殖進行測定，然後用合成肽刺激T細胞系的表位作圖[Petra，A.M.等人(2002)免疫學雜誌(J.Immunol.)168155-161]。類似地，使用破傷風毒素蛋白的合成肽進行T細胞增殖測定導致明確了該毒素免疫顯性的表位區[Reece J.C.等人(1993)免疫學雜誌(J.Immunol.)1516175-6184]。WO99/53038公開了一種方法，該方法利用分離的人免疫細胞亞型，促進它們的體外分化，在合成的目的肽存在時培養細胞，並測定培養的T細胞中任何誘導的增殖來確定受試蛋白的T細胞表位。同樣的技術也被Stickler等人[Stickler，M.M.等人(2000)免疫治療雜誌(J.Immunotherapy)23654-660]描述過，在這兩個例子中，該方法都用於檢測細菌枯草桿菌蛋白酶的T細胞表位。這種技術需要小心應用細胞分離技術和補充多種細胞因子的細胞培養基以得到所需的免疫細胞亞型(樹突狀細胞、CD4+和/或CD8+T細胞)，並且無助於使用多種供體樣品的快通量篩選。
根據上述描述，由此可能期望鑑定並去除或至少減少特定的原則上具有治療價值但原本具有免疫原性的肽、多肽或蛋白中的T-細胞表位。羧肽酶G2(這裡簡寫為CPG2)是這些有治療價值的分子之一。
CPG2是最初從假單胞菌屬菌株RS-16中分離得到的一種細菌酶(EC編號為3.4.17.11)。這種酶具有廣泛的底物特異性並催化C-末端的穀氨酸殘基從多種不同的N-醯基基團釋放。編碼該酶的基因已經得到描述[Minton，N.P.等(1984)基因(Gene)311-3]，並且該蛋白質的晶體結構也已經被闡明[Roswell，S.等(1997)結構(Structure)5337-347]。這種酶以前已經用於治療癌症的抗體導向的酶前體藥物治療(ADEPT)策略，並且還被用於實驗性基因導向的酶前體藥物療法(GDEPT)。在ADEPT方法中，酶分子被連接於靶向部分，如抗體或保留抗原結合特異性的抗體片段[Napier，M.P.等(2000)臨床癌研究6765-772]。連接到抗體上可以通過化學交聯劑實現或者將抗體CPG2酶作為融合蛋白在重組宿主生物如大腸桿菌(E.coli)中表達來實現連接。
因此本發明涉及到CPG2酶，並且這種蛋白質野生型的胺基酸序列以單字母密碼描述於下QKRDNVLFQAATDEQPAVIKTLEKLVNIETGTGDAEGIAAAGNFLEAELKNLGFTVTRSKSAGLVVGDNIVGKIKGRGGKNLLLMSHMDTVYLKGILAKAPFRVEGDKAYGPGIADDKGGNAVILHTLKLLKEYGVRDYGTITVLFNTDEEKGSFGSRDLIQEEAKLADYVLSFEPTSAGDEKLSLGTSGIAYVQVNITGKASHAGAAPELGVNALVEASDLVLRTMNIDDKAKNLRFNWTIAKAGNVSNIIPASATLNADVRYARNEDFDAAMKTLEERAQQKKLPEADVKVIVTRGRPAFNAGEGGKKLVDKAVAYYKEAGGTLGVEERTGGGTDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYHSDKAEYVDISAIPRRLYMAARLIMDLGAGK儘管可以得到治療用量的CPG2融合蛋白，但在施用於人類受試者時仍需要對它的體內特性進行加強。在這方面，非常希望提供具有減少或者沒有可能在人類受試者中誘導免疫應答的CPG2。此類蛋白質預期在人體內的循環時間將增加。本發明提供了預期可在體內展現增強特性的CPG2蛋白的經修飾形式。
其他人已經提供了CPG2分子[WO88/07378]，包括經修飾的CPG2[US，6,004,550]，但是這些教導沒有說明T細胞表位對於該蛋白免疫原性特性的重要性，也沒有考慮根據本發明的方案以特異並受控的方式直接影響所述特性。
本發明的一個特定目的是提供經修飾的CPG2蛋白，這些蛋白質的免疫特性是通過降低潛在的T細胞表位數量的方式進行修飾的。
發明概述和描述本發明提供了CPG2的經修飾形式，其中免疫特性通過降低潛在的T細胞表位數量的方式修飾。本發明公開了在CPG2一級序列內鑑定到的由於具有與MHCII類分子結合的可能性而是潛在T-細胞表位的序列。該公開尤其涉及含有390個胺基酸殘基的成熟CPG2蛋白。本發明公開了在人中具免疫原性的CPG2一級序列的主要區域，因此，本發明提供了對這些序列進行修飾以消除或者降低這些位點的免疫原性效力所需的關鍵信息。
在一個實施方案中，含有免疫原性區的合成肽可以在藥物組合物中提供以促進對整個分子的耐受原應答。在另一個實施方案中，本文公開的在表位區內經修飾的CPG2分子可以用於藥物組合物中。
總之，本發明涉及下述內容·在幼稚T細胞測定中使用一組合成肽以對CPG2的免疫原性區作圖；·在幼稚T細胞測定中使用一組CPG2蛋白變體選擇體外呈現最弱免疫原性的變體；·在幼稚T細胞測定中使用一組合成的CPG2肽變體選擇體外呈現最弱免疫原性的肽序列；·使用T細胞刺激的生物學分析選擇在幼稚T細胞測定中刺激指數低於野生型CPG2分子的刺激指數，且優選地低於2.0的CPG2蛋白變體；·在幼稚T細胞測定中最初測得的刺激指數大於1.8、優選大於2.0的CPG2衍生肽序列，其中所述肽被最小程度地修飾並在幼稚T細胞測定中檢驗發現其刺激指數有所降低；·CPG2衍生肽序列和野生型蛋白序列具有100％的胺基酸同一性，並且能夠在T細胞測定中引起的刺激指數為1.8或者更大、優選大於2.0；·如上所述的CPG2肽序列，其被修飾而和野生型蛋白序列的胺基酸同一性小於100％，並且在T細胞測定中引起的刺激指數小於2.0；·一種含有經修飾的CPG2分子，該修飾使得在T細胞測定中測試時引起比未修飾的蛋白分子降低的刺激指數；·一種CPG2分子，其中用T細胞測定對免疫原性區進行了作圖，然後對其進行修飾，使得在T細胞測定中重新試驗時，經修飾的蛋白引起的刺激指數比親本(未修飾的)分子小、最優選小於2.0；·一種經修飾的分子，其具有CPG2的生物學活性，且當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低於任何具有相同生物學活性但未經修飾的分子；·如上所述的CPG2分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過從原始的未經修飾的分子中去除一個或多個T-細胞表位而實現的；·如上所述的CPG2分子，其中，所述的免疫原性喪失是通過減少能與來自所述分子的肽相結合的MHC同種異型的數量來實現的；·如上所述的CPG2分子，其中，去除了一個T-細胞表位；·如上所述的CPG2分子，其中，所述原本存在的T-細胞表位是MHCII類配體或通過呈遞在II類分子上後有刺激或結合T-細胞的能力的肽序列；·如上所述的分子，其中該肽序列選自如表1或表2中所示的肽序列；·如上所述的分子，其中該分子包含一個或多個選自表4或表5的胺基酸替代；·如上所述的分子，其中在任何原本存在的T細胞表位中1-9個胺基酸殘基，優選地1個胺基酸殘基發生了改變；·如上所述的分子，其中，胺基酸殘基的改變為在特定位點處用另外的胺基酸殘基替代原本存在的胺基酸殘基、向原本存在的胺基酸殘基添加另外的胺基酸殘基或將原本存在的胺基酸殘基缺失；·如上所述的分子，如上所述的分子，其中，如果必要，一般可通過替代、添加或缺失特定胺基酸進行額外的進一步改變，以恢復所述分子的生物學活性；·如上所述的分子，其中改變是在任一或所有下面列出的序列(A)-(K)的連續殘基串中一個或多個殘基處進行的，其中所述序列來自CPG2野生型序列，此處用單字母代碼表示；
A.＝VGKIKGRGGKNLLLMSHMDTVYLKGILAK；B.＝KAYGPGIADDKGGNAVILHTLKLLKEYG；C.＝LFNTDEEKGSFGSRDLIQEEA；D.＝KLADYVLSFEPTSAGDEKLSLGTSG；E.＝VNITGKASHAGAAPELGVNALVEASDL；F.＝KAKNLRFNWTIAKAGNVSNIIPASATLNAD；G.＝ADVKVIVTRGRPAFNAGEGGKKLVDKA；H.＝KKLVDKAVAYYKEAGG；I.＝YKEAGGTLGVEERTGGG；J.＝TDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYK.＝LEKLVNIETGTGDAE；·包含上述序列(A)-(K)中任一序列的至少9個連續殘基的肽分子；·其序列與序列(A)-(K)中任一肽序列的胺基酸同一性大於90％的上述肽分子；·其序列與序列(A)-(K)中任一肽序列的胺基酸同一性大於80％的上述肽分子；·包含與上述序列(A)-(K)中的一個或多個序列相同或充分同源的序列元件的肽分子；·上述的能結合MHCII分子的肽序列；·藥物組合物，其包含具有結合MHCII類活性的上面的肽或經修飾肽的任何一種；·DNA序列或分子，其編碼如上或如下所定義的任何一種所述特異的經修飾分子；·含有具CPG2生物學活性的經修飾分子的藥物組合物；·如上面和/或權利要求書中定義的藥物組合物，其任選地還包含可藥用載體、稀釋劑或賦形劑；·用於製備此處定義的具有CPG2生物學活性的經修飾分子的方法，所述方法包括以下步驟(i)確定所述多肽或其中一部分的胺基酸序列；(ii)通過任意方法，包括利用體外或矽片上(in silico)的技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(iii)設計新的序列變體，其中，經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性，這一效果可由體外或矽片上(in silico)的技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定；(iv)通過重組DNA技術構建所述序列變體，並檢測所述的變體以便鑑定一個或多個具有所需性質的變體；和(v)任選地重複步驟(ii)-(iv)；·如上所述的方法，其中步驟(iii)是通過在任何原本存在的T-細胞表位中替代、添加或缺失1-9個胺基酸殘基來進行的；·如上所述的方法，其中，所述的改變是參照同源蛋白質序列和/或矽片上(in silico)建模技術進行的；·由上述的13mer T-細胞表位肽中的至少9個連續的胺基酸殘基組成的肽序列，及其在製備體內使用時基本上沒有免疫原性或免疫原性低於具有相同生物學活性的任何未修飾分子的CPG2中的用途；·具有以下結構的CPG2分子X0QKRDNVLFQAATDEQPAVIKTLEKLVNIETGTGDAEGIAAAGNFLEAELKNLGFTVTRSKSAGLVVGDNIVGKX1KGRGGKNLX2LX3SHMDTVYX4KGILAKAPFRVEGDKAX5GPGX6ADDKGGNAX7IX8HTX9X10X11X12KEYGVRDYGTITVX13FNTDEEKGSFGSRDLX14QEEAKLADYX15X16SX17EPTSAGDEKX18SLGTSGIAYVQVNITGKASHAGAAPEX19GX20NAX21X22EASDLVLRTMNIDDKAKNX23RFNX24TX25AKAGX26X27SX28X29X30PASATX31NADVRYARNEDFDAAMKTLEERAQQKKLPEADX32KX33IVTRGRPAFNAGEGGKX34X35X36DKAX37AX38X39KEAGGTLGVEERTGGGTDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYHSDKAEYVDISAIPRRLYMAARLIMDLGAGK其中X0任選地為靶向部分，如抗體結構域；
X1為I，T；X2為L，A；X3為M，K；X4為L，I；X5為Y，T；X6為I，A；X7為V，A；X8為L，A；X9為L，T，A；X10為K，T；X11為L，M，A；X12為L，T，A；X13為L，G，T；X14為I，T，A；X15為V，A；X16為L，T，G；X17為F，A；X18為L，A；X19為L，A；X20為V，A；X21為L，A；X22為V，T，A；X23為L，A；X24為W，A，H；X25為I，A；X26為N，T，A；X27為V，T；X28為N，T，A；X29為I，T，A；X30為I，T，A；X31為L，T，A，I；X32為V，A；X33為V，A；X34為K，T；X35為L，A；X36為V，A；X37為V，S，T，A；X38為Y，T，A；X39為Y，S，T，A；且不包括同時為以下胺基酸殘基的情況X1＝I，X2＝L，X3＝M，X4＝L，X5＝Y，X6＝I，X7＝V，X8＝L，X9＝L，X10＝K，X11＝L，X12＝L，X13＝L，X14＝I，X15＝V，X16＝L，X17＝F，X18＝L，X19＝L，X20＝V，X21＝L，X22＝V，X23＝L，X24＝W，X25＝I，X26＝N，X27＝V，X28＝N，X29＝I，X30＝I，X31＝L，X32＝V，X33＝V，X34＝K，X35＝L，X36＝V，X37＝V，X38＝Y且X39＝Y。
術語″T細胞表位″根據本發明的理解是指這樣的胺基酸序列，其可以結合MHCII類分子、可刺激T細胞和/或也可在與MHCII類的複合體中結合(不必可測得地活化)T細胞。
此處及後附權利要求中所用的術語「肽」是指包含兩個或多個胺基酸的化合物。胺基酸之間通過肽鍵(定義見下)相連。肽的生物生產中涉及20種不同的天然胺基酸，任意數量的所述胺基酸可按任意的順序連接形成肽鏈或環。用於生物生產肽中的天然胺基酸全部具有L-構型。可應用常規的合成方法利用L-胺基酸、D-胺基酸或兩種不同構型的胺基酸的各種組合製備合成肽。一些肽僅包含少量的胺基酸單元。例如含有不到10個胺基酸單元的短肽有時被稱作「寡肽」。其他的包含大量胺基酸殘基，例如達100個或更多個胺基酸殘基的肽稱作「多肽」。習慣上將含有3個或3個以上胺基酸的任何肽鏈看作「多肽」，而通常將「寡肽」視為特定類型的短「多肽」。因而本文所提到的「多肽」應理解為也包括「寡肽」。而且，所提到的「肽」包括多肽、寡肽和蛋白。不同的胺基酸排列形式形成不同的多肽或蛋白。因此，多肽的數量以及可形成的不同蛋白的數量實際上是無限的。「α碳(Cα)」是肽鏈的碳-氫(CH)組分中的碳原子。「側鏈」是Cα的側基，其可包含簡單的或複雜的基團或部分，且具有與所述肽的大小相比可顯著變化的外形大小。
本發明可應用於與此處公開的CPG2具有基本上相同的一級胺基酸序列的任何CPG2分子，因此包括利用基因工程手段或其他方法獲得的、可能包含多於或少於390個胺基酸殘基的CPG2分子。從其他來源(包括假單胞菌屬的不同菌株和其它生物體)鑑定的CPG2蛋白共有本公開的許多肽序列，並且共有許多與所公開的序列基本相同的肽序列。這些蛋白序列因此同樣都位於本發明範圍之內。
本發明是為了克服實際應用中存在的下述問題，即將可溶性蛋白引入自體生物中可引發免疫應答，產生可與所述可溶性蛋白相結合的宿主抗體。本發明通過提供施用於人宿主時引起免疫應答的傾向發生改變的CPG2蛋白以試圖解決這個問題。根據本文描述的方法，發明人已經發現了含有驅動對該蛋白產生免疫應答的關鍵性T細胞表位的CPG2分子區域。
本發明中形成經修飾CPG2的總方法包括下述步驟(a)確定多肽或其中一部分的胺基酸序列；(b)通過任意方法，包括利用體外或矽片上(in silico)的技術或生物學試驗確定所述肽與MHC分子的結合，由此鑑定所述蛋白的胺基酸序列中潛在的一個或多個T-細胞表位；(c)設計新的序列變體，其中，經鑑定的潛在T-細胞表位內有一個或多個胺基酸經過修飾，由此基本上減弱或去除了所述T-細胞表位的活性，這一效果可由體外或矽片上(in silico)的技術或生物學試驗通過所述肽與MHC分子的結合來確定。構建此序列變體以避免由所述的序列變體產生新的潛在T-細胞表位，否則所述的新的潛在T細胞表位又通過此種方式進行修飾以基本上減弱或消除T-細胞表位活性；和(d)根據已知的重組技術通過重組DNA技術構建所述序列變體，並檢測所述的變體以便鑑定一個或多個具有所需性質的變體。
對於步驟(b)中對潛在T-細胞表位的鑑定可依照本領域已公知的方法進行。在WO 98/59244；WO 98/52976；WO 00/34317中也公開了適當的方法，並可用於鑑定從CPG2衍生的肽對MHCII類分子的結合傾向。
在實施例1中公開了另一種非常有效的通過計算鑑定T-細胞表位的方法，它是本發明的優選實施方案。
涉及CPG2蛋白序列的根據上述方案中步驟(b)的分析結果列於表1。
表1CPG2中具有潛在人MHCII類結合活性的肽序列DNVLFQAATDEQP，NVLFQAATDEQPA，VLFQAATDEQPAV，PAVIKTLEKLVNI，AVIKTLEKLVNIE，KTLEKLVNIETGT，EKLVNIETGTGDA，KLVNIETGTGDAE，VNIETGTGDAEGI，EGIAAAGNFLEAE，GNFLEAELKNLGF，NFLEAELKNLGFT，AELKNLGFTVTRS，KNLGFTVTRSKSA，LGFTVTRSKSAGL，FTVTRSKSAGLVV，AGLVVGDNIVGKI，GLVVGDNIVGKIK，LVVGDNIVGKIKG，DNIVGKIKGRGGK，NIVGKIKGRGGKN，GKIKGRGGKNLLL，KNLLLMSHMDTVY，NLLLMSHMDTVYL，LLLMSHMDTVYLK，LLMSHMDTVYLKG，SHMDTVYLKGILA，DTVYLKGILAKAP，TVYLKGILAKAPF，VYLKGILAKAPFR，KGILAKAPFRVEG，GILAKAPFRVEGD，APFRVEGDKAYGP，FRVEGDKAYGPGI，KAYGPGIADDKGG，PGIADDKGGNAVI，
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圖1，其中列出了用實施例2中的方法證明可在人T-細胞中引發增殖反應的CPG2衍生肽序列。
表2可體外刺激人T-細胞的CPG2肽序列
當在生物學測定中鑑定了多種潛在表位，尤其是發現許多肽序列能夠刺激T細胞時，也可以進行該蛋白的結構特徵與其通過MHCII類呈遞途徑引起免疫應答的傾向的認識。例如，當知道了目的蛋白的晶體結構時，可以分析晶體學B因子分值以證明該蛋白內的結構無序，該晶體學B因子分值參數被認為與鄰近生物學相關的免疫顯性肽表位相關[Dai G.等(2001)生物化學雜誌(J.Biological Chem.)27641913-41920]。當在CPG2晶體結構上進行這種分析[PDB ID1CG2，Rowsell，S.等(1997)，結構(Structure)5337]時表明很可能存在多個免疫顯性表位，在建模的CPG2晶體結構的4條不同鏈中，至少在3條鏈中的至少11個不連續區域繪製出高於B因子平均分值的區域中央位置。在這11個區域中，9個位於已表明能在實施例2的幼稚T-細胞測定中引發增殖反應的肽的N-末端邊緣。
這個數據與來自大量對特定肽有反應的天然供體的數據一起能提供該分子最具免疫顯性區域的預測的排列等級。但是在實踐中認識到這些區域中的每一個在人體內都是免疫原性的，因而需要以本發明的方案對其進行修飾。於是，關於上面定義的序列串(A)-(K)，這些序列可以排成下列順序(A)，{(B)，(E)}，{(D)，(G)，(F)，(H)}，{(I)，(J)，(K)}；其中(A)被認為是該分子中免疫原性最強的序列。括號中的序列歸為相同等級。這些區域已經列於表3，並分為主要表位區A-H和次要表位區I和J。這種差別是根據幼稚T-細胞測定中具反應的供體出現的頻率劃定的，由此對於所謂的「次要」表位區，來源於一系列供體中的一個供體的T-細胞可與代表該序列區域的合成肽起反應。與此相反，大部分對來源於多個供體的T-細胞有刺激作用的刺激物是位於主要表位區域的肽。所用的供體系列是所有不同的MHCII類同種異型的典型代表。
表3CPG2表位區
在實踐中，將產生許多的變體CPG2蛋白並且檢驗所需的免疫和功能特徵。儘管可以考慮應用其他方法，包括化學合成CPG2片段，但最優選的是通過眾所周知的重組DNA技術產生變體蛋白質。構建和表達CPG2蛋白(包括經修飾的CPG2蛋白)的適宜方法提供於實施例3-5中。
本發明涉及這樣的CPG2類似物，其中至少一個胺基酸殘基的替代在導致該蛋白的活性顯著降低或一個或多個潛在T細胞表位被除去的位置處進行。最優選提供CPG2分子，其中胺基酸修飾(例如替代)在親本分子的免疫原性最強區進行。本發明主要的優選實施方案包括這樣的CPG2分子，其中改變任何MHCII類配體以消除肽對MHC同種異型的結合或者減少該肽結合MHC同種異型的數目。本發明人已經發現並在此處公開了人體內CPG2分子的免疫原性區。可以理解，在某些特定情況下，向此處公開序列添加的區域可能成為免疫原性表位，例如用表達含有本發明序列相似序列的蛋白質或肽的病原體感染的情況下。無論如何，對於序列元件而言，重要的是充當MHCII類配體，並且，表1中公開的任何序列基本上被認為是本發明範圍內的免疫原性表位。
為了除去T細胞表位，優選在所預測的肽序列中合適的位點進行胺基酸替代以完成T細胞表位活性的減小或者消除。實踐中，合適的位點優選等同於在MHCII類結合溝所提供的口袋之一中結合的胺基酸殘基。最優選的是在所述肽的稱作P1或P1錨的位置改變在裂縫的第一口袋內的結合。公認地，肽的P1錨殘基和MHCII類結合溝的第一口袋之間的結合相互作用的質量是整個肽的總結合親和性的主要決定因素。在所述肽的這一位置的適當替代是替代為不易容納到所述口袋中的殘基，例如替代為更親水的殘基。所述肽中處於如下位置的胺基酸殘基也被認為是落入本發明的範圍內，所述位置為與MHC結合裂縫的其他口袋區域結合的位置。
可以理解，由給定的潛在T-細胞表位內的單一胺基酸替代導致該表位去除的路線是最優選的。也可以在單一表位內進行組合替代，例如，這可能對於單獨定義的表位間彼此重疊的情況特別適宜。此外，在給定的表位內的單胺基酸替代或在一個表位內的組合胺基酸替代也可以在非對應於MHCII類結合溝的″口袋殘基″的位置，而是在所述肽序列內的任意位點上進行。替代可參照同源結構或由本領域已知的矽片上(insilico)技術產生的結構方法進行，也可以根據本發明分子的已知結構特徵進行。所有此類替代均落入本發明的範圍內。
尤其是當與所列出的肽內進行組合替代時，可以考慮對上面所鑑定的肽之外的胺基酸進行替代。例如可以進行能恢復變體分子的結構和生物學活性的變化。此類代償性變化和對CPG2多肽的特定胺基酸殘基進行刪除或添加而形成具有目標活性變體的變化，以及在任意公開的肽中的變化組合均包括於本發明領域範圍之內。
本發明方案中所設計的特別優選的一系列CPG2分子突變體列於表4。此類替代是用實施例1中的計算方法選擇的。文中以上定義並列出的表位區內的每一個替代也列於表3。
表4CPG2中的替代
人們認為也能使用其他已知的方法，並且這些方法的應用可能導致產生了特定選擇性替代的定義。在任何情況下，特別期望的替代都將是一種能同時滿足並行目的的替代，即既保留分子的功能活性，而同時又破壞作為一個或多個人MHCII類分子配體的位點內的肽序列和/或停止刺激與其相匹配的T-細胞受體的能力。一個已知的適用的方案可包括此處公開的表位區域內的隨機突變和酶促功能性變體的選擇。然後通過免疫學分析對所選擇的變體進行獨立的第二輪篩選。例如，適宜的免疫學篩選是使用變體序列合成肽和體外培養的人T-細胞或T-細胞系進行的T細胞增殖測定法。
另一種方法可以利用分子模建技術矽片上選擇可同時滿足上面略述的並行雙目的。CPG2分子的結構模型可以用任何適宜的軟體包進行檢查，並且可以篩選出高度期望的替代。此類特別優選的替代的例子列於表5；這些替代被認為廣泛適於CPG2結構，並且含有任一所列出替代的CPG2分子變體也被認為是本發明優選的實施方案。
表5CPG2中優選的替代
因此，通過下面的結構給出了一個特別優選的經修飾CPG2分子X0QKRDNVLFQAATDEQPAVIKTLEKLVNIETGTGDAEGIAAAGNFLEAELKNLGFTVTRSKSAGLVVGDNIVGKX1KGRGGKNLX2LX3SHMDTVYX4KGILAKAPFRVEGDKAX5GPGX6ADDKGGNAX7IX8HTX9X10X11X12KEYGVRDYGTITVX13FNTDEEKGSFGSRDLX14QEEAKLADYX15X16SX17EPTSAGDEKX18SLGTSGIAYVQVNITGKASHAGAAPEX19GX20NAX21X22EASDLVLRTMNIDDKAKNX23RFNX24TX25AKAGX26X27SX28X29X30PASATX31NADVRYARNEDFDAAMKTLEERAQQKKLPEADX32KX33IVTRGRPAFNAGEGGKX34X35X36DKAX37AX38X39KEAGGTLGVEERTGGGTDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYHSDKAEYVDISAIPRRLYMAARLIMDLGAGK
其中X0任選地為靶向部分，如抗體結構域；X1為I，T；X2為L，A；X3為M，K；X4為L，I；X5為Y，T；X6為I，A；X7為V，A；X8為L，A；X9為L，T，A；X10為K，T；X11為L，M，A；X12為L，T，A；X13為L，G，T；X14為I，T，A；X15為V，A；X16為L，T，G；X17為F，A；X18為L，A；X19為L，A；X20為V，A；X21為L，A；X22為V，T，A；X23為L，A；X24為W，A，H；X25為I，A；X26為N，T，A；X27為V，T；X28為N，T，A；X29為I，T，A；X30為I，T，A；X31為L，T，A，I；X32為V，A；X33為V，A；X34為K，T；X35為L，A；X36為V，A；X37為V，S，T，A；X38為Y，T，A；X39為Y，S，T，A；且不包括同時為以下胺基酸殘基的情況X1＝I，X2＝L，X3＝M，X4＝L，X5＝Y，X6＝I，X7＝V，X8＝L，X9＝L，X10＝K，X11＝L，X12＝L，X13＝L，X14＝I，X15＝V，X16＝L，X17＝F，X18＝L，X19＝L，X20＝V，X21＝L，X22＝V，X23＝L，X24＝W，X25＝I，X26＝N，X27＝V，X28＝N，X29＝I，X30＝I，X31＝L，X32＝V，X33＝V，X34＝K，X35＝L，X36＝V，X37＝V，X38＝Y且X39＝Y。
根據上述結構的經修飾CPG2蛋白是本發明的實施方案。已經產生了經修飾的CPG2蛋白，並且證明其在體外培養的人T-細胞中引發增殖反應的能力降低(詳述於實施例6)。這些數據與在體內免疫原性潛能降低的經修飾CPG2蛋白是一致的。
已經認識到，天然CPG2酶會形成同型二聚體並且其活性需要鋅離子。本發明的目的是產生這樣的經修飾CPG2分子，它含有較少量的T-細胞表位或較少量的能結合MHCII類或與MHCII類分子相關的T-細胞上的序列，並且優選的是它也能夠形成同型二聚體並結合鋅離子。
同時還認識到，天然CPG2酶會形成同型二聚體並且其活性需要鋅離子，因此最期望能提供一種經修飾的CPG2分子，即當其施用於人體時，誘導免疫反應的潛能降低或缺乏，並且所述的這種具有預期特性的經修飾CPG2分子可能會減弱其形成同型二聚體和/或結合鋅離子的能力，但卻保留了一定程度的酶活性從而仍具有將前體藥物轉化成活性藥物的能力。此種分子包括於本發明領域範圍之內。
本發明的經修飾CPG2分子可以不形成同型二聚體；並且那些能夠導致形成具有預期酶活性的單體CPG2、並且不含或含有至少數量減少的T-細胞表位或能結合到MHCII類分子或與MHCII類分子相關的T-細胞上的序列的序列修飾同樣也是本發明一個預期目的。
已經認識到，自身不能形成二聚體且在溶液中以單體形式存在的經修飾CPG2分子可能沒有預期的酶活性，但是若將兩個以上經修飾的CPG2分子相互靠近，則仍然可能部分或全部恢復其酶活性。若這種分子也包含較少數量的T-細胞表位或能結合到MHCII類分子或與MHCII類分子相關的T-細胞上的序列，則同樣也包括於本發明領域範圍之內。
將多個經修飾CPG2分子中的兩個相互靠近從而重新產生酶活性的這種情況可以通過基因工程方法來實現，例如通過將CPG2分子融合到第二個蛋白質的結構域上，能夠促進或參與形成二聚體及其他程度的結合相互作用。此類結構域的實例包括抗體恆定區，如IgG或其他免疫球蛋白同種型的Fc結構域。其他實例包括抗體V-區結構域或如FOS和JUN蛋白中的b-zip基序。同樣也可以考慮其他公認的蛋白結構域。也可以期望使用能將兩個CPG2連接成一個重組融合蛋白的蛋白質接頭結構域將所述的CPG2分子適當地靠近到一起。
還可以考慮與非蛋白質化合物形成經修飾的CPG2複合體，非蛋白質化合物包括合成的水溶液聚合物，如羥丙基甲基丙烯醯胺或聚苯乙烯-共-馬來酸或其他物質。同樣，為了使該複合體恢復或提供一定程度的酶活性，也可以考慮用脂質體或碳水化合物製劑與經修飾的CPG2連接，否則，如果所述的CPG2部分不相互靠近或由外力迫使其靠近，複合體就不會恢復或提供一定程度的酶活性。
本發明的一個目的是產生當施用於人體時誘導免疫反應的潛能降低或缺乏的經修飾CPG2分子。本目的還目標能保留分子的功能活性，即催化前體藥物向活性藥物轉化的能力。優選的是活性藥物對所目標靶細胞的毒性比前體藥物至少高一個數量級，並且最優選的是活性藥物的毒性大於一個數量級。適宜的前體藥物包括氮芥前體藥物和其他描述於專利WO88/07378；WO89/10140；WO90/02729；WO91/03460；EP-A-540263；WO94/02450；WO95/02420；WO95/03830或US，6,004,550中的化合物，它們於此處引用作為參考。其它任何能夠用本發明經修飾的CPG2進行轉化和能夠產生適合毒性特徵的化合物均可考慮與本發明經修飾的CPG2組合使用。
就本發明涉及到的經修飾CPG2而言，包含此類經修飾的CPG2蛋白或經修飾CPG2蛋白片段的組合物及相關組合物也將位於本發明領域所考慮的範圍之內。另一方面，本發明涉及編碼經修飾CPG2實體的核酸。本發明另外一方面涉及用經修飾的CPG2蛋白進行人類治療的方法。在這個方面，經修飾的CPG2蛋白可與抗體分子或抗體分子片段進行連接。這種連接可以藉助於化學交聯劑或CPG2-抗體可以作為重組融合蛋白產生。融合分子可包含具有定位於融合分子N-末端的抗體結構域的經修飾CPG2結構域，儘管相反的定位也可能被考慮到。
適於連接到本發明經修飾CPG2分子上的目標抗體包括那些能夠導向癌胚抗原的抗體，包括MFE23[Chester，K.A.等(1994)柳葉刀(Lancet)343455]、A5B7[WO92/010159]、T84.66[US，5,081,235]、MN-14[Hansen，H.J.等(1993)癌症(Cancer)713478-3485]、COL-1[US，5,472,693]等。其他目標抗體包括針對非內化抗原的抗體，這些非內化抗原包括被抗體KS1/4[Spearman等(1987)藥物實驗治療學雜誌(J.Pharmacol.Exp.Therapeutics)241695-703]和其他抗體識別的40kDa糖蛋白抗原。其他抗原如表皮生長因子受體(HER1)或相關受體如HER2是可以選擇的，包括抗-GD2抗體，如抗體14.18[US，4,675,287；EP 0 192 657]，或可考慮針對前列腺特異膜抗原[US，6,107,090]、IL-2受體[US，6,013,256]、A33抗原[Heath，J.K.等(1997)美國國家科學院院報Proc.Natl，Acad.Sci U.S.A.]94469-474]、Lewis Y決定簇、粘蛋白糖蛋白等的抗體。
當經修飾的CPG2蛋白與抗體序列融合產生時，最期望使用的抗體序列是那些已經去除了T細胞表位或去除了能夠結合MHCII分子或刺激T-細胞或結合與MHCII分子相關的T-細胞的序列的抗體序列。
在本發明的另一個實施例中，經修飾的CPG2蛋白連接到非抗體蛋白質上，而這種蛋白質能夠指導對特殊靶細胞的特異性相互結合作用。此類蛋白質分子包括一系列具有特異細胞表面受體的多肽配體，因此它們包括大量細胞因子、肽和多肽激素及其他生物反應調節劑。重要的實例包括以下蛋白質，如血管上皮生長因子、表皮生長因子、heregulin、白介素、幹擾素、腫瘤壞死因子及其他蛋白質和糖蛋白分子。這些分子或其他分子與本發明中的CPG2形成的融合蛋白質也可以被考慮，並且這種融合蛋白中可含有相對於蛋白質配基結構域而言定位於其N-末端或C-末端的經修飾CPG2部分。同樣的，還可以考慮將純化的配體化學交聯到經修飾的CPG2蛋白上，並且這種方法也包括於本發明領域範圍之內。
在另一個實施方案中，本發明的經修飾CPG2蛋白可以以含有如羥丙基甲基丙烯醯胺的水溶聚合物或其他聚合物的複合體的形式使用，其中經修飾的CPG2蛋白是共價連接到聚合物上的或者是以非共價結合與聚合物相互作用。該實施方案此外還包括一個與聚合的CPG2複合體組合的抗原結合結構域如抗體或抗體片段。
在本發明的另一個實施方案中，經修飾CPG2酶基因本身可以用作治療實體，例如基因靶向酶前體藥物策略，並且還可以包括與載體中的組織特異性啟動子序列的連接，或者可從載體中病毒來源的啟動子開始表達，或者載體自身可是病毒來源的，或者能夠被包裝於病毒顆粒內且能感染細胞。現在將用以下實施例進行闡述，但不限於這些實施例。實施例提及以下圖表圖1提供了根據實施例2的方法進行幼稚T-細胞增殖測定所用的合成肽的列表。ID#＝每一受測試肽的標識編號；供體#＝供體體PBMC培養物的標識，其中對特定肽的評分大於1.95的刺激指數；序列＝以單一字母代碼表示的肽序列。
圖2提供了描述當存在不同濃度野生型或經修飾的CPG2蛋白時，用幼稚人PBMC培養物進行免疫原性測定的結果的點圖。該圖顯示了來自兩個反應性供體PBMC樣本的結果。A＝供體#1。B＝供體#16。SI＝刺激指數。
實施例1
用計算方法鑑定CPG2蛋白序列中潛在的MHCII類配體具有MHCII類結合配體潛能的肽序列的分析策略在以前已進行了詳細敘述[WO 02/069232]。使用該方法的軟體工具已被研發出來並用於CPG2蛋白序列的分析。簡而言之，軟體建立於大量組件，包括模建的MHCII類分子文庫，該文庫覆蓋了人種群中大量的同種異型變體，並包括肽主鏈結構文庫，該文庫包含理論上和已知的主鏈構象。利用這些組件，基於每一模建MHC同種異型結合溝與每一主鏈構象的對接結果產生一個大的數據集合。該數據集合還包括所有可能的胺基酸在給定位置處最好的側鏈構象。肽側鏈(最適構象中)和MHC蛋白之間的原子間距離也存儲於本數據集合中。通過將來自目的蛋白的受試肽側鏈序列加入到所有主鏈中，然後檢索上述數據集合尋找最適側鏈構象並計算對於每個主鏈的「肽分值」，可以分析來自目的蛋白的受試肽。選擇分值最高的肽用於顯示，並且對於每個可獲得的MHC模建結構均重複該過程。
這種算法已經用於全長CPG2蛋白序列的分析。分析鑑定出多條13mer肽序列，鑑於這些肽序列是預測的一種或多種同種異型的MHCII類配體，所以它們是潛在的T-細胞表位。這些肽示於表1，其中肽序列是用單字母代碼表示的。
實施例2使用合成肽和幼稚人PBMC體外增殖測定法鑑定T-細胞表位。
MHC、肽和T細胞受體(TCR)的相互作用提供了T細胞識別的抗原特異性的結構基礎。T細胞增殖測定檢驗肽與MHC的結合和TCR對MHC/肽複合體的識別。本實施例的體外T細胞增殖測定包括刺激含有抗原呈遞細胞(APC)和T細胞的外周血單核細胞(PBMC)。用合成肽抗原進行體外刺激，在某些實驗中使用完整蛋白抗原。用3H-胸苷(3H-Thy)測量刺激的T細胞增殖並對洗滌的固定細胞進行閃爍計數估計摻入的3H-Thy的存在。
從國家血液部門(National Blood Service，Addenbrooks Hospital，Cambridge，UK)得到捐贈的細胞。從Amersham Pharmacia Biotech(Amersham，UK)得到菲可帕克(Ficoll-paque)。含有L-穀氨醯胺、50μg/ml鏈黴素、10μg/ml慶大黴素和0.1％人血清白蛋白的用於培養原代人淋巴細胞的無血清AIM V培養基得自Gibco-BRL(Paisley，UK)。合成肽得自Eurosequence(格羅寧根，荷蘭)和Babraham Technix(Cambridge，UK)。
對血沉棕黃層輕微離心從血漿和血小板中分離出紅血球和白血球。除去並扔掉頂層部分(含有血漿和血小板)。在磷酸鹽緩衝液(PBS)中1∶1稀釋紅血球和白血球並鋪在15ml菲可帕克(Amersham Pharmacia，AmershamUK)上。根據生產商推薦的條件進行離心並從血清+PBS/菲可帕克界面收穫PBMC。用PBS(1∶1)混合PBMC並通過離心收集。除去並扔掉上清液，將PBMC沉澱重新懸浮在50ml PBS中。通過離心再次沉澱細胞並拋棄PBS上清液。用50ml AIM V培養基重新懸浮細胞並在此時計數並用錐蟲藍染料排除估計存活率。再次離心收集細胞並拋棄上清液。細胞重新懸浮以低溫保藏，密度為3×107/ml。保藏培養基為90％(v/v)熱失活的AB人血清(Sigma，Poole，UK)和10％(v/v)DMSO(Sigma，Poole，UK)。將細胞轉移到可調節冰凍容器(Sigma)並且在轉移到液氮以長期保存前將其置於-70℃過夜。當需要使用時，在37℃水浴中快速解凍然後轉移到10ml預熱的AIMV培養基。
利用市售的試劑系統(Dynal，Wirral，英國)測定所有PBMC樣本的組織類型。測定依照供應商所推薦步驟、標準輔助試劑和瓊脂糖電泳系統進行。選擇用於CPG2表位分析的20個供體PBMC樣本系列的組織類型鑑定於表6(見下)，並且選擇用於提供廣譜的同種異型。
表6供體系列的組織類型
在平底96孔平底板(PBMC密度為2×105PBMC每孔)中用蛋白和肽抗原刺激PBMC。在37℃下將PBMC孵育7天後用3H-Thy(Amersham-Pharmacia，Amersham，UK)脈衝。對於本研究，製備了涵蓋全部CPG2序列並含有附加的C-末端6-His標籤的合成肽(15mer)。每條肽與序列上連續的肽彼此互相重疊12個殘基，即每條肽比相鄰的肽在序列上延伸3個殘基。肽序列和標識編號示於圖1。每條肽都分別用從20個天然供體分離的PBMC進行篩選。兩條以前已經表明是免疫原性的對照肽C32(PKYVKQNTLKLAT)和C49(KVVDQIKKISKPVQH)，以及一種有效的非記憶抗原KLH被用於每個供體測定。將肽溶解於DMSO中使其終濃度為10mM，然後將這些貯存液在AIM V培養基中稀釋到原來的1/500(終濃度20μM)。向平底96孔板中加入肽，使100μl體系中肽的終濃度為2和10μM。通過錐蟲藍染料排除估計解凍的PBMC的存活率。然後將細胞重新懸浮(密度為2×106個細胞/ml)，向每個含有肽的孔中移入100μl(2×105個PBMC/孔)。在每個肽濃度下測定一式三份的孔培養物。在5％CO2、37℃的潮溼空氣中孵育平板7天。用1μCi3H-Thy/孔的脈衝細胞18-21小時後收穫到過濾墊上。用WaHac微量培養板β頂層平板計數器(Perkin Elmer)測定CPM值。結果表達為刺激指數(SI)，其中SI＝受試肽的CPM/未處理對照的CPM。
使用幼稚T細胞增殖測定法對CPG2序列中T細胞表位進行繪圖，鑑定了幾個免疫原性區。在個體的供體中具有顯著刺激指數的肽列於圖1。幼稚T-細胞增殖測定的結果能夠用於編輯CPG2蛋白的表位圖。一般而言，在此類表位圖的編輯中，SI＞1.95被視為陽性反應。
實施例3CPG2基因的產生CPG2原來的序列來自假單胞菌屬RS-16菌株的基因(基因庫登錄號AE002078)。390個胺基酸的蛋白質序列經反向翻譯後獲得了一條含1170個核苷酸的DNA序列。反向翻譯是利用商業化軟體(DNAstar，麥迪遜，威斯康辛州，美國)進行的，並且序列編輯基於大腸桿菌(E.coli)最常用的密碼子。該序列被用於設計一組24個合成的寡核苷酸。寡核苷酸的長度範圍在50-83個核苷酸之間，並且經設計含有長約19-25個核苷酸的重疊末端。所設計的基因在5′末端含有Asc I位點而在3′末端含有Sac I位點，使其能夠克隆進質粒載體。這些寡核苷酸列於表7。
表7合成的寡核苷酸序列
基因通過聚合酶鏈反應(PCR)組裝。搜集4種不同的PCR混合物(A、B、C和D)，用於形成下面鑑定的特性不同的系列寡核苷酸。在所有情況下，每個混合物中驅動反應的引物均以高濃度存在(50pmol)，並且在下面用下劃線表明混合物A)OL549+OL550+OL551+OL552混合物B)OL553+OL554+OL555+OL556+OL557+OL558混合物C)OL559+OL560+OL561+OL562+OL563+OL564混合物D)OL565+OL566+OL567+OL568+OL569+OL570利用上述反應中純化的產物，並且通過兩側引物OL571和OL572導入克隆位點，通過連接反應，形成了完整的CPG2基因。使用高保真聚合酶(Promega，南安普敦，英國)和隨酶提供的緩衝液進行PCR反應。用熱循環儀進行循環反應，運行程序詳述於下PCR循環條件階段 步驟 溫度(℃)時間(秒)循環數1 1 94 120 12 1 94 15 102 2 45-60(梯度) 60 102 3 72 45 103 1 94 15 253 2 60 30 253 3 72 45 254 1 72 420 14 2 4 保持在4℃ 1組裝後的CPG2基因被亞克隆入pGEM，並通過測序分析確保序列的正確性。為了測試CPG2的活性，將含有CPG2基因的細胞鋪到含0.1％葉酸的LB瓊脂平板上(葉酸溶於1M NaOH並配成10％貯存液)。然後將其在37℃孵育，通過黃色暈環鑑定含有CPG2活性的菌落。暈環是當葉酸被水解時，所形成的蝶酸被沉澱。
實施例4
CPG2基因的定點誘變所克隆的活性CPG2基因可用作研發基因突變體的模板，研發基因突變體使用QuickChangeTM定點突變試劑盒(Stratagene，LaJolla，加利福尼亞)。使用高保真耐熱聚合酶延伸成對的寡核苷酸引物，引物序列與載體的反鏈互補並含有預期的突變。引物的摻入導致形成含有交錯切口的突變載體。用核酸內切酶DpnI消化親本DNA，其中DpnI對甲基化的和半甲基化的DNA具有特異性，然後將含有預期突變的切口載體DNA轉化入感受態大腸桿菌細胞。使用了十六對設計後的寡核苷酸引物以達到在每條模板中導入點突變。寡核苷酸序列示於表8。
表8用於將突變導入CPG2模板基因的寡核苷酸引物。列出了序列、長度和導入的突變。
實施例5重組CPG2的表達與純化利用編碼區外側的限制性位點AscI/SacI，將CPG2基因突變體克隆進表達載體。用連接混合物轉化大腸桿菌細胞。在含有50-100μg/ml氨苄青黴素的LB平板上，選擇幾個氨苄青黴素抗性克隆。分析這幾個克隆中是否存在重組的插入片段及其插入方向，並且確保其與His-標籤在同一讀碼框內。證明了正確的方向之後，將細胞培養於37℃，誘導表達並通過離心收穫細胞。用SDS-PAGE凝膠電泳分析裂解後的細胞樣本並用考馬斯亮藍染色以證實表達情況。為了後續的重組蛋白質的純化，表達被擴大至50ml細胞培養物。
使用ProBondTM純化系統(Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞)，按照供應商推薦的步驟純化具6×His標籤的CPG2蛋白。簡而言之，通過離心從50ml培養物中收穫細胞，重懸於結合緩衝液並裂解細胞。輕輕振蕩60分鐘，使裂解液與純化柱樹脂結合。洗滌樹脂並用洗脫緩衝液洗脫重組蛋白。用如前所述SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色分析樣本。用分光光度測定法檢測純化的蛋白質濃度。
實施例6使用人PBMC體外增殖測定法證明經修飾的CPG2蛋白免疫原性潛能降低根據實施例3-5中的方法製備經修飾的蛋白質。所述經修飾的蛋白質包含來自野生型的多處替代。陽性對照蛋白質是野生型CPG2。對於T細胞增殖測定法，在2ml培養物(24孔板)中，用未修飾的和經修飾的抗體孵育取自健康供體的4×106PBMC(每孔)。用5和50μg/ml經修飾的和未修飾的CPG2處理每份供體培養物。此外，設置未處理的對照培養物，使刺激指數能夠被檢測。在第5、6、7和8天時，輕輕振蕩每份培養物，並且取出50μl樣本，平行取3份，用於增殖指數的測定。50μl樣本等份分別被轉移到U-形底96孔板的3個孔中。在96孔板的每個孔中加入新鮮的AIM V培養基(130μl)。用稀釋於總體積20μl AIM V培養基中的lμCi[3H]胸苷脈衝(處理18-21小時)細胞。每份培養物總體積200μl。使用β-板讀數儀收集CPM值並且按照實施例2的方法測定每個時間點的刺激指數。
每個時間點和處理的SI被製成曲線。在反應性供體中，用野生型CPG2處理引起了顯著的增殖反應，並在7天時達到峰值。在同一供體中，用本發明的經修飾CPG2組合物處理沒有產生顯著的增殖反應。這些結果表明經修飾的CPG2蛋白免疫原性潛能降低。來自於反應性供體#1和#16的曲線提供於圖2。
權利要求
1.經修飾的細菌羧肽酶G2(CPG2)，當其在體內應用時基本上無免疫原性或免疫原性低於任何具有基本相同的生物學特異性但未經修飾的CPG2，並且其含有與未經修飾的親本酶相比有所改變的特定胺基酸殘基，其中所述改變引起一個或多個T-細胞表位序列的減少或去除，其中所述T-細胞表位序列在親本酶中為MHC II類結合配體並刺激T-細胞。
2.根據權利要求1所述的經修飾CPG2分子，其中所述改變在以下各串來自CPG2野生型序列的連續胺基酸殘基中的一個或多個位點處進行A.＝VGKIKGRGGKNLLLMSHMDTVYLKGILAK；B.＝KAYGPGIADDKGGNAVILHTLKLLKEYG；C.＝LFNTDEEKGSFGSRDLIQEEA；D.＝KLADYVLSFEPTSAGDEKLSLGTSG；E.＝VNITGKASHAGAAPELGVNALVEASDL；F.＝KAKNLRFNWTIAKAGNVSNIIPASATLNAD；G.＝ADVKVIVTRGRPAFNAGEGGKKLVDKA；H.＝KKLVDKAVAYYKEAGG；I.＝YKEAGGTLGVEERTGGG；J.＝TDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYK.＝LEKLVNIETGTGDAE。
3.根據權利要求1所述的經修飾CPG2分子，其中所述T-細胞表位序列是13mer或15mer肽，並且是選自表1或表2中的任一序列。
4.根據權利要求1-3中任意一項所述的經修飾CPG2分子，其中所述改變是1-9個胺基酸殘基的替代。
5.權利要求3的經修飾CPG2分子，其中所述替代選自表4或表5中的任意一種替代。
6.根據權利要求1-5中任意一項所述的經修飾CPG2分子，其還包含一個或多個胺基酸殘基的改變，其中所述改變用於恢復該分子的生物學活性。
7.具有細菌羧肽酶G2(CPG2)生物學活性和以下胺基酸序列的分子X0QKRDNVLFQAATDEQPAVIKTLEKLVNIETGTGDAEGIAAAGNFLEAELKNLGFTVTRSKSAGLVVGDNIVGKX1KGRGGKNLX2LX3SHMDTVYX4KGILAKAPFRVEGDKAX5GPGX6ADDKGGNAX7IX8HTX9X10X11X12KEYGVRDYGTITVX13FNTDEEKGSFGSRDLX14QEEAKLADYX15X16SX17EPTSAGDEKX18SLGTSGIAYVQVNITGKASHAGAAPEX19GX20NAX21X22EASDLVLRTMNIDDKAKNX23RFNX24TX25AKAGX26X27SX28X29X30PASATX31NADVRYARNEDFDAAMKTLEERAQQKKLPEADX32KX33IVTRGRPAFNAGEGGKX34X35X36DKAX37AX38X39KEAGGTLGVEERTGGGTDAAYAALSGKPVIESLGLPGFGYHSDKAEYVDISAIPRRLYMAARLIMDLGAGK，其中X0任選地為靶向部分，如抗體結構域；且X1為I，T；X2為L，A；X3為M，K；X4為L，I；X5為Y，T；X6為I，A；X7為V，A；X8為L，A；X9為L，T，A；X10為K，T；X11為L，M，A；X12為L，T，A；X13為L，G，T；X14為I，T，A；X15為V，A；X16為L，T，G；X17為F，A；X18為L，A；X19為L，A；X20為V，A；X21為L，A；X22為V，T，A；X23為L，A；X24為W，A；H；X25為I，A；X26為N，T，A；X27為V，T；X28為N，T，A；X29為I，T，A；X30為I，T，A；X31為L，T，A，I；X32為V，A；X33為V，A；X34為K，T；X35為L，A；X36為V，A；X37為V，S，T，A；X38為Y，T，A；X39為Y，S，T，A；且不包括同時為以下胺基酸殘基的情況X1＝I，X2＝L，X3＝M，X4＝L，X5＝Y，X6＝I，X7＝V，X8＝L，X9＝L，X10＝K，X11＝L，X12＝L，X13＝L，X14＝I，X15＝V，X16＝L，X17＝F，X18＝L，X19＝L，X20＝V，X21＝L，X22＝V，X23＝L，X24＝W，X25＝L，X26＝N，X27＝V，X28＝N，X29＝I，X30＝I，X31＝L，X32＝V，X33＝V，X34＝K，X35＝L，X36＝V，X37＝V，X38＝Y且X39＝Y。
8.根據權利要求1-7中任意一項所述的經修飾CPG2酶，其中當作為完整蛋白質測試時，在誘導人T-細胞細胞增殖的生物學測定中呈現的刺激指數小於利用來自同一供體的細胞進行平行測試時的親本酶，其中所述指數表示為用蛋白質刺激後細胞增殖的分值並除以與不用蛋白質刺激的對照細胞的細胞增殖分值，並且其中細胞增殖是用任何適宜的方法測定的。
9.編碼如權利要求1-8中任意一項所定義的CPG2分子的DNA序列。
10.藥物組合物，其包含上述權利要求中任意一項所述的經修飾CPG2分子，並任選地還包含可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
11.肽分子，其由9-15個連續的胺基酸殘基組成，具有潛在的MHCII類結合活性並且由未經修飾的CPG2酶的一級序列產生，此處所述肽分子在細胞增殖的生物學測定中刺激指數至少為1.8至2，其中所述指數表示為用肽刺激後細胞增殖的分值並除以不用肽刺激的對照細胞的細胞增殖分值，並且其中細胞增殖是用任何適宜的方法測定的。
12.根據權利要求11所述的肽分子，其中所述刺激指數大於2。
13.權利要求11或12的肽分子，其選自表1或表2中所描述的連續T-細胞表位序列。
14.對衍生自權利要求11-13中任意一項所述的肽分子通過胺基酸替代而得到的經修飾肽分子，其潛在的MHC II類結合活性降低或喪失，這通過刺激指數小於2表示，其中所述指數表示為用肽刺激後細胞增殖的分值並除以不用肽刺激的對照細胞的細胞增殖分值，並且其中細胞增殖是用任何適宜的方法測定的。
15.權利要求14的經修飾肽分子，其中所述刺激指數小於2。
16.根據權利要求11-15中任意一項所述肽的用途，用於製備體內使用時基本上無免疫原性或比任一未經修飾的親本酶的免疫原性要低的經修飾CPG2酶。
17.根據權利要求11-13中任意一項所述肽的用途，用於接種患者以降低體內對CPG2的免疫原性。
18.編碼權利要求11-15中任意一項所述肽的DNA序列。
19.藥物組合物，其包含權利要求11-15中任意一項所述的肽，任選地還包含可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。
全文摘要
本發明尤其涉及對細菌羧肽酶G2(CPG2)的修飾，該修飾使得體內使用時這些CPG2蛋白基本上無免疫原性，或比任一未經修飾的相應蛋白的免疫原性低。本發明也涉及來源於所述的非修飾蛋白質的T細胞表位肽，通過它們使產生免疫原性降低的經修飾CPG2變體成為可能。這些多肽特別適用於人類的治療用途。
文檔編號C07K7/00GK1592633SQ02823301
公開日2005年3月9日 申請日期2002年11月27日 優先權日2001年11月29日
發明者K·海倫多恩, M·貝克, S·威廉斯, F·J·卡爾 申請人:默克專利有限公司